Name: 細胞内Ca測定 2 +変更：従来の蛍光測定、停止フロー蛍光法、フローサイトメトリーおよび単一細胞イメージング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-24T12:00:00.000+00:00
Duration: 19 min 26 s
Description: 学ぶ蛍光測定法によるヒト精子の細胞内カルシウム変動測定。従来の蛍光測定、停止フロー蛍光法、フローサイトメトリー、単一細胞イメージングを用いて、プロゲステロンやカパシテーション誘発のカルシウム濃度変化を高感度に解析する手法です。

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著者は、技術支援のためにホセ·ルイス·デ·ラ·ベガ、エリカMelchy博士拓也西垣に感謝します。 Dirección一般デAsuntosデルパーソナルAcadémico/国立大学自治デ·メヒコ（CTへIN202212-3）;この作品はConsejoナシオナルデCiencia YTecnología（CONACyT·メキシコ）（CTに99333と128566）によってサポートされていました。

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<li>Lishko, P. V., Botchkina, I. L., Kirichok, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progesterone+activates+the+principal+Ca2%2B+channel+of+human+sperm%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Progesterone activates the principal Ca2+ channel of human sperm.</a> Nature. 471, 387-391 (2011).</li>
<li>Xia, J., Ren, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+BSA-induced+Ca2%2B+influx+during+sperm+capacitation+is+CATSPER+channel-dependent%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod.+Biol.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">The BSA-induced Ca2+ influx during sperm capacitation is CATSPER channel-dependent.</a> Reprod. Biol. Endocrinol. 7, 119(2009).</li>
<li>Galantino-Homer, H. L., Florman, H. M., Storey, B. T., Dobrinski, I., Kopf, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bovine+sperm+capacitation%3A+assessment+of+phosphodiesterase+activity+and+intracellular+alkalinization+on+capacitation-associated+protein+tyrosine+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Reprod.+Dev%22%5BJournal%5D)">Bovine sperm capacitation: assessment of phosphodiesterase activity and intracellular alkalinization on capacitation-associated protein tyrosine phosphorylation.</a> Mol. Reprod. Dev. 67, 487-500 (2004).</li>
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</ol>

我々は、開示することは何もありません。

細胞内シグナル伝達は、ほとんどの細胞の活動のために不可欠であり、Ca 2 +の受精で、その起源から、そのライフサイクルの終わりに、彼らの全体の寿命を通して、哺乳動物細胞に伴うユビキタスメッセンジャーです。別の刺激に応答して、[のCa 2 +] iの増加、発振と時空成文とともに減少、それに応じて、多様なプロセスが起動され、変調された又はCa 2 +でエンコードされたメッセージによって終了。細胞内Ca 2 +イオンは、このシグナル伝達プロセスの複雑なオーケストレーションに関与するようにダイナミクスは、精子の生理学に非常に重要である。例えばCa 2 +の知識は変動が解読Ca 2 +の関与チャンネル、異なるシグナル伝達カスケードにおけるそれらの特定の役割の分子アイデンティティを助けることができる。のCa 2 +感受性蛍光色素は、非常に特異的かつ高感度のCa 2 + Mを有効にすると、それらを研究するための強力なツールを構成する生細胞内の濃度変化を追跡するために使用すること...

