従来のホログラフィック光トラッピング機能を備えた高分解能顕微鏡の構成

本手順では、従来型およびホログラフィック光トラッピングラインを組み立て、アライメントを行います。まず、光学部品の配置場所を測定し、各部品を適切な位置に確実に固定します。次に、トラッピングが可能になるよう光学系の調整（アライメント）を行います。最後に、ホログラフィックミラーからTEDビームを遮断します。

最終的に、完成したシステムにより、ホログラフィックトラッピングと通常のトラッピングを同時に行うことが可能になります。単独の通常トラッピングなどの既存の手法に対するこの技術の主な利点は、複数の屈折物体を三次元的に同時に配置でき、高速な物体操作の測定が可能である点にあります。一般的に、この手法を初めて扱う方は、設計、レイアウト、およびアライメントが困難であるため、苦労することが予想されます。

このビデオの出発点は、980 nanometersで光学トラップを作成するために顕微鏡が設置された光学ベンチです。まず、その波長の入手容易なレーザーダイオードのいずれかを用意します。既知のモードフィールド径を持つシングルモードファイバーを保持し、偏光を維持したピグテールレーザーを使用してください。

ファイバーはモードフィルターとして機能するのに十分な長さである必要があり、FCPCまたはF-C-A-P-Cコネクタを備えたファイバーチャネルコネクタで終端されている必要があります。シングルモード光ファイバーは慎重に取り扱い、ねじれを避けてください。レーザーダイオードと、出力および温度制御が可能なマウントを固定します。

受動的な放熱を最大化するため、マウントは光学ベンチに直接固定してください。次に、ファイバーコネクタをビームコリメート光学系に取り付けます。選択したファイバーポートがダイオードのモードフィールド径と一致していることを確認してください。

ピグテールファイバーのコリメートアダプターを、ビームルーティングの拡張や他のコンポーネントの配置に十分な余裕を持たせるため、顕微鏡から十分離れた光学テーブル上の位置に固定します。堅牢で再現性のあるポジショニングを実現するために、ロッドの色を利用してレンズ間隔を固定できます。顕微鏡までのBbeam path全体に相当する距離にわたってビームウエストが一定になるよう、ファイバーポートを調整してください。

DDEレーザービームの光路には5枚のミラーが配置されています。DDEレーザーから始まり、まず2枚のミラーによって出力光が顕微鏡ハウジング内に誘導されます。また、ビームはダイクロイックミラーを通過する必要があります。このミラーは、入射角に対して45度の方向にレーザーダイオードビームを減衰させることなく透過させます。

最後に、可視光は透過し、近赤外線以上を反射する2枚のショートパスダイクロイックミラーを使用します。ビームを顕微鏡内に導入し、また顕微鏡外へと導きます。無限遠空間1は顕微鏡ハウジング内にあり、ミラーを調整するために顕微鏡対物レンズを取り外してください。

ミラーと赤外線ビューイングカードを使用して、ビームを対物レンズ取り付けステージの開口部へと導きます。ビームが中心からずれている場合は、ミラーを調整してアライメントを修正し、ビームが中心に来るようにしてください。レンズを取り付ける際、ケージシステムを使用すると、剛性のあるアセンブリを構築できます。

ノギスを使用して、設置前にケージロッドに沿ったレンズ間の距離を事前測定できます。対物レンズの代わりにカスタムアダプタで赤色レーザーポインターを一時的に取り付けて、ビームを顕微鏡の光軸に合わせます。可視レーザーポインターのビームを用いて、980 nanometer ビームエキスパンダーを配置し、大まかに調整します。

この構成では、ビームウエストを約2倍にするために、keary配置で焦点距離60 mmおよび125 mmのレンズを使用します。次に、ポインタービームをガイドとして、980 nmステアリングレンズをここに設置します。各レンズは焦点距離60 mmのマウントを備えており、光路上の最初のレンズは、ビームステアリングを可能にするために少なくとも0.5インチの可動範囲を持つ精密XYZステージ上に配置します。

次に、2番目のレンズを配置し、1番目のレンズと1対1のケーリー配置（keary arrangement）を形成します。このレンズは、対物レンズの後焦点面と光学的に共役するように配置する必要があります。ホログラフィックトラップを準備するために、1064 nanometerのレーザーを、980 nanometerのビームとおよそ同じ高さの昇降台の上に設置します。

