細胞内Ca測定

本手順の全般的な目的は、蛍光色素を用いてヒト精子内の細胞内カルシウム変動を測定することです。まず、スイムアップ法により精子試料を調製し、必要に応じてキャパシテーションを促進させます。次に、精子にカルシウム蛍光色素をロードさせます。

次に、従来の蛍光光度法、ストップトフロー蛍光光度法、フローサイトメトリー、または単一細胞イメージングを用いて実験を行い、カルシウム測定値を記録します。最終的に、これらの結果を解析し、プロゲステロンによって、あるいは受精能獲得プロセス中に誘発される細胞内カルシウム濃度の変化を判定します。放射能を用いるなどの既存の手法に対するこの手法の主な利点は、非常に感度の高い手順であることです。

本手法は安全かつ容易に実施可能です。この方法は、高い空間分解能および時間分解能での細胞内カルシウム上昇を誘導する化合物の同定や、精液試料中の異なる細胞サブポピュレーションの同定など、SPRカルシウムシグナリング分野における重要な課題の解決に寄与します。例えば、フローサイトメトリー技術を利用することによる意義は、男性配偶子の生理的状態の解析を通じた不妊問題の診断にまで及びます。

この手法はヒト精子のカルシウム動態の研究に知見を提供できるだけでなく、他種の雄性配偶子や、ニューロンや筋細胞などの異なる種類の細胞にも適用可能です。一般的に、この手法を用いる際、精子のハンドリングは容易ではなく、実験を通して生存し運動性のある細胞を維持するために適切な条件を保つことが重要であるため、困難を伴う場合があります。私たちは、異なる分野の戦略を組み合わせることで、これらの技術の導入を実現しました。

精子細胞は操作中に損傷しやすく、また化合物の添加時に応答にアーチファクトが生じる可能性があるため、サンプルの調製と取り扱い、および化合物の添加方法を習得することは困難です。そのため、本手法の視覚的なデモンストレーションは重要です。精子サンプルの調製には、500 µLの液状精液に、1 mLのhams F 10 mediumを注意深く重層させる必要があります。マイクロピペットのチップでチューブの壁面に触れ、サンプルの上に緩やかに medium を分注してください。

サンプル層と培地層が混ざり合わないよう、ゆっくりと行うことが重要です。培地には 2 mM の塩化カルシウムと 5 mg/mL の BSA を添加します。in vitro での受精能獲得を促進するため、チューブを約 30 度の角度に慎重に傾けます。

これにより、2つの液層間の表面積が増加し、インキュベーション中にサンプルから培地への精子の置換または遊泳が促進されます。次に、試験管を37 °C、5% carbon dioxide、95% airのインキュベーター内に配置し、1時間静置します。

マイクロピペットを用いて、運動精子を含む各チューブの上層700 µLのhams F 10培地を慎重に回収します。気泡が混入しないように注意しながら、回収したすべてのサンプルを1本の清潔なガラスチューブにまとめます。まとめ合わせたサンプルの10 µLをマクラーcounting chamberベースの光学平坦ガラス上に滴下し、カバーガラスを被せます。

細胞数のカウントに誤差が生じるため、チャンバー内に気泡が入らないように注意してください。20倍の対物レンズを備えた複合顕微鏡で観察します。マクラー細胞計数器のカバーガラスには、100個の小さな正方形で構成される大きな正方形があります。

任意の10マスのストリップ内の細胞数をカウントします。この数値が、1 mLあたりの細胞数（百万個単位）の細胞濃度を表します。さらに2箇所の10マスストリップでカウントを繰り返し、これら3回のカウントの平均値を算出して、蛍光色素による細胞の染色を行います。

1.5 mLの遠心チューブに、必要な量の精子懸濁液と、最終濃度が2 µMとなる十分量の1 mM Fluo-3 AMストック溶液を加えて混合します。37 °Cで、遮光した状態で30分間インキュベートし、チューブを750 ×gで5分間遠心分離します。ペレットではなく雲状の凝集体が形成されていれば、細胞の状態は良好であることを示しています。上清を吸引して除去し、適切な量のヒト精子培地（HSM）でペレットを再懸濁します。本実験を開始するには、平底ガラスチューブに、570 µLのHSMと、あらかじめFluo-3 AMをロードしHSMで再懸濁して1 × 10⁸ cells/mLとした精子細胞懸濁液30 µLを加えて混合します。

ガラス管の中にマグネチックスターバーを入れ、37 °Cに予熱した分光光度計の測定室に管を挿入します。サンプルの攪拌は、測定時間中ずっと継続させる必要があります。oliソフトウェアを使用して実験を開始し、300秒間にわたって0.5 Hzの頻度で蛍光値の取得を行います。