のCa 2 +は、真核細胞内シグナル伝達経路の普遍的な二次メッセンジャーである。細胞内Ca 2 +（Ca 2 +のi）は興奮性と非興奮性細胞の両方で多くの基本的な生理的過程の調節に関与する。シグナル伝達事象中のセカンドメッセンジャーとしてのCa 2の重要性と普遍+は、セル内の情報の伝送における時空間汎用性に由来する。のCa 2 + のde novo又は細胞内で分解さ合成することはできないが、その細胞内濃度（[Ca 2 +] i）が連続的にバッファ、封鎖、区分化、および/ ​​またはカルシウム2を蓄積するさまざまな細胞機構を介して非常に厳格な限度内に維持される+。このイオンの濃度の変化は、セル1内に高度にローカライズされた地域で発生し、このような変動を解読すると、デを得るために不可欠であることができますEPERのシグナル伝達機構（1）の役割を理解すること、（2）それらの生理的重要性、および細胞シグナル伝達の（3）一般的なメカニズム。のCa 2 +を介するシグナル伝達は、精子生理学2において特に重要である。精子の運動性は、受精の成功のための最も重要な機能の一つであり、実際には、いくつかの精子の運動性の欠陥は不妊3-5を引き起こす可能性があります。のCa 2の重要性+鞭毛運動には長い間、6を認識されてきたが、どのようにのCa 2メカニズムは+鞭毛曲げ特定の形が完全に理解されていない制御します。 卵と融合する前に、精子は能、雌の管の内部の精子の住居に依存する複雑なプロセスを経る必要があります。能中、精子膜の脂質アーキテクチャおよび組織は、主に形質膜からコレステロール除去の結果として、変更される。さらに、いくつかのタンパク質はチロシン蛍光体であるylated 7。重要なことは、受精能の間に細胞内のpHの上昇液（i）との[Ca 2 +] iの 、膜電位はいくつかの種に含ま過分極でもある。能では、精子の集団（20〜40％）で行われのみ、そして、これらすべての細胞の変化に関与するメカニズムは、はるかに明確にしています。これは、一般的に生理的なインダクタにさらされたときに受精能の唯一の集団は先体反応（AR）を受けることが認められている。 ARはまた、（外側と内側の膜と特殊なオルガネラ）先体を所有しているすべての種で受精に必要なCa 2 +の調節イベントです。このプロセス中に精子の形質膜と外側の先体膜ヒューズは、精子細胞は、卵（透明帯、またはZP）を取り囲む糖タンパク質性マトリックスに浸透できるようにする加水分解酵素を放出する。また、ARと相互作用する新規融合精子の細胞表面を露出させる両方の配偶子の最終的な融合のための卵形質膜。 AR、ほとんどのそれらの間研究の一つであるプロゲステロンを誘発するいくつかの細胞リガンドがあります。 本研究で我々は〔Ca 2を測定するフローサイトメトリーを除いてプロゲステロン（によって引き起こされるヒト精子での[Ca 2 +] iの変化を測定するためのCa 2 +感受性蛍光色素の使用を含む四つの異なる手法を提示+ ] i）が 体外受精能プロセスの間に誘導増加。この特定のケースで我々はフルオ-3のAM（ライフテクノロジーズ、グランドアイランド、NY）、K D = 325 nMのと膜透過性染料を使用していましたin vitroでは 、我々は、方法論の3との時間の関数としての蛍光の変化をモニターしたそして第四の技術で我々は時間の単一の特定の時点での蛍光値を測定した。完全にそれらが空間的および時間的解像度を提供するので、これらの異なるアプローチは、互いに補完単一細胞及び細胞集団の両方のレベルでolution。 細胞集団またはバルク実験彼らは十分に確立され、シンプルであり、単一の実験で細胞の数百万人上で実行される測定からの情報の平均化を可能にするので、彼らが必要とする楽器でも容易に入手可能であるが、あるため、バルクの技術が広範囲にだけ使用されています。 テクニック＃1。従来の蛍光測定 この技術は、時間の関数としての蛍光の変化を監視し、実験は、200〜1,000μlに至るまでサンプル量を有するガラスキュベットで行われる。追加された試薬の適切な混合は、磁気攪拌を必要とし、従って、得られた時間分解能は秒のオーダーである。分析されたサンプルの典型的な細胞濃度範囲は、10 5〜10 8細胞/ mlである。 テクニック＃2。停止フロー蛍光測定 Tその手法は、時間の関数としての蛍光の変化を監視したが、試薬が急速に非常に少量のサンプルボリューム（25-100μlの範囲）を含有する記録キュベットに（圧力を使用して）一緒に混合する。したがって、試薬の均質化は、ミリ秒のオーダーで高い時間分解能を可能に瞬間的である。得られた蛍光対時間トレースの分析は、分析試料の一般的な細胞濃度の範囲は短命反応中間体等に関する情報を取得し、反応機構の複雑さを解明、反応速度を決定するのに適している10 5〜10 7細胞/ ml。 単一細胞実験バルク実験は、多数のセルの平均的挙動を報告しているが、人口が頻繁に測定のようなタイプの中に見過ごされている異種の性質を示すことができる。単一セル技術は、このように目を補完するために使用される電子情報は、細胞集団実験で得られた。 テクニック＃3。フローサイトメトリー 単一セル測定に起因する情報の重要性にもかかわらず、全人口のセル固有のプロパティの誤外挿を防止するために多数のセルを分析することが重要である。このため、高スループット技術が好まれている、最も一般的な方法は、条件あたり10,000細胞は、従来、分析された、フローサイトメトリーである。それは彼らの大きさ（前方散乱（FSC））、粒度（側方散乱（SSC））と蛍光強度（抗体との特異的標識、生存マーカーなど）に応じて細胞を分類し、この方法では、異種の個体群のマルチパラメトリック分析を可能に、したがって、セルのグループのパラメータ &#39;分布に関する情報を提供する。フローサイトメトリーは、インスタントではなく、時間に依存した情報を提供しています8。前方と側方散乱値AR細胞が含まれていますが、蛍光測定、負と正の蛍光コントロールの細胞破片、ほこりなどを判別ゲートを選択するためにも有用電子も含まれている必要があります。複数の蛍光チャネルが使用される場合、補償として知られている処理（詳細は参照のために実行しなければならない<a href="http://www.bdbiosciences.com/resources/protocols/setting_compensation.jsp" target="_blank">http://www.bdbiosciences.com/resources/protocols/setting_compensation.jspを</a> ）。補償は、フルオロフォア間のスペクトルの重なり弁別が可能になります。フローサイトメトリーはまた、ヨウ化プロピジウム染色によって一般的に、死細胞の識別を可能にする。 技術＃4。単一細胞イメージング 顕微鏡法は、単一の細胞の挙動を研究するための別の一般的な方法であり、それは十分に時間依存性の研究に適しており、それはまた、空間分解能を提供する。主な欠点は、ハイスループット分析は現時点ではまだ揺籃期に唯一であるということです<s9&gt;まで。