レーザー出力の直後に、半波長板と偏光フィルターを配置します。これはレーザー出力を手動で調整できるようにするためです。このレーザー用のビームエキスパンダーを設置し、ビームウエストをホログラフィックミラーの対角線サイズに合わせて拡大させます。

スペースに制限がある場合は、ここで16 mmおよび175 mmの短焦点レンズを使用してください。次に、レーザーポインターのビームを用いて、使用している市販のホログラフィックパッケージの一部である空間光変調器（SLM）を配置します。本実験では、空間光変調器を対物レンズの後焦点面と光学的に共役するように配置する必要があります。

レーザーポインターのビームの入射角が可能な限り最小になるように配置しますが、反射光が光学テーブル上のすべてのハードウェアを安全に回避するようにしてください。1064 nanometerのレーザービームエキスパンダーの前に別のミラーを配置し、光を空間光変調器に向かわせます。レーザーポインターの光がビームエキスパンダーの開口部の中心に当たるように調整してください。

最後に、空間光変調器とダイクロイックミラーの間に望遠鏡レンズペアを設置します。これらのレンズの焦点距離は 125 millimeters および 200 millimeters です。レーザーポインターを取り外し、カスタムアダプターマウントを粗調整用アパーチャとして残します。

980 nmビームのみを用いてアライメントの確認を開始します。赤外線カードビューアを使用して、980 nmビームがカスタムアダプター内のアパーチャの中心軸に沿って進むように調整します。次に、赤外線カードを用いて、共通の光路に沿って1064 nmビームが980 nmビームと同じ箇所に当たっていることを確認します。

これが完了したら、カスタムレーザーポインター取り付けアダプターを、高開口数（NA）の油浸または水浸対物レンズに交換します。次に、ホログラフィックミラーをオフにした状態で、カメラに放射状に対称な干渉パターンが表示されるまでレーザービームを移動させ、980 nmのトラップを調整します。1064 nmのトラップは、空間光変調器と最初のダイクロイックミラーを使用して、回折されていない1064 nmのビームを移動させることで調整します。

この例では、両方のトラップの整合画像から、効率的なトラップを行うための良好なアライメントが確認できますが、さらに微調整することが可能です。また、円形の1064 nmビームが正方形のSLMミラーに当たることによる軽微な収差が発生しており、これはレンズのアライメントを調整しても簡単には除去できません。空間光変調器からの不要なビームによって生成されるトラップを遮断するには、このシステムの試料平面と共役な位置にある不要光の光路に、小さな不透過物体を挿入してください。

直径100〜300 µmの金属製不透明マイクロ球を、赤外線透過性の円形ガラスカバーのスリップまたはウィンドウに接着します。このブロックを、サンプル平面と光学的に共役するレンズの共通焦点に配置します。光学トラッピングビームが顕微鏡の無限遠空間に導入されている場合、ビームブロッカーを配置して追跡されていない光を遮断するか、あるいは移動させてすべての光を透過させることができます。

組み立てられた装置により、オペレーターは複数の屈折物体をリアルタイムで捕捉し、視野内の3次元すべての方向で配置することが可能です。ここでは、脱イオン水に懸濁させたマイクロスフィアを捕捉することで、本装置のホログラフィック機能を示しています。赤色と緑色の円はトラップの位置を示しており、このクリップでは緑色が再配置のために選択されたトラップであることを示しています。物体が捕捉された後、再生速度を速めています。その後、トラップを手動で再配置しています。

最終的な配置では、本実験が行われたユタ大学のロゴを模した11個のビーズが並んでいます。また、本システムではホログラフィックトラップと従来のトラップを併用することが可能です。ここでは、2列のホログラフィックトラップが定義されており、オペレーターによって制御されています。

2つの列の間に、さらに従来のトラップを定義します。脱イオン水に懸濁させたマイクロスフェアをトラップで捕捉します。中心のビーズを最大 4.1 micrometers の空間変位まで移動させ、その後、同様の条件下で元の位置に戻します。

しかし、中心のビーズを 82 micrometers per second で移動させると、このような一連のフレームが生成されます。2番目と3番目の画像に見られるモーションブラーに注目してください。このビデオを視聴することで、ホログラフィックトラップと通常トラップを独立して備えたデュアル光ピンセットシステムを、同一のセットアップ内でどのように配置し、調整するのかについて十分に理解できたはずです。

高出力レーザーの使用は極めて危険であるため、適切な保護メガネの着用などの予防措置を講じることを忘れないでください。