Name: 従来のホログラフィック光トラッピング機能を備えた高分解能顕微鏡の構成 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: 学ぶ 従来型とホログラフィック光トラッピングを統合した高分解能顕微鏡システムの構築手法。複数の屈折性粒子を三次元で同時操作し、酵素活性の高速測定を可能にする革新的なバイオ物理学研究手法です。

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資金はユタ大学によって提供されました。我々は有益な議論のために博士J.徐（UCマーセド）博士BJNレディ（UCアーバイン）に感謝したいと思います。

1。 980nmの波長シングル光学トラップの設置<ol><li> 980nmの波長における光トラッピングは、多くの場合、生物物理学実験で安価なレーザダイオードに最適な300 mWのような高い電力出力で容易に入手可能である。これは、公知のモードフィールド径を有する偏波面保存シングルモードファイバピグテールとするダイオードレーザが好ましい。繊維は、モードフィルタとして機能する十分な長さが必要であり、一般的にFC / PCまたはFC / APCコネクタのどちらかで終了します。これらのうち、FC / APC光と潜在的なフィードバックの不安定性の反射を最小限に抑えるバックすることが好ましい。 </li><li>電力と温度制御を可能にするマウントで980 nmのレーザダイオードを固定します。受動的な放熱を最大化することにより、温度調節器の故障に起因するダイオード障害の危険性を最小限に抑えるために、直接光学テーブルにマウントを固定することをお勧めします。 </li><li>光学コリメートビームにPC / APCファイバコネクタを取り付けます。それは調節可能な光ファイバポートが最も有用であるので、平行ビームは、最小限の発散を持っていることを保証することが重要。選択された光ファイバポートは、ダイオードピグテールファイバのモードフィールド径と一致することを確認する。ビームは音響光学偏向器（AOD）又は電気光学偏向素子を用いてラスターする場合（EOD）はコリメートレーザビームウエストはまた、デフレクタ開口の大きさよりも僅かに小さくなければならない。 </li><li>ビームルーティング、拡張、および他の所望のコンポーネントの配置を可能にするために、顕微鏡から十分な距離を置いて光学テーブルへコリメートアダプターを固定します。顕微鏡への全体的なビーム経路に匹敵する距離で一貫性のあるビームウエストを確保するためのファイバーポートを調整します。 </li><li> 図1に示されているミラーを取り付けます。顕微鏡から目的を削除し、客観的な取り付けの段階で開口を通してルートにビームをミラーを使用しています。望ましい場合には、ダイクロイックミラーDM1とDM3の配置はまで省略することができます後で。 DM2とDM3はショートパスの両方であり、IRに近く、上記反射する可視光を透過する。 </li><li>一時的に顕微鏡の光軸上に整列目的の代わりに赤色レーザーポインタを、マウントすると便利です。カスタムメカニカルアダプタは、レーザーポインタのセンタリングを確保することが必要である。レーザーポインタからの可視光は、その後ファイバーポートの開口部の中央に戻ってルーティングすることができ、その後レンズを（下記参照）をインストールするために使用することができます。 </li><li>必要に応じて1としてステアリングコンポーネント（AODまたはEOD）の将来の挿入を可能にする光ファイバポートから適切な距離で980 nmのビームエキスパンダー（L8とL9）をインストールします。拡大ビームは、わずかに目標の後焦点絞りを入れすぎなければなりません。 （ここでは、125ミリメートルと60ミリメートルの焦点距離を持つレンズは約ビームウエストを倍増するためにケプラーの配置である。）適切なレンズ配置と粗いアラインメントを確保するために目に見えるレーザーポインタービーム（1.6節を参照）を使用します。 </li><li>インストール示された（ここで両方とも60ミリメートルの焦点距離を有する）1と望遠鏡配置lで980 nmの操舵レンズ（L2 ​​及びL3）。 L3は、対物レンズの後側焦平面に共役な面に取り付けられている。ビームステアリングを可能にする高精度XYZ位置決めステージ上にマウントL3。それは繰り返し位置決めとトラップの再配置を可能にする、そのためのマイクロデジタルインジケータを持つXYZステージのために有用です。 0.5 &quot;は、旅行の範囲は通常は十分ですが、光軸に沿ってL3の位置決めのためのより長い旅行が役に立つかもしれません。適切なレンズ配置と粗いアラインメントを確保するために目に見えるレーザーポインタービーム（1.6節を参照）を使用します。 </li></ol> 2。レーザー検出器の設置<ol><li> 図1に示すように、コンデンサ上記ダイクロイックミラーDM3をインストールする。カスタムマウントは、通常必要とされる。コンデンサーアセンブリの側面にクワッドフォトダイオード（QPD）や位置敏感型検出器（PSD）8を確保し、ENS980 nmのレーザービームがDM3によって反射することUREは大体中央にそれに当たっている。 QPDを使用する際には、レーザビームのセンサーの正確なセンタリングを可能にするにはXYステージ上に搭載されていることを確認する。 </li><li> DM3とセンサの間のL1を（通常は30 mmレンズ）をインストールします。センサー上の単一スポットにビームを集束するように位置は、L1。 </li><li> L1は顕微鏡照明と周囲の照明から1,064 nmのビームと同様の浮遊可視光の反射を遮断するために直前にノッチフィルタを取り付けます。 </li></ol> 3。 