30秒間基底蛍光を測定した後、Hamiltonマイクロシリンジを用いて、100秒時点で適切な量の試験化合物（本ケースではマイクロモル濃度のprogesterone）を注入します。ポジティブコントロールとして20 $\mu$Mのionomycinを投与し、最大蛍光値を得ます。本実験では、細胞内カルシウム濃度の変化を高時間分解能で測定します。

ラピッドキネティクス光学系に接続されたSFM 20ストップトフローミキサーを用い、装置の一方のシリンジにflu. 3:00 AM負荷精子細胞を1 mL充填し、もう一方のシリンジに試験化合物であるHSMに溶解した20 µMのプロゲステロンを1 mL充填します。

この例では、シリンジに液体を吸い上げる際に気泡の形成を避けることが極めて重要です。両方のインストゥルメントピストンを、シリンジプランジャーの先端に接触するまで持ち上げます。細胞へのダメージを最小限に抑えるため、この場合の総サンプリング時間を50 secondsに、周波数を10 millisecondsに設定し、流量は測定可能な応答トリガーが得られる最小値に設定してください。

試薬を混合すると、時間の経過に伴う生蛍光のトレースがコンピュータ画面に表示されます。この手順を繰り返し、プロゲステロンを HSM（陰性対照）および 10 micromolar 転移マイシン（陽性対照）に置き換えて、フローサイトメトリーの前に実施します。テストする各条件について、サイトメーターチューブに細胞懸濁液を 500 microliters ずつ分注し、実験サンプルを調製します。

装置のソフトウェアを使用して実験を設定します。まず、新しいフォルダ、実験検体、およびチューブ数を設定します。次に、flu O 3:00 AMに適切なサイトメーター設定を選択します。フルオレセインイソチオシアネートおよびプロピジウムヨードのフィルターを使用してください。

染色していないコントロールチューブ1および2をサイトメーターで測定します。前方散乱光（FSC）および側方散乱光（SSC）のデータを収集し、しきい値の設定が適切であることを確認し、デブリと細胞を区別するための対応するゲートを作成します。次に実験用のチューブを測定し、サンプルあたり10,000イベントの蛍光データを収集します。

最後に、すべてのデータを解析可能なソフトウェアにエクスポートします。本手順に必要な円形カバーガラスを用意し、各カバーガラスの中央にpoly L lysine溶液を5 µL滴下します。

使用する少なくとも1時間前まで放置し、処理した領域を水で洗浄します。これにより、過剰なポリリジンが除去され、精子細胞の鞭毛が可動した状態で、頭部からカバーガラスに接着できるようになります。レコーディングチャンバー内でカバーガラスを組み立てます。

1 × 10⁷ cells/mLの濃度でFluo-3 AMをロードした細胞10 µLを、カバーガラスの中央に滴下します。その後、あらかじめ加温しておいた200 µLのHSMで細胞を覆います。

チャンバーを37 °Cに予熱した顕微鏡のステージ上に置き、位相差顕微鏡で細胞を観察します。イメージングに適した細胞密度の領域を選択してください。細胞が多すぎると、信号が重なり合うため解析が困難になります。

細胞は頭部でカバーガラスにしっかりと付着している必要がありますが、生存を確認するために鞭毛運動を示している必要があります。タイムラプス画像取得ソフトウェアを起動して、実験を開始してください。通常、1秒あたり4枚の画像が必要であり、1枚あたりの照射時間は2ミリ秒に設定します。

ライブモードで蛍光画像を取得します。フォーカスと輝度を調整してください。マイクロピペットを使用して、今回の試験化合物であるprogesteroneを慎重に滴下し、必要に応じて画像取得を継続します。

同一チャンバーに2回のコントロール添加を順次行います。最大蛍光を得るために20 µMのionomycinを、最小蛍光を得るために5 mMの塩化マンガンを添加します。IQソフトウェアを使用して、オフラインで画像解析を行います。

各細胞または細胞の一部を囲むように関心領域（ROI）を設定します。さらに、ソフトウェアによる自動背景減算を行うため、細胞のない領域を選択してください。これにより、各ROIについて時間的な蛍光強度シリーズが得られ、これらのデータはさらなる解析のためにMicrosoft Excelへエクスポートすることが可能です。

プロゲステロンは既知のアクロソーム反応誘発剤の一つであり、予測通り、従来の蛍光光度法で測定されるヒト精子の細胞内カルシウム濃度の一過性上昇を引き起こします。赤色の蛍光トレースは、4 µMのプロゲステロン添加によって誘発された細胞内カルシウム濃度の時間経過に伴う変化を示しています。陰性対照としてHSMを添加したところ、青色の蛍光トレースで示されるように、細胞内カルシウム濃度レベルに変化は見られませんでした。陽性対照として、10 µMのイオノマイシンによって誘発された変化が各トレースに示されています。

