細胞内Ca測定 ^{2 +変更：従来の蛍光測定、停止フロー蛍光法、フローサイトメトリーおよび単一細胞イメージング}

この手順の全体的な目標は、蛍光色素を使用してヒト精子の細胞内カルシウム変動を測定することです。これは、最初にスイムアップ法で精子サンプルを調製し、必要に応じて能力化を促進することによって達成されます。2番目のステップは、精子にカルシウム蛍光色素をロードすることです。

次に、従来の蛍光測定法、停止したフロー蛍光法、フローサイトメトリー、またはシングルセルイメージングを使用して、実験を行い、カルシウム測定値を記録します。最終的に、結果を分析して、プロゲステロンによって引き起こされた細胞内カルシウム濃度の変化、または容量獲得プロセス中に変化を特定します。放射能を含むような既存の方法に対するこの技術の主な利点は、これが非常に敏感な手順であることです。

安全で簡単に実行できます。この方法は、細胞内カルシウムを誘導する化合物の同定、高い空間的および時間的分解能の増加、シーメンサンプル中のさまざまな細胞亜集団の同定など、SPRカルシウムシグナル伝達分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。例えば、フローサイトメトリー技術を使用することの意味は、男性の色域の生理学的状態の解析を通じて、不妊症の診断にまで及びます。

この方法は、ヒト精子のカルシウム動員の研究に洞察を与えることができますが、他の種の雄の色域や、ニューロンや筋肉細胞などの異なるタイプの細胞など、他のタイプの細胞にも適用できます。一般に、この方法を使用する個人は、精子の取り扱いが容易ではなく、実験を通じて生存細胞と運動細胞を得るために適切な条件を維持することが重要であるため、苦労します。これらの手法は、異なる分野を用いて戦略を組み合わせることにより、活用しました。

サンプルの調製と取り扱い、および化合物の添加は、手順中に精子細胞が損傷を受ける可能性があり、化合物のエディション中に応答のアーティファクトが得られる可能性があるため、学習が難しいため、この方法の視覚的なデモンストレーションは重要です。精子サンプルを調製するには、1ミリリットルのハムF 10培地を各500マイクロリットルの液化精液の上に慎重に重ねる必要があります。Eloqua、マイクロピペットの先端でチューブの壁に触れ、サンプルの上の培地を静かに分注します。

サンプル層と培地層が混ざらないように、ゆっくりと行うことが重要です。この培地には、2ミリモルの塩化カルシウムと1ミリリットルあたり5ミリグラムのBSAが添加されています。in vitroでの静電容量化を促進するには、チューブを約30度の角度に慎重に傾けます。

これにより、2つの液体間の表面積が増加し、インキュベーション中にサンプルから培地への精子細胞の変位または泳ぎ上がりが促進されます。次に、リーン試験管を摂氏37度、二酸化炭素5%のインキュベーター内に置きます。95%空気は1時間後に1時間。

マイクロピペットを使用して、モチル精子を含むハムF 10培地の上部700マイクロリットルを各チューブから慎重に取り出します。収集したすべてのサンプルを1本のきれいなガラス管にプールし、気泡の形成を防ぎます。10マイクロリットルのプールされたサンプルを黄斑計数チャンバーベースの光学板ガラスに置き、カバーガラスを置きます。

チャンバー内で気泡が形成されると、細胞数が不正確になるため、避けてください。20倍対物レンズを装備した複合顕微鏡で観察します。黄斑計数室のカバーガラスには、100個の小さな正方形で構成される大きな正方形があります。

10個の正方形の任意のストリップのセルを数えます。この数値は、ミリリットルあたり数百万個の細胞単位の細胞濃度を表します。さらに2つの10個の正方形のストリップでカウントを繰り返し、3つのカウントの平均を計算して、蛍光色素でセルをロードします。

1.5ミリリットルのフージチューブに、精子懸濁液の必要量を十分な1ミリモルのインフルエンザoh 3:00 AMストック溶液と組み合わせ、2マイクロモルのインフルエンザoh 3:00 AMの最終濃度を得る37°Cで30分間インキュベートし、750Gでチューブを5分間光遠心分離機から保護します。ペレットではなく雲が形成されていることは、細胞が良好な状態にあることを示しており、上清を吸引して廃棄し、ペレットを適切な量のヒト精子培地またはHSMに再懸濁します。この実験を開始するには、平底ガラス管内で、570マイクロリットルのHSMと30マイクロリットルの精子細胞懸濁液を、以前にインフルエンザoh 3:00 AMにロードし、HSMに再懸濁して、1ミリリットルあたり10〜8番目の細胞を1回得る。