1,064 nmの波長ホログラフィトラップの設置<ol><li>セットアップのホログラフィックの部分は、このパッケージで使用されるホログラムミラーは5または10 W / cm 2での最大入射電力定格されている市販のハードウェア/ソフトウェアのパッケージを中心に構築されています。この電力範囲内の単一モードTEM00ビームは簡単に1,064 nmの波長でDPSSレーザーから供給することができます。 </li><li>高架上の1,064 nmレーザーをマウントプラットフォームは、およそ980ライン（第1参照）のビーム経路の高さを一致させる。 </li><li>直接制御できない場合は、レーザパワーを手動で右側のレーザ出力開口後の半波長板（HWP）と偏光子（PBS）をインストールすることによって調整することができる。これは、ビームの偏光のためのホログラムミラー要件に一致させることができるように回転ステージの偏光板を取り付けることが有用である。 </li><li> 1,064 nmのビームエキスパンダー（L6とL7）をインストールします。レーザービームウエストは、ホログラフィックミラーの対角サイズに合わせて拡大されている必要があります。大拡張比（10倍以上）のためには、小さなパンダの大きさを維持するために心配かもしれません。 （：16 mmであり、ここでは175ミリメートル）従って、異常に小さい焦点距離のレンズを使用することが望ましい場合がある。 </li><li>客観を通じて1,064 nmのビームを向けるように示されているように、他のミラーを取り付けます。 <ol><li>それはundiminishe可能になるようにセキュアDM1キネマティックマウントにおけるダイクロ（入射45°の角度）とは、980 nmの光路内にアセンブリを配置そのビームのD伝送。 </li><li>レーザーポインターの光をアクティブにします。 DM1ミラーが適切にこのビームの経路内に空間光変調器（SLM）を位置決めする可視光の量を十分に反映すべきである。 SLMは、着信および発信のレーザービームは、通常の発生率にできるだけ接近しているように、角度を付けする必要があります。しかし、入射角は、レーザビームがレンズマウント、および他の光学部品によってクリップされないように十分に大きくなければならない。 5°の角度が容易に達成されると十分に小さい必要があります。最後DM1からSLMまでの距離を正確にレンズL4とL5の挿入が（下記3.6を参照）SLM鏡面と客観のバック焦点面を活用できる​​ように、測定されなければならない。 </li><li> 1,064 nmのビームエキスパンダからSLMに光を導くためにミ​​ラーを取り付けます。レーザーポインターの光が中央にビームエキスパンダー開口に当たることを確認してください。 </li></ol></li><li> L4とL5レンズを取り付けます（ここでは12のレンズそれぞれ5mmで200ミリメートル）。この望遠鏡のペアは、対物レンズの後焦点面にSLM鏡面をコンジュゲートし、また少しだけ入れ過ぎに目的の背面開口部をビームウエストを減らすことができます。私たちは、SLM離れDM1から空間に長い焦点距離のレンズを選んだ。これにより、第2のレーザ線の余地をクリアしなくアライメントを容易にする傾向があるのみならず。 </li><li>レーザーポインタを削除します。粗いアラインメント絞りとして機能するようにマウントアダプタにしておきます。 </li></ol> 4。システムのインストールとアライメント注意<ol><li>目的の後焦点面と光学的に共役になるようレンズL3とSLMがように配置しなければなりません。光トラッピングビームが顕微鏡の無限大の空間に注入される場合、L4とL5の共通の焦点が試料面に光学的に結合している。 </li><li>歌うIRカードビューアはレーザーポインターのアダプタの開口部の中心軸に沿って移動する980 nmの光を合わせます。 </li><li> IRカードTを使用して、oが1,064 nmのビームはDM1、L2、およびL3上と1,064 nmのビームはレーザーポインターのアダプタの開口部の中心軸に沿って行くことを980 nmのビームと同じスポットに当たることを確認してください。 </li><li>を目的としたレーザーポインターマウントアダプターを交換します。高開口数の対物油または水が典型的である。 </li><li>レーザービームを&quot;歩く&quot;ことで9で説明したように放射状に対称の干渉パターンをカメラで見られるまで980 nmのトラップの位置を合わせます。 </li><li>ホログラフィックミラーをオフにして（ つまり、受動的ミラーとして機能）1,064 nmのトラップを整列させる非回折1,064 nmの光を&quot;歩く&quot;ためにSLMとDM1を使用しています。 </li><li> SLMは、視野内の強い不動レーザートラップをもたらす重要な非回折ビームを生成する。これは、位置合わせのために有用であるが、実験のために望ましくないかもしれません。このトラップをブロックするには一つ（試料面に位置共役な非回折光の経路に小さな不透明なオブジェクトを挿入することができます例えば番目L4とL5）のE共通の焦点。この中央のスポットブロッカーが集光された光（記載されているシステムのための100-300ミクロン径のブロッカー）のためのエアリーディスクの直径よりも若干大きくする必要があるのサイズ。 </li><li> SLMの向きを一致させる偏光子を用いた1,064 nmのビームの偏光をdjust。所望に応じて光の出力パワーを設定する半波長板を回転させる。 </li><li>必要に応じて、980 nmのレーザー線にAOD又はEODビームステアリング要素を挿入。目的のバックフォーカルプレーンにこれらの要素の適切な共役を確保し、トラップを再調整。ゴニオステージ上ステアリング要素をマウントすると便利です。 </li></ol>