<table><tbody><tr><td>ハムのF-10</td><td>ΣΣ-Aldrich</td><td>N-6013</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>ΣAldrich</td><td>A-7906</td><td></td></tr><tr><td>塩化カルシウム二水和物 約99%</td><td>ΣΣAldrich</td><td>C-3881</td><td></td></tr><tr><td>Makler 計数室</td><td>SEFI Medical Insruments LTD</td><td>SEF-MAKL</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-3 AM</td><td>Invitrogen</td><td>F-1242</td><td>20 vials/50 &mu;g</td></tr><tr><td>各 イオノマイシン</td><td>アロモン</td><td>I-700</td><td></td></tr><tr><td>プロゲステロン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0130</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-9888</td><td>ヒト精子培地用試薬 (HSM)</td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-3911</td><td>ヒト精子培地用試薬 (HSM)</td></tr><tr><td>重炭酸ナトリウム</td><td>JT Baker</td><td>3506</td><td>試薬ヒト精子培地用試薬(HSM)</td></tr><tr><td>塩化マグネシウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-2670</td><td>ヒト精子培地用試薬(HSM)無</td></tr><tr><td>水塩化カルシウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-1016</td><td>ヒト精子培地用試薬(HSM)</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H-3125</td><td>ヒト精子培地用試薬(HSM)</td></tr><tr><td>D-グルコース</td><td>JT Baker</td><td>1906-01</td><td>ヒト精子用試薬中 (HSM)</td></tr><tr><td>ピルビン酸ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-2256</td><td>ヒト精子培地用試薬 (HSM)</td></tr><tr><td>L-乳酸ナトリウム (約 99%)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>L- 7022</td><td>ヒト精子培地用試薬 (HSM)</td></tr><tr><td>ヨウ化プロピジウム </td><td>Invitrogen</td><td>L-7011</td><td>成分</td></tr><tr><td>B Triton X-100 (t-Octylphenoxypolyethoxyethanol)</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>X-100</td><td>2.4 mM solution水中 </td></tr><tr><td>丸型カバースリップ </td><td>VWR</td><td>48380 080</td><td>直径25 mm</td></tr><tr><td>ポリ-L-リジン溶液 </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>塩化マンガン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-3634</td><td></td></tr><tr><td>Attofluor;セルチャンバー、顕微鏡用</td><td>ライフサイエンステクノロジー</td><td>A-7816</td><td></td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td>5x5 ml</td></tr></tbody></table>

細胞内ca測定<sup&gt; 2 +</sup4つの方法を使用して人間の精子で&gt;変更：従来の蛍光測定、停止フロー蛍光法、フローサイトメトリーおよび単一細胞イメージング

Measuring Intracellular Ca2+ Changes in Human Sperm using Four Techniques: Conventional Fluorometry, Stopped Flow Fluorometry, Flow Cytometry and Single Cell Imaging

