従来のホログラフィック光トラッピング機能を備えた高分解能顕微鏡の構成
2013年4月22日
ここに記載されているシステムでは、複数のトラップを作成し、操作することのできる伝統的な光学トラップと同様に、独立したホログラフィック光トラッピングラインを採用。また、生物学的酵素活性の同時高速·高分解能な測定を可能にしつつ、屈折率粒子の複合幾何学的配置の作成を可能にする。
この手順では、従来の光トラッピングラインとホログラフィック光トラッピングラインを組み立てて位置合わせします これを達成するために、まず光学部品の位置を測定し、次に部品を適切な位置にしっかりと取り付けます。次に、トラッピングができるように光学系の位置を合わせます。最後のステップは、ホログラフィックミラーからのTEDビームをブロックすることです。
最終的に、完成したシステムは、ホログラフィックトラップと通常のトラップを同時に行うことができます。この手法の主な利点は、通常のトラップのみのような既存の方法よりも、複数の屈折物体を3次元で同時に位置決めし、物体を高速に操作できることです。一般に、この方法に不慣れな人は、デザイン、レイアウト、および位置合わせが難しい場合があるため、苦労します。
このビデオの出発点は、980ナノメートルの光学トラップを作成するための顕微鏡が設置された光学ベンチです。その波長のすぐに利用できるレーザーダイオードの1つから始めます。偏光のあるピッグチルトレーザーを使用し、既知のモードフィールド直径のシングルモードファイバーを保持します。
ファイバーは、モードフィルターとして機能するのに十分な長さである必要があり、FCPCまたはF-C-A-P-Cコネクターを備えたファイバーチャネルコネクターで終端する必要があります。シングルモード光ファイバーは、ねじれを避けて慎重に取り扱う必要があります。レーザーダイオードを固定し、電力と温度制御を可能にするマウント
。マウントは、パッシブヒートシンクを最大化するために、光学ベンチに直接取り付ける必要があります。次に、ファイバーコネクタをビームコレーティングオプティクスに取り付けます。選択したファイバーポートがダイオードのモードフィールド直径と一致していることを確認します。
ピグテールファイバーは、顕微鏡から十分な距離でコレーティングアダプターを光学テーブルに取り付けて、ビームルーティングの拡張と他のコンポーネントの配置を可能にします。ロッドの色を使用してレンズの間隔を固定し、堅牢で再現性のある位置決めを行うことができます。ファイバーポートを調整して、顕微鏡へのビーム経路全体に匹敵する距離で一貫したビーム廃棄物を確保します。
DDEレーザービームの経路には5つのミラーがあります。レーザーDDEから始めて、その出力を顕微鏡ハウジングに向けるための2つのミラーがあります。また、ビームはダイクロイックミラーを通過する必要があるため、入射角に対して45度のレーザーダイオードビームの透過率が減少することはありません。
最後に、可視光線を透過するが、近赤外線以上で反射する2つのショートパスDIICミラー。ビームを顕微鏡に出し入れします。インフィニティスペース1は、ミラーを調整し、顕微鏡の対物レンズを取り外すために顕微鏡ハウジング内にあります。
ミラーと赤外線表示カードを使用して、対物レンズ取り付けステージの開口部にビームを配線します。ビームが中心からずれている場合は、ミラーを調整して、ビームが中央に来るように位置合わせを修正します。レンズを取り付ける場合、ケージシステムにより、組み立てが硬くなる可能性があります。
キャリパーは、設置前にケージロッドに沿ったレンズ間の距離を事前に測定するために使用できます。対物レンズの代わりにカスタムアダプターを使用して赤色レーザーポインターを一時的に取り付け、そのビームが顕微鏡の光軸に沿ってくるようにします。可視レーザーポインタービームを使用して、980ナノメートルビームエキスパンダーを配置し、大まかに位置合わせします。
このセットアップでは、焦点距離が60mmと125mmのレンズを鋭敏に配置して、ビームウエストを約2倍にしています。次に、ここでポインタービームを目安に980ナノメートルのステアリングレンズを取り付けます。各レンズには60mmの焦点距離マウントがあり、精密なX、Y、Zステージのビームパスの最初のレンズで、ビームステアリングを可能にするために少なくとも半インチの移動範囲があります。
これで、2 番目のレンズを 1 番目のレンズと 1 対 1 のキーリー配置を形成するように配置できます。このレンズは、対物レンズの後焦点面に光学的に共役するように配置する必要があります。ホログラフィックトラップを準備するには、1064ナノメートルレーザーを980ナノメートルビームとほぼ同じ高さの高架プラットフォームに取り付けます。
レーザー出力の直後に半波長板と偏光板を配置します。レーザー出力の手動調整を可能にするため。このレーザーのビームエキスパンダーを取り付けて、ホログラフィックミラーの対角線サイズに一致するようにビーム廃棄物が拡大されるようにします。
スペースに制約がある場合は、焦点距離が16mmと175mmと小さいレンズを使用してください。次に、レーザーポインタービームを使用して、使用されている商用ホログラフィックパッケージの一部である空間光変調器またはSLMを配置します。この実験では、空間光変調器は、対物レンズの後焦点面に光学的に共役するように配置する必要があります。
レーザーポインタービームの入射角度が可能な限り最小になるように配置しますが、その反射が光学テーブル上のすべてのハードウェアを安全にクリアするように配置してください。1064ナノメートルのレーザービームエキスパンダーの前に別のミラーを配置して、その光を空間光変調器に向けます。レーザー ポインター ライトがビーム エクスパンダーの開口部の中心に当たっていることを確認します。
最後に、空間光変調器とダイクロイックミラーの間に望遠鏡のレンズのペアを取り付けます。これらのレンズの焦点距離は125ミリメートルと200ミリメートルです。レーザーポインターを取り外し、カスタムアダプターマウントをコースアライメントアパーチャとして機能するように残します。
980ナノメートルのビームのみを使用してアライメントチェックを開始します。赤外線カードビューアを使用して、980ナノメートルのビームをカスタムアダプターの開口部の中心軸に沿って位置合わせします。次に、赤外線カードを使用して、1064ナノメートルビームが共有ビームパスに沿って980ナノメートルビームと同じスポットに当たるようにします。
これが完了したら、カスタムレーザーポインター取り付けアダプターを高開口数オイルまたは水対物レンズと交換します。次に、ホログラフィックミラーをオフにして、レーザービームを走査して980ナノメートルのトラップを位置合わせし、放射状に対称な干渉パターンがカメラに見えるようにします。空間光変調器とUN DEFRACTED 1064ナノメートルビームを歩行する最初のダイクロイックミラーを使用して、1064ナノメートルトラップを位置合わせします。
この例では、両方のトラップの整列されたイメージは、効率的なトラップのための良好な整列を示していますが、さらに絞り込むことができます。また、丸い1064ビームが正方形のSLMミラーに当たることに伴う小さな収差もありますが、これはレンズのアライメントを微調整しても簡単には解消できません。空間光変調器からのアンダーアクティングビームによって生成されるトラップをブロックするには、アンダーアクティングライトの経路にある、このシステムのサンプル平面に共役する位置に小さな不透明なオブジェクトを挿入します。