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</ol>

著者らは、開示することは何もありません。

我々は、オブジェクトの操作および測定するための別々の捕捉機能を提供する異なるタイプ（ 図1）の二つの光学トラップを組み合わせた器具を構築した。 &quot;従来&quot;光学トラップは980 nmのダイオードレーザーを中心に構築されています。このビームは、拡大して操縦した後（ 図1の&quot;光赤&quot;ビーム）当社の倒立顕微鏡に注入される。ホログラフィック光学トラップは1,064 nmのDPSSレーザーを中心に構築されています。ビームは、空間光変調器（SLM）のサイズに合わせて拡大して低入射角でSLMから反射され、わずかに対物レンズの後焦点開口部を過剰充填を減らし、ダイクロイックを使用して、 &quot;従来の&quot;トラップラインと組み合わされるミラー、そして最終的に我々の顕微鏡に注入（ 図1の&quot;暗赤色&quot;ビーム）。 SLMは、光学的に客観の後焦点面に共役な平面に配置しなければならないことに注意してください。 プロトタイプでCOLセクションでは、私...

光トラッピングは、生物物理学6における主要技術の一つである。光トラッピングに重要な進歩は、三次元の捕獲パターンではなく、従来のポイントトラップ7の作成 ​​を可能にするホログラフィックトラップの開発をされています。このようなホログラフィックトラップは屈折オブジェクトの位置で汎用性の利点を持っています。しかし従来のトラップは簡単に市販のホログラフィックキットよりも対称に整列させることができる。彼らはまた、閉じ込められたオブジェクトの迅速正確なトラッキングを可能にします。ここではひとつの楽器で2トラッピングのアプローチを組み合わせて、ユーザーが必要に応じて両方の利点を活用できるようにするシステム（ 図1）について説明します。 構築光学トラップ（単一または複数のレーザービームに基づく）の一般的な考察は別の場所8-10詳細に議論されています。ここで、私たちはsに固有の考慮事項を概説etupと当社アライメント手順の詳細を提供。例えば、2つの光トラッピングビームを有するシステムは、典型的には、屈折物体を捕捉し、捕捉された物体の位置のデカップリング読出しのために（意図的に低電力ビーム）その他を使用するための1つのレーザビームを用いて、（ 例えば、参考文献11）の前に記載されている。ここしかしながら、両方のレーザビームは、両方の捕捉のために使用されるので（300 MWまたはより高い）動力高くする必要がある。生物系の測定では、トラッピングのため使用されるレーザーは、最適に光誘発タンパク質分解1を最小化するために波長の特定のNIRウィンドウ内に収まる必要があります。ここでは、980 nmのダイオードとするため、低コスト、高可用性と操作のしやすさの1,064 nmのDPSSレーザーを使用することを選択しました。 また、4,5、リアルタイムで同時に複数のトラップを作成し、操作する空間光変調器（SLM）を使用することを選択した。これらの装置は市販されているしかし完全なセットアップへの統合は、ユニークな課題を提示。ここでは、これらの潜在的な困難に対処し、汎用性の高い楽器を提供する実用的なアプローチを説明する。我々は、変更された設計のためのガイドとして使用することができる具体的なセットアップのための明示的な例を提供します。

<table><tbody><tr><td>光学テーブル</td><td>ニューポート コーポレーション</td><td>ST-UT2-56-8</td><td>カリフォルニア州アーバイン</td></tr><tr><td>顕微鏡、反転、日食 Ti</td><td>ニコン USA</td><td>MEA53220</td><td>ニューヨーク州メルビル</td></tr><tr><td>プラン apo 100X オイル対物レンズ (1.4 NA)</td><td>ニコン USA</td><td>MRD01901</td><td>ニューヨーク州メルビル</td></tr><tr><td>オイルコンデンサー レンズ 1.4 NA</td><td>ニコン</td><td>USA MEL41410</td><td>ニューヨーク州メル</td></tr><tr><td>ビル EMCCD カメラ</td><td>Andor テクノロジー米国</td><td>Ixon DU897</td><td>サウスウィンザー、コネチカット州</td></tr><tr><td>1/3" CCD IEEE1394カメラ</td><td>NET USA Inc</td><td>Foculus FO124SC</td><td>Highland IN</td></tr><tr><td>レーザー、TEM00、SLM、1,064 