このカルシウムイオノフォアの添加により、RA細胞のカルシウム濃度は最大まで上昇し、基底レベルに戻ることはありません。この棒グラフは、各条件における蛍光変化量 delta F の平均値を示しており、エラーバーは標準誤差（N = 3）を表し、アスタリスクは対照群と比較して P 値が 0.001 未満であることを示しています。プロゲステロンによって誘導された細胞内カルシウム濃度の増加を、ストップトフロー蛍光光度法を用いてより高い時間分解能で測定し、その代表的な結果をここに示します。

パネルAに生のトレースを示す。赤線で示されるプロゲステロンと青線で示されるイオノマイシンは、いずれも細胞内カルシウム濃度の急速な上昇を引き起こした。緑色のトレースは、細胞をHSMと混合したネガティブコントロールである。パネルBは、プロゲステロンまたはイオノマイシンによって誘導された信号から、対応するコントロール信号を差し引いて得られた補正後のトレースを示している。

プロゲステロンは、誘導剤の添加から2.7秒後に最大蛍光値に達する、非常に速く一過性の細胞内カルシウム濃度上昇を引き起こした。一方、CINは、50秒間にわたって急速かつ持続的な細胞内カルシウム濃度上昇を引き起こした。パネルBの挿入図は、各応答の最初の500ミリ秒を拡大して示したものである。

プロゲステロン誘発性の細胞内カルシウム濃度上昇に遅延が見られないことは、プロゲステロンが中間シグナリングを介さずにカルシウムチャネルCatSperを直接活性化することを示唆した先行報告と一致しています。また、フローサイトメトリーを用いて、キャパシテーション済みおよび未処理のヒト精子における細胞内カルシウム濃度を測定しました。これらの代表的な前方散乱および側方散乱プロットに示します。

キャパシテーションした細胞は青色で、キャパシテーションしていない細胞は赤色で示されています。選択されたゲートは青い線で示されており、その領域内の細胞のみがさらなる解析に使用されました。パネルBは、染色していない精子のFitzyチャンネルにおける蛍光ヒストグラムを示しており、パネルDは、パネルDで観察されたflu oh 3:00 AMで染色した精子のFZチャンネルにおける蛍光ヒストグラムを示しています。青いトレースで示されるキャパシテーションした精子の蛍光値の分布は、赤いトレースで示されるキャパシテーションしていない精子と比較して、より高い値にシフトしています。

パネルCは、未染色の細胞におけるPIチャネルの蛍光ヒストグラムを示しており、パネルEは死細胞におけるPIチャネルの蛍光ヒストグラムを示しています。個々の細胞の蛍光値は、ここに示した2次元蛍光ドットプロットで確認できます。未染色細胞、およびFluo-3 AMとPIで二重染色した細胞について、各クアドラントに記録された細胞の割合を赤色の数字で示しています。

重要な点として、死細胞に由来するシグナルは除去することが可能です。最後に、プロゲステロンによって誘導される単一精子細胞内のカルシウム濃度変化をイメージングにより測定しました。これらの代表的な擬似カラー画像は、プロゲステロン、CIN、および塩化マンガンの添加開始時と添加後の細胞を示しています。プロゲステロンの添加は、精子の頭部とルマンの両方において細胞内カルシウム濃度の増加を引き起こします。塩化マンガンは蛍光を減少させるために使用されます。

図に、クエンチングによる蛍光測定において、実験に使用した9個の個々の細胞から得られた代表的な正規化蛍光トレースを示します。集団レベルの実験で観察されたのと同様に、単一細胞解析により、プロゲステロンでは一過性の増加が、イオノマイシンでは持続的な増加がそれぞれ認められました。この手法に習熟し、適切に実施すれば、3〜4時間で完了させることができます。

本手順を実施する際は、細胞の生存能を確認し、本手順に従って適切なコントロールを行うことが重要です。また、適切な溶液とシミュレーションプロトコルを開発した後、特定のイオンチャネルがカルシウム増加に関与しているかを特定するなど、さらなる疑問を解決するために電気生理学などの他の手法を用いることも可能です。この技術は、細胞生理学分野の研究者が、高い空間分解能および時間分解能で生細胞内のカルシウムダイナミクスを探索する道を切り拓きました。

このビデオを視聴することで、解決したい具体的な課題に応じて、あらゆる細胞タイプにおいて蛍光色素を用いて細胞内カルシウム濃度上昇を測定するための、最も適切な手法を選択する方法を十分に理解できるはずです。ヒト精液サンプルを取り扱う際は危険が伴う可能性があるため、健康状態が確認されたドナーの使用などの予防策を忘れないでください。また、本手順の実施中は、ラテックス手袋の使用、および溶液と材料の適切な廃棄を常に徹底してください。