ガラス管の内側に磁気攪拌棒を配置し、37°Cに予熱した分光器の読み取りチャンバーにチューブを挿入します。サンプルは、取得時間中ずっと攪拌する必要があります。oliソフトウェアを使用して実験を開始し、300秒間に0.5ヘルツの周波数で蛍光値を取得します。

基礎蛍光を30秒間取得した後、Hamilton Microシリンジを使用して、この場合はマイクロモルプロゲステロンの適切な量の試験化合物を100秒で注入します。20マイクロモルイオンマイシンをポジティブコントロールとして、最大蛍光値を得るためのもの。この実験では、細胞内のカルシウム変化を高い時間分解能で測定します。

狂犬病速度論光学系と組み合わせた SFM 20 ストップフローミキサーを使用して、装置シリンジの 1 つに 1 ミリリットルのインフルエンザを充填します。午前 3:00 に精子細胞をロードし、2 番目のシリンジに試験対象の化合物 1 ミリリットルを充填します。HSM に溶解した 20 マイクロモルのプロゲステロン。

この例では、液体をシリンジに引き込む際に気泡の形成を防ぐことが重要です。両方の計器用ピストンをシリンジプランジャーの先端に触れるまで持ち上げます。この場合、合計サンプリング時間を50秒に、周波数を10ミリ秒に設定して、セルの損傷を最小限に抑えるために、流量を測定可能な応答トリガーを提供する最小値に設定します。

試薬の混合、生の蛍光とタイムの微量がコンピューター画面に表示されます。この手順を繰り返し、フローサイトメトリーの前に、プロゲステロンをネガティブコントロールとしてHSMに置き換え、ポジティブコントロールとして10マイクロモルイオンマイシンに置き換えてください。試験する各条件下で、サイトメーターチューブあたり500マイクロリットルの細胞懸濁液を配置して、実験サンプルを調製します。

機器ソフトウェアを使用して実験を設定します。まず、新しいフォルダー、実験用試料、チューブの数を作成します。次に、インフルエンザO 3:00 AMの適切なサイトメーター設定を選択します。フルオレセインイソチオシアネートフィルターとヨウ化プロピジウムフィルターを使用してください。

未染色のコントロールチューブ1および2をサイトメーターに流します。前方散乱光と側方散乱データを収集して、しきい値設定が適切であることを確認し、セルからデブリを区別するための対応するゲートを作成します。実験用チューブを運転し、サンプルあたり 10 、 000 イベントから蛍光データを収集します。

結局。分析に使用可能なソフトウェアにすべてのデータをエクスポートします。この手順に必要な丸いカバースリップを準備するには、各カバースリップの中央に5マイクロリットルのポリLリジン溶液を塗布します。

使用前に少なくとも1時間放置し、処理された領域を水ですすいでください。これにより、余分なポリリジンが除去され、精子細胞が頭からカバースリップに付着するようになりますが、鞭毛はまだ動くことができます。記録チャンバー内でカバースリップを組み立てます。

10マイクロリットルのインフルエンザoh 3:00 AMにロードされた細胞を、1ミリリットルあたり10〜7番目の細胞の濃度で配置します。カバースリップの中央に。細胞を200マイクロリットルのプレウォームHSMで覆います。

チャンバーを37°Cに予熱した顕微鏡のステージに置き、位相コントラストを使用して細胞を観察します。イメージングに適した細胞密度の領域を選択します。細胞が多すぎると、シグナルが重複するため、解析が困難になります。

細胞は頭でカバースリップにしっかりと付着している必要がありますが、べん毛の動きを示し、生存率を確認します。時系列画像取得ソフトウェアを起動して実験を開始します。通常、1 秒あたり 4 つの画像が必要で、画像あたり 2 ミリ秒の照明が必要です。

ライブモードで蛍光画像を取得します。フォーカスと明るさを調整します。この場合は、マイクロピペットを使用して試験化合物のプロゲステロンを慎重に滴下し、必要に応じて画像取得を続けます。

20 マイクロモルのイオンマイシンで最大の蛍光を得るため、5 ミリモルの塩化マンガンで最小の蛍光を得るため、同じチャンバーに 2 つの連続した制御添加を行います。IQソフトウェアを使用してオフラインで画像解析を実行します。

各セルまたはセルの一部の周囲に関心領域または ROI を描画します。さらに、ソフトウェアによる自動バックグラウンド減算のためにセルフリー領域を選択します。次に、ROIごとに時間蛍光強度シリーズを取得し、これらのデータをMicrosoft Excelにエクスポートしてさらに分析することができます。

プロゲステロンは既知の先体反応誘導物質の1つであり、予想通り、従来の蛍光測定法で測定されたヒト精子の一時的な細胞内カルシウム濃度の増加を引き起こします。赤色の蛍光微量は、ネガティブコントロールHSMを添加した4マイクロモルのプロゲステロンを添加したことにより生じた細胞内カルシウム濃度の変化を示しており、青色の蛍光微量がポジティブコントロールとして示しているように、細胞内カルシウム濃度レベルに変化は生じませんでした。10マイクロモルのイオンマイシンによって誘発される変化は、各トレースについて示されています。