直径100〜300ミクロンの不透明なマイクロスフィア(金属)を、赤外線の透明な丸いガラスカバースリップまたは窓に接着します。ブロックは、レンズの共通焦点に配置され、レンズはサンプル平面に光学的に共役します。光トラッピングビームを顕微鏡の無限空間に注入すると、ビームブロッカを未結合の光を遮断するように配置したり、すべての光を通過させるように移動
させたりすることができます。組み立てられたセットアップにより、オペレーターは複数の屈折物体をリアルタイムでトラップし、視野内の3次元すべてに配置できます。ここでは、機器のホログラフィック機能は、脱イオン水に懸濁されたマイクロスフィアをトラップすることによって示され、赤と緑の円はトラップの位置を示し、緑はこのクリップで再配置のために選択されたトラップを示し、オブジェクトがトラップされた後に再生が高速化されます。そのトラップは手動で再配置されます。
最終的な配置には、この実験が行われたユタ大学のロゴを描いた11個のビーズがあります。このシステムでは、ホログラフィックトラップと従来のトラップの両方を一緒に使用することもできます。ここでは、2列のホログラフィックトラップが定義され、オペレーターによって制御されます。
2 つの行の間には、追加の従来のトラップが定義されます。脱イオン水に懸濁したマイクロスフェアは、トラップによって結合されています。中央のビードは、最大空間変位4.1マイクロメートルまで移動し、その後、同じ状況で元の位置に戻されます。
しかし、中央のビーズが毎秒82マイクロメートルで動くと、この一連のフレームが生成されます。2 番目と 3 番目の画像のモーション ブラーに注意してください。このビデオを見れば、デュアル光学トラップシステムを独立したホログラフィックトラップとノーマルトラップを同じセットアップでレイアウトし、位置合わせする方法を十分に理解できるはずです。
高出力レーザーでの作業は非常に危険である可能性があるため、適切な保護メガネを着用するなどの予防策を講じることを忘れないでください。
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概要
この記事では、従来の光学トラッピング技術とホログラフィック光学トラッピング技術を統合したシステムについて説明し、複数のトラップの操作を可能にします。この革新的なアプローチにより、屈折粒子の複雑な幾何学的配置の作成が可能になり、同時に生物酵素活性の高速かつ高解像度の測定も可能になります。
主要な研究要素
科学の分野
- 光学トラッピング
- 生物物理学
- 酵素活性測定
背景
- 従来の光学トラッピング方法は、複数の物体を同時に操作する能力に限界があります。
- ホログラフィック光学トラッピングは、粒子の位置決めと操作に柔軟性を提供します。
- これらの技術を組み合わせることで、測定の精度と速度を向上させることができます。
- 新しいユーザーは、光学部品の設計とアライメントに課題を抱える可能性があります。
研究の目的
- 従来の光学トラッピングとホログラフィック光学トラッピングを同時に可能にするシステムを開発すること。
- 3次元で複数の屈折物体を操作できるようにすること。
- 生物酵素活性の高速測定を可能にすること。
使用された方法
- 光学トラッピング部品の組み立てとアライメント。
- 光学部品の位置の測定。
- 指定された位置への部品の確実な取り付け。
- 効果的なトラッピングを可能にする光学のアライメント。
主な結果
- システムは従来のトラッピング技術とホログラフィックトラッピング技術を成功的に統合しました。
- 複数の屈折物体の同時位置決めが可能になりました。
- 酵素活性の高速測定が達成されました。
- ユーザーは初期設定に課題を感じましたが、システムの利点を認識しました。
結論
- 開発されたシステムは光学トラッピング技術の能力を向上させます。
- 生物学的プロセスを研究する研究者に大きな利点を提供します。
- 新しいユーザーがセットアップを習得するには、さらなるトレーニングが必要かもしれません。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Optical trapping systems enable precise manipulation of refractive objects for high-resolution force and motion measurements at nanometer and piconewton scales. Integrating conventional and holographic trapping allows simultaneous multi-object positioning and real-time 3D control, supporting mechanistic studies of molecular interactions and cellular mechanics. This capability enhances predictive confidence in target validation by enabling quantitative assessment of binding forces and conformational changes under physiological conditions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through direct measurement of molecular binding forces and complex formation dynamics.
- Operational Value: Provides functional target validation by measuring piconewton-scale forces generated by molecular motors or enzyme activity in real time.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by generating quantitative force-displacement data that correlates with target engagement and mechanism of action.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by enabling controlled manipulation of dielectric beads or cellular organelles as force sensors.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility through precise positioning and simultaneous readout of trap position relative to object motion.