精子は、特に、到達認識し、卵と融合するように設計された男性の生殖細胞である。これらのタスクを実行するには、精子細胞は、絶えず変化する環境に直面して、いくつかの物理的な障壁を克服するために準備しなければなりません。転写と翻訳サイレント本質にある、これらの運動性の細胞は自分自身の向きに多様なシグナル伝達機構に深く依存しており、監督のファッションで泳ぎ、そして卵を見つけるために彼らの旅の間に環境条件に挑戦すると競合する。具体的には、Ca 2 +の媒介シグナル伝達は、いくつかの精子の機能のための極めて重要です：運動の活性化能（先体反応のために精子を準備する複雑なプロセス）と、先体反応（精子卵の融合を可能にしますエキソサイトーシスイベント）。このイオンの細胞内変動を追跡するための蛍光色素の使用は、アプリケーション、感度の容易さのために顕著に重要である、とDETの汎用性ECTION。一つの染料ローディングプロトコルを用いて、我々は、精子のCa 2 +動態を監視するために4つの異なる蛍光技術を利用。各手法は、シングルセル及び細胞集団レベルでデータを生成し、空間的および/または時間分解能を可能にする明確な情報を提供する。

<img alt="図1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50344/50344fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50344/50344fig1.jpg" /> 図1。スイムアップ法による精子サンプル調製のための実験プロトコールの概略図。精子の分離およびそれらの濃度を調整するための主要なステップが示されている。能が必要とされるときに最後インキュベーション工程にのみ実行される。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/50344/50344fig2.jpg" fo:content-width="3in" fo:src="/files/ftp_upload/50344/50344fig2highres.jpg"/> 図...

細胞内Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt;ダイナミクスは、精子生理学およびCaで非常に重要である<sup&gt; 2 +</sup&gt;感受性蛍光色素は、それらを研究するための多彩なツールを構成する。集団実験（蛍光法およびフロー蛍​​光停止）し、単一細胞実験（フローサイトメトリーおよび単一細胞イメージング）は、時空間の[Caを追跡するために使用され<sup&gt; 2 +</supヒト精子細胞で&gt;]変化。

細胞内Ca測定<sup&gt; 2 +</sup4つの方法を使用して人間の精子で&gt;変更：従来の蛍光測定、停止フロー蛍光法、フローサイトメトリーおよび単一細胞イメージング

Spermatozoa  are male reproductive cells especially designed to reach, recognize and fuse  with the egg. To perform these tasks, sperm cells must be ...

本手順の全般的な目的は、蛍光色素を用いてヒト精子内の細胞内カルシウム変動を測定することです。まず、スイムアップ法により精子試料を調製し、必要に応じてキャパシテーションを促進させます。次に、精子にカルシウム蛍光色素をロードさせます。次に、従来の蛍光光度法、ストップトフロー蛍光光度法、フローサイトメトリー、または単一細胞イメージングを用いて実験を行い、カルシウム測定値を記録します。最終的に、これらの結果を解析し、プロゲステロンによって、あるいは受精能獲得プロセス中に誘発される細胞内カルシウム濃度の変化を判定します。放射能を用いるなどの既存の手法に対するこの手法の主な利点は、非常に感度の高い手順であることです。本手法は安全かつ容易に実施可能です。この方法は、高い空間分解能および時間分解能での細胞内カルシウム上昇を誘導する化合物の同定や、精液試料中の異なる細胞サブポピュレーションの同定など、SPRカルシウムシグナリング分野における重要な課題の解決に寄与します。例えば、フローサイトメトリー技術を利用することによる意義は、男性配偶子の生理的状態の解析を通じた不妊問題の診断にまで及びます。この手法はヒト精子のカルシウム動態の研究に知見を提供できるだけでなく、他種の雄性配偶子や、ニューロンや筋細胞などの異なる種類の細胞にも適用可能です。一般的に、この手法を用いる際、精子のハンドリングは容易ではなく、実験を通して生存し運動性のある細胞を維持するために適切な条件を保つことが重要であるため、困難を伴う場合があります。私たちは、異なる分野の戦略を組み合わせることで、これらの技術の導入を実現しました。精子細胞は操作中に損傷しやすく、また化合物の添加時に応答にアーチファクトが生じる可能性があるため、サンプルの調製と取り扱い、および化合物の添加方法を習得することは困難です。そのため、本手法の視覚的なデモンストレーションは重要です。精子サンプルの調製には、500 µLの液状精液に、1 mLのhams F 10 mediumを注意深く重層させる必要があります。マイクロピペットのチップでチューブの壁面に触れ、サンプルの上に緩やかに medium を分注してください。サンプル層と培地層が混ざり合わないよう、ゆっくりと行うことが重要です。培地には 2 mM の塩化カルシウムと 5 mg/mL の BSA を添加します。in vitro での受精能獲得を促進するため、チューブを約 30 度の角度に慎重に傾けます。これにより、2つの液層間の表面積が増加し、インキュベーション中にサンプルから培地への精子の置換または遊泳が促進されます。次に、試験管を37 °C、5% carbon dioxide、95% airのインキュベーター内に配置し、1時間静置します。マイクロピペットを用いて、運動精子を含む各チュー