このカルシウムイオノフォアを添加すると、RA細胞のカルシウム濃度が最大で上昇し、基礎レベルには戻りません。この棒グラフは、各条件からの蛍光デルタFの平均変化を示しており、Nは3に等しく、アスタリスクはコントロールと比較して0.001未満のP値を示す標準誤差をプラスまたはマイナスにしています。プロゲステロンによる細胞内カルシウム濃度の増加は、ストップフロー蛍光法によりより高い時間分解能で測定され、代表的な結果を以下に示します。

原生の痕跡がパネルAに示されているが、赤線で表されるプロゲステロンと青線で表されるイオンマイシンの両方が、細胞内カルシウム濃度の急激な上昇を引き起こした。緑色のトレースは、細胞をHSMと混合したネガティブコントロールです。パネルBは、プロゲステロンまたはイオンマイシンで誘導されたシグナルについて、対応する生シグナルから制御シグナルを差し引いたものの補正されたトレースを示しています。

プロゲステロンは、非常に速く、一過性の細胞内カルシウム濃度の増加を引き起こし、インダクターの添加後2.7秒で最大蛍光値が発生しました。一方、CINは50秒間を通じて細胞内カルシウム濃度を急速かつ持続的に増加させました。パネル B の挿入図は、各応答の最初の 500 ミリ秒の拡大ビューを示しています。

プロゲステロンによる細胞内カルシウム濃度の増加に遅延がないことは、プロゲステロンが中間シグナル伝達なしにカルシウムチャネル猫拍車を直接活性化することを示唆する以前の報告と一致しています。細胞内カルシウム濃度は、フローサイトメトリーを使用して、容量のあるヒト精子と容量のないヒト精子でも測定されました。これらの代表的な前方散布図と側面散布図。

容量のあるセルは青で、容量のないセルは赤です。選択したゲートは青い線で示され、その領域内のセルのみがさらなる解析に使用されました。パネルBは、未染色の精子からのFitzyチャネルの蛍光ヒストグラムを示し、パネルDは、パネルDで観察されたように、インフルエンザoh 3:00 AM染色精子からのFZチャネルの蛍光ヒストグラムを示しています。

パネルCは未染色細胞由来のPIチャネルの蛍光ヒストグラムを示し、パネルEは死細胞由来のPIチャネルの蛍光ヒストグラムを示しています。個々の細胞の蛍光値は、ここに示す2次元蛍光ドットプロットで観察できます。未染色の細胞およびインフルエンザoh 3:00 AMとpiで二重染色された細胞の場合、各象限に記録された細胞の割合は赤い数字で示されています。

重要なことは、死細胞から生じるシグナルを排除できることです。最後に、プロゲステロンによる細胞内カルシウム濃度の変化を、これらの代表的な疑似カラー画像をイメージングすることにより、単一の精子細胞で測定しました。これは、プロゲステロン、CINおよび塩化マンガンの添加開始時と添加後に視覚化された細胞を示しています。プロゲステロンの添加は、精子頭部とラムマンガンクロリドの両方で細胞内カルシウム濃度の増加を引き起こし、インフルエンザを減少させるために使用されます。

Oh 3:00 AM 実験から得られた9つの個々の細胞の代表的な正規化蛍光微量を消光することにより蛍光を発する様子をこの図に示します。集団実験で観察されたように、シングルセル解析では、プロゲステロンとイオンマイシンのそれぞれに一過性および持続的な増加が明らかになりました。このテクニックを習得すると、適切に実行すれば3〜4時間で完了します。

この手順を試行する際は、細胞の生存率を確認し、この手順に従って適切な制御を実行することを忘れないでください。電気生理学のような他の方法は、カルシウムの増加に関与する特定のイオンチャネルの同定などの追加の質問に答えるために実行することができます proppeソリューションとシミュレーションプロトコルを使用して その開発後。この技術は、細胞生理学の分野の研究者が、高い空間的および時間的分解能で生細胞のカルシウム動態を調査する道を開きました。

このビデオを見た後、答えたい特定の質問に応じて、あらゆるタイプの細胞で蛍光dyを使用して細胞内カルシウムの増加を測定するための最も適切な手法を選択する方法を十分に理解しているはずです。人間のsiemenサンプルを扱うことは危険であり、証明された健康のドナーの使用などの予防措置が役立つ可能性があることを忘れないでください。この手順を実行するときは、手順中のラテックスグローブの使用と、溶液と材料の適切な廃棄を常に行う必要があります。