nm 波長</td><td>Klastech Laser Technologies</td><td>Senza-1064-1000</td><td>ドルトムント;ドイツ</td></tr><tr><td>レーザーダイオード、TEM00、SLM、980 nm</td><td>Axcel Photonics</td><td>BF-979-0300-P5A</td><td>マールボロ、MA</td></tr><tr><td>レーザーダイオードマウント</td><td>ILX Lightwave</td><td>LDX-3545、LDT-5525、LDM-4984</td>ボー<td>ズマン、MT</td></tr><tr><td>調整可能なファイバーポート</td><td>Thorlabs</td><td>PAF-X-11-B</td><td>ニュートン、ニュージャージー</td></tr>州<tr><td>ホログラフィックシステム</td><td>Arryx</td><td>HOTKIT-ADV-1064</td>シカゴ<td>、イリノ</td></tr><tr><td>イ州ホログラフィックミラー</td><td>ボルダー非線形システム</td><td>これは、HOTKIT-ADV-1064</td><td>ラファイエット、CO</td></tr><tr><td>方解石偏光子</td><td>Thorlabs</td><td>GL10-B</td><td>ニュートン、ニュージャージー</td></tr>州<tr><td>半波長板</td><td>Thorlabs</td><td>WPH05M-1064</td><td>ニュートン、ニュージャージー</td></tr>州 <tr><td>偏光子回転マウント</td><td>Thorlabs</td><td>PRM1</td><td>ニュートン、ニュージャージー</td></tr>州<tr><td>半波長板回転マウント</td><td>Thorlabs</td><td>RSP1</td><td>ニュートン、ニュージャージー州の一部です</td></tr><tr><td></td><td>シャッターThorlabs</td><td>SH05</td><td>ニュートン、ニュージャージー州</td></tr><tr><td>ダイクロイックミラー(DM2&DM3);45度;AOI</td><td>Chroma Technology</td><td>t750spxrxt</td><td>ベローズフォールズ、VT</td></tr><tr><td>ダイクロイックミラー(DM1)、45°;AOI</td><td>Thorlabs</td><td>DMSP1000R</td><td>ニュートン、ニュージャージー州</td></tr><tr><td>カスタムメカニカル</td><td>アダプターThorlabsSM1A11</td><td>およびAD12F、拡大インナーボア</td><td>ニュートン、ニュージャージー州ノ</td></tr><tr><td>ッチフィルターSemrock</td><td></td><td>FF01-850 / 310-25</td><td>ロチェスター、NY</td></tr><tr><td>音響光学ディフレクター(2軸)</td><td>intraAction</td><td>DTD-584CA28</td>ベル<td>ウッド、イリノイ</td></tr><tr><td>州ゴニオメトリックステージ</td><td>ニューフォーカス</td><td>9081</td><td>カリフォルニア州サンタクララ</td></tr><tr><td>60 mm ステアリング レンズ</td><td>Thorlabs</td><td>LA1134-B</td><td>ニュートン、ニュージャージー州</td></tr><tr><td>16 mm 非球面エキスパンダー レンズ</td><td>Thorlabs</td><td>AC080-016-C</td><td>ニュートン、ニュージャージー州</td></tr><tr><td>175 mm エキスパンダー レンズ</td><td>Thorlabs</td><td>LA1229-C</td><td>ニュートン、ニュージャージー</td></tr>州 <tr><td>スポット ブロッカー (カブロン鋼球)</td><td>Bal-Tec</td><td>直径 0.0100"</td><td>ロサンゼルス、カリフォルニア州</td></tr><tr><td>マイクロスフィア (カルボキシルポリスチレン)</td><td>Spherotech</td><td>CP-45-10</td><td>Lake Forest, IL</td></tr></tbody></table>