measuring-intracellular-ca2-changes-human-sperm-using-four-techniques

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

イメージングカルシウムのためのテクニック 2 +人間の精子でシグナリング

カルシウムは、多くの生理学的および病態生理学的なシグナル伝達経路に関与している。生細胞イメージングは​​、特殊な設備を必要とし、時間がかかる可能性がある。懸濁液中に持ち込ま付着上皮細胞における細胞質カルシウムの相対的変化を決定するために、フローサイトメーターを使用して迅速に、簡単な方法を最適化した。...

フローサイトメトリーによる腎上皮細胞における細胞質ゾルカルシウム測定

現在、ほとんどの利用可能なカルシウム指標は、培養平滑筋細胞の筋小胞体から放出されるカルシウムの間接的な測定値として、細胞質のカルシウム過渡現象を定量化するために使用されています。このプロトコルは、筋小胞体内腔内のカルシウムシグナルの直接測定を可能にする特定のFRETベースのインジケーターの使用を説明しています。...

FRETベースの共焦点イメージングを使用した培養平滑筋細胞の小胞体内カルシウム変動の測定

精子膜の完全性、精子の受精能力に関連付けられている携帯電話の機能を評価する方法論を紹介します。精子の膜の蛍光光度法による評価のための 3 つの技術について述べる:...

蛍光光度法による精子膜評価技術

ここでは、Ca2 +の効果の評価のための 2 つの媒体スループット アッセイ-ひと精子シグナリングと先体反応を示します。これらのアッセイは、迅速かつ容易に大量の Ca2...

Ca2 +の効果の評価のためのスクリーニング アッセイ中スループット-シグナリングおよびひと精子先体反応

このプロトコルは、イオンチャネル活性を直接記録することを目的として、全細胞構成の哺乳類精子細胞からの電気記録を行う方法を説明しています。この方法は、いくつかの精子イオンチャネルの電気生理学的プロファイルを記述するのに役立ち、それらの分子同一性と調節を明らかにするのに役立ちました。...

哺乳類精子細胞の原形質膜を横切る電流の記録

本プロトコルは、単一のサイトメーターでヒト精子のアポトーシス、ミトコンドリア膜電位、およびDNA損傷の測定を可能にする実用的なソリューションを提供します。...

ヒト精子の機能異常を検出するためのバイオマーカーのフローサイトメトリー解析

ここで説明するAcroSensEマウスモデルおよび生細胞イメージング法は、精子先体細胞の細胞内コンパートメントにおけるカルシウム動態と、それらが膜融合および先体エキソサイトーシスにつながる中間ステップをどのように制御するかを研究するための新しいアプローチを提供します。...

生きたマウス精子における先体カルシウム動態とエキソサイトーシスのリアルタイムイメージング

この記事では、Fura-2/AM色素を用いたシングルセルCa2+イメージングを使用して、細胞内のカルシウムイオン(Ca2+)濃度をリアルタイムで定量的にモニタリングする方法を紹介します。この技術により、効率的な色素ローディングと、蛍光強度比によるCa2+レベルの正確な計算が可能になり、研究アプリケーションのためのシンプルで迅速なアプローチが可能になります。...

カルシウムイオンチャネルの活性化を研究するためのシングルセルカルシウムイメージング

マウス精巣から高度に精製された実行可能な減数分裂分画を得るために効率的な方法は、蛍光活性化細胞選別（FACS）による洗練された細胞解離のプロトコルを組み合わせています、説明されています。このメソッドは、離散的な減数分裂画分のDNA含量の違いと核密度を利用しています。...

マウス減数分裂細胞のフローサイトメトリーの精製

学ぶ蛍光測定法によるヒト精子の細胞内カルシウム変動測定。従来の蛍光測定、停止フロー蛍光法、フローサイトメトリー、単一細胞イメージングを用いて、プロゲステロンやカパシテーション誘発のカルシウム濃度変化を高感度に解析する手法です。

細胞内Ca測定

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