- Scalability: Supports screening readiness via holographic pattern generation for parallel trapping of multiple objects in the field of view.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Maintains disease relevance by enabling measurement of nanoscale mechanical properties in primary cells or tissue-derived models under near-physiological conditions.
- Mechanistic De-risking: Connects discovery observations to preclinical validation through force-production readouts that inform target modulation strategies.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions by quantifying how perturbations affect mechanical output in disease-relevant systems.
Pipeline & Workflow Integration
The system fits within the discovery continuum from hypothesis testing through lead identification to preclinical validation by providing quantitative biophysical readouts that inform target prioritization and mechanism elucidation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling direct measurement of intermolecular forces and conformational changes in protein complexes.
- Screening: Delivers assay readiness through high-speed, high-resolution position tracking of trapped objects, facilitating reliable compound evaluation via force-based readouts.
- Analytics: Generates nanometer-scale displacement and piconewton-force measurements that allow teams to compare conditions and assess target modulation efficacy.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by enabling mechanical phenotyping in disease-relevant cellular systems, supporting biomarker alignment for mechanotransduction pathways.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for multi-parametric analysis across projects, reducing redundant setup and enabling cross-team standardization of force measurement protocols.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence through direct, label-free measurement of mechanical outputs that reduce ambiguity in target mechanism interpretation.
- Operational Value: Ensures standardization and scalability via holographic trapping patterns and simultaneous multi-object control, improving throughput in force measurement campaigns.
- Strategic Value: Enhances capital efficiency by enabling early de-risking of targets through quantitative force data, reducing late-stage failure due to unanticipated mechanical liabilities.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted prioritization by delivering objective, quantitative data on target engagement strength and conformational dynamics across candidate molecules.
Implementation Considerations
- Requires expertise in optical alignment, laser safety, and beam path optimization for dual-wavelength trapping systems.
- Depends on stable optical bench infrastructure, precision translation stages, and infrared-compatible components for 980 nm and 1064 nm laser integration.
- Necessitates cross-team standardization of trapping protocols, calibration procedures, and data analysis pipelines for force and displacement readouts.
- Involves adaptation considerations when transitioning from bead-based assays to primary cells or tissue explants due to varying refractive indices and sample viability constraints.
- Limited by alignment complexity and potential aberrations from mismatched beam profiles, particularly when holographic patterns interact with spatial light modulator geometry.