従来のホログラフィック光トラッピング機能を備えた高分解能顕微鏡の構成

Construction of a High Resolution Microscope with Conventional and Holographic Optical Trapping Capabilities

光学トラップの高解像度顕微鏡システムは、このような誘電ビーズ1または細胞小器官2,3と同様に、トラップの中心に対してそれらの位置の高空間分解能と時間分解能の読み出し用として、様々な屈折オブジェクトの正確な操作が可能になります。システムがここに980nmの1つのこのような &quot;伝統的な&quot;トラップ動作が持って説明。それはさらに、同時に波長1064nmにおける4,5顕微鏡の視野内に複雑なトラッピングパターンを作成し、操作するために、市販のホログラフィックパッケージを使用して第二の光学トラップシステムを提供する。同時に高速およびナノメートルスケールでのピコニュートン動作と力の生産高分解能測定を行いながら、2系統の組み合わせは、同時に複数の屈折オブジェクトの操作を可能にする。

組み立てられた設定は、オペレータがリアルタイムで複数の屈折オブジェクトをトラップし、視野内の全ての三次元的にそれらを配置することができる。我々は11マイクロスフェア（ 図2）トラップして楽器のホログラフィック機能を示す。各オブジェクトを閉じ込めるトラップは手動で、最終的な配置が、この実験を行ったユタ大学のロゴを示すように、トラッピング時に再び配置されている。ホログラフィック従来のトラップを合わせた機能は、 図3に示されている。従来のトラップは徐々に速くなり、中央のビーズを移動（1.3、10および82ミクロン/秒のトラップ速度が表示されています）、ホログラフィックに定義トラップは静止したままで。最高速度で、ビード全体の動きは、映像の1フレーム分の記録時に発生するので、極端なモーションブラーとして現れる。それは十分に速くビーズhだけトラップ電位から強制されるという従来トラップを移動させることができるydrodynamicドラッグ（図示せず）。 視野内の微小球体の数がフルアセンブリ（ 図2</strong...

ここに記載されているシステムでは、複数のトラップを作成し、操作することのできる伝統的な光学トラップと同様に、独立したホログラフィック光トラッピングラインを採用。また、生物学的酵素活性の同時高速·高分解能な測定を可能にしつつ、屈折率粒子の複合幾何学的配置の作成を可能にする。

High resolution microscope systems with optical traps allow for precise manipulation of various refractive objects, such as dielectric beads 1 or cellular ...

本手順では、従来型およびホログラフィック光トラッピングラインを組み立て、アライメントを行います。まず、光学部品の配置場所を測定し、各部品を適切な位置に確実に固定します。次に、トラッピングが可能になるよう光学系の調整（アライメント）を行います。最後に、ホログラフィックミラーからTEDビームを遮断します。最終的に、完成したシステムにより、ホログラフィックトラッピングと通常のトラッピングを同時に行うことが可能になります。単独の通常トラッピングなどの既存の手法に対するこの技術の主な利点は、複数の屈折物体を三次元的に同時に配置でき、高速な物体操作の測定が可能である点にあります。一般的に、この手法を初めて扱う方は、設計、レイアウト、およびアライメントが困難であるため、苦労することが予想されます。このビデオの出発点は、980 nanometersで光学トラップを作成するために顕微鏡が設置された光学ベンチです。まず、その波長の入手容易なレーザーダイオードのいずれかを用意します。既知のモードフィールド径を持つシングルモードファイバーを保持し、偏光を維持したピグテールレーザーを使用してください。ファイバーはモードフィルターとして機能するのに十分な長さである必要があり、FCPCまたはF-C-A-P-Cコネクタを備えたファイバーチャネルコネクタで終端されている必要があります。シングルモード光ファイバーは慎重に取り扱い、ねじれを避けてください。レーザーダイオードと、出力および温度制御が可能なマウントを固定します。受動的な放熱を最大化するため、マウントは光学ベンチに直接固定してください。次に、ファイバーコネクタをビームコリメート光学系に取り付けます。選択したファイバーポートがダイオードのモードフィールド径と一致していることを確認してください。ピグテールファイバーのコリメートアダプターを、ビームルーティングの拡張や他のコンポーネントの配置に十分な余裕を持たせるため、顕微鏡から十分離れた光学テーブル上の位置に固定します。堅牢で再現性のあるポジショニングを実現するために、ロッドの色を利用してレンズ間隔を固定できます。顕微鏡までのBbeam path全体に相当する距離にわたってビームウエストが一定になるよう、ファイバーポートを調整してください。DDEレーザービームの光路には5枚のミラーが配置されています。DDEレーザーから始まり、まず2枚のミラーによって出力光が顕微鏡ハウジング内に誘導されます。また、ビームはダイクロイックミラーを通過する必要があります。このミラーは、入射角に対して45度の方向にレーザーダイオードビームを減衰させることなく透過させます。最後に、可視光は透過し、近赤外線以上を反射する2枚のショートパスダイクロイックミラーを使用します。ビームを顕微鏡内に導入し、また顕微鏡外へと導きます。無限遠空間1は顕微鏡ハウジング内にあり、ミラーを調整するために顕微鏡対物レンズを取り外してください。ミラーと赤外線ビューイングカードを使用して、ビームを対物レンズ取り付けステージの開口部へと導きます。ビームが中心からずれている場合は、ミラーを調整してアライメントを修正し、ビームが中心に来るようにしてください。レンズを取り付ける際、ケージシステムを使用すると、剛性のあるアセンブリを構築できます。ノギスを使用して、設置前にケージロッドに沿ったレンズ間の距離を事前測定できます。対物レンズの代わりにカスタムアダプタで赤色レーザーポインターを一時的に取り付けて、ビームを顕微鏡の光軸に合わせます。可視レーザーポインターのビームを用いて、980 nanometer ビームエキスパンダーを配置し、大まかに調整します。この構成では、ビームウエストを約2倍にするために、keary配置で焦点距離60 mmおよび125 mmのレンズを使用します。次に、ポインタービームをガイドとして、980 nmステアリングレンズをここに設置します。各レンズは焦点距離60 mmのマウントを備えており、光路上の最初のレンズは、ビームステアリングを可能にするために少なくとも0.5インチの可動範囲を持つ精密XYZステージ上に配置します。次に、2番目のレンズを配置し、1番目のレンズと1対1のケーリー配置（keary arrangement）を形成します。このレンズは、対物レンズの後焦点面と光学的に共役するように配置する必要があります。ホログラフィックトラップを準備するために、1064 nanometerのレーザーを、980 nanometerのビームとおよそ同じ高さの昇降台の上に設置します。レーザー出力の直後に、半波長板と偏光フィルターを配置します。これはレーザー出力を手動で調整できるようにするためです。このレーザー用のビームエキスパンダーを設置し、ビームウエストをホログラフィックミラーの対角線サイズに合わせて拡大させます。スペースに制限がある場合は、ここで16 mmおよび175 mmの短焦点レンズを使用してください。次に、レーザーポインターのビームを用いて、使用している市販のホログラフィックパッケージの一部である空間光変調器（SLM）を配置します。本実験では、空間光変調器を対物レンズの後焦点面と光学的に共役するように配置する必要があります。レーザーポインターのビームの入射角が可能な限り最小になるように配置しますが、反射光が光学テーブル上のすべてのハードウェアを安全に回避するようにしてください。1064 nanometerのレーザービームエキスパンダーの前に別のミラーを配置し、光を空間光変調器に向かわせます。レーザーポインターの光がビームエキスパンダーの開口部の中心に当たるように調整してください。最後に、空間光変調器とダイクロイックミラーの間に望遠鏡レンズペアを設置します。これらのレンズの焦点距離は 125 millimeters および 200 millimeters です。レーザーポインターを取り外し、カスタムアダプターマウントを粗調整用アパーチャとして残します。980 nmビームのみを用いてアライメントの確認を開始します。赤外線カードビューアを使用して、980 nmビームがカスタムアダプター内のアパーチャの中心軸に沿って進むように調整します。次に、赤外線カードを用いて、共通の光路に沿って1064 nmビームが980 nmビームと同じ箇所に当たっていることを確認します。これが完了したら、カスタムレーザーポインター取り付けアダプターを、高開口数（NA）の油浸または水浸対物レンズに交換します。次に、ホログラフィックミラーをオフにした状態で、カメラに放射状に対称な干渉パターンが表示されるまでレーザービームを移動させ、980 nmのトラップを調整します。1064 nmのトラップは、空間光変調器と最初のダイクロイックミラーを使用して、回折されていない1064 nmのビームを移動させることで調整します。この例では、両方のトラップの整合画像から、効率的なトラップを行うための良好なアライメントが確認できますが、さらに微調整することが可能です。また、円形の1064 nmビームが正方形のSLMミラーに当たることによる軽微な収差が発生しており、これはレンズのアライメントを調整しても簡単には除去できません。空間光変調器からの不要なビームによって生成されるトラップを遮断するには、このシステムの試料平面と共役な位置にある不要光の光路に、小さな不透過物体を挿入してください。直径100〜300 µmの金属製不透明マイクロ球を、赤外線透過性の円形ガラスカバーのスリップまたはウィンドウに接着します。このブロックを、サンプル平面と光学的に共役するレンズの共通焦点に配置します。光学トラッピングビームが顕微鏡の無限遠空間に導入されている場合、ビームブロッカーを配置して追跡されていない光を遮断するか、あるいは移動させてすべての光を透過させることができます。組み立てられた装置により、オペレーターは複数の屈折物体をリアルタイムで捕捉し、視野内の3次元すべての方向で配置することが可能です。ここでは、脱イオン水に懸濁させたマイクロスフィアを捕捉することで、本装置のホログラフィック機能を示しています。赤色と緑色の円はトラップの位置を示しており、このクリップでは緑色が再配置のために選択されたトラップであることを示しています。物体が捕捉された後、再生速度を速めています。その後、トラップを手動で再配置しています。最終的な配置では、本実験が行われたユタ大学のロゴを模した11個のビーズが並んでいます。また、本システムではホログラフィックトラップと従来のトラップを併用することが可能です。ここでは、2列のホログラフィックトラップが定義されており、オペレーターによって制御されています。2つの列の間に、さらに従来のトラップを定義します。脱イオン水に懸濁させたマイクロスフェアをトラップで捕捉します。中心のビーズを最大 4.1 micrometers の空間変位まで移動させ、その後、同様の条件下で元の位置に戻します。しかし、中心のビーズを 82 micrometers per second で移動させると、このような一連のフレームが生成されます。2番目と3番目の画像に見られるモーションブラーに注目してください。このビデオを視聴することで、ホログラフィックトラップと通常トラップを独立して備えたデュアル光ピンセットシステムを、同一のセットアップ内でどのように配置し、調整するのかについて十分に理解できたはずです。高出力レーザーの使用は極めて危険であるため、適切な保護メガネの着用などの予防措置を講じることを忘れないでください。

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