末梢血幹細胞移動の解析のためのマウス精巣挙筋で微小循環の生体顕微鏡
2013年11月5日
マウスのM.精巣挙微小循環の生体顕微鏡は、ユニークと周辺の骨髄幹細胞の移動を解析するための生体モデルでよく標準化されています。
この手順の全体的な目標は、in vivo で幹細胞内皮細胞の相互作用を視覚化することです。これは、最初に大腿動脈カテーテルを鎮静剤を投与した動物に導入し、動脈内アクセスを行うことで達成されます。第2ステップでは、彩度筋は生体内蛍光顕微鏡検査のために外科的に準備されます。
次に、目的の幹細胞集団を大腿動脈カテーテルを介して注入します。最終的には、養子縁組移植された幹細胞とマスター筋微小循環の内皮との間の相互作用を視覚化し、定量化することができます。この方法は、治療用幹細胞の生体内での移動がどのように制御されているかなど、再生医療分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。
マイクロサージェリーDエアを開始する前に、カテーテルを0.9%塩化ナトリウムの1ミリリットルのシリンジに接続しました。次に、20〜25ミリグラムの麻酔をかけた雄マウスの右大腿部と鼠径部だけでなく、右陰嚢の前面を優しく剃ります。湿らせた綿棒ですべての抜け毛を集め、次にマウスの腹側を上にして、ベースプレートとベースプレートのコドルエッジにある2番目のプレートで構成されるプレキシガラスのカスタムメイドの視聴ステージに置きます。
伸縮性のあるドレープで足を固定した後、ステージを温熱パッドに置き、動物の体温を摂氏37度に保ちます。次に、10〜16倍の倍率を使用して、解剖顕微鏡とハサミを使用して、膝から鼠径部までの大腿骨血管のすぐ前方にある右大腿部に最初の切開を行います。大腿動脈を特定し、それを近位にたどり、周囲の軟部組織から動脈を動員します。
次に、サーモ焼灼を使用して、左睾丸につながる大きな動脈枝を特定して切断します。左の睾丸の表面に6 oh proleneステー縫合糸を配置します。次に、大腿部で内側に走る大きな動脈枝を特定し、熱焼灼します。
次に、穏やかな牽引力を使用して、右大腿部の遠位部分で大腿動脈を結紮し、次に近位大腿動脈の周囲に動物のできるだけ中心に近い縫合糸を留置します。次に、大腿動脈の周りに緩い結び目を置きますが、結ばないでください。次に、縫合糸に穏やかな牽引力を加えて、動脈のねじれを作り出します。
ねじれを確認したら、マイクロハサミを使用して動脈のサイズを慎重に調整し、大腿静脈を傷つけないように特別な注意を払います。次に、事前に準備したマイクロカテーテルを切開部に挿入します。カテーテルの通過を容易にするために、ねじれを慎重に緩めます。
動脈血流はカテーテル内ですぐに見えるはずです。カテーテルを前のねじれから数ミリメートルゆっくりと進めます。次に、準備した結紮糸を結んでカテーテルを固定します。
次に、カテーテルを塩化ナトリウムで静かに洗い流し、溶液を吸引してカテーテルの正しい位置を確認します。テープを使用して、カテーテルを手術段階にさらに固定します。カテーテルが適切に固定され、脇に移動した後、右陰嚢の腹側側面の上の皮膚と筋膜を切断します。
器具で下にある組織に触れないように注意してください。切開部を鼠径部のひだまで伸ばし、陰嚢の遠位端までこっそりと伸ばします。次に、組織自体に触れることなく、クレマスター嚢の上にある下にある軟組織と結合組織を慎重に分離します。
次に、クレマスターの遠位端に6 oh proleneステー縫合糸を配置して、筋肉をわずかに伸ばします。次に、筋肉をそっと前方に引っ張って、筋嚢の下に残っている軟組織を切除します。結合組織から完全に分離した後、ハサミを使用して頭蓋端のCマスター嚢を開き、この開口部から筋肉の遠位端まで切開部を伸ばします。
火葬場の睾丸をつなぐ小さな血管を熱焼灼した後、はさみを使って筋肉と睾丸の間の残りの接続を切ります。開いた火葬師は、ステージ上に平らに横たわります。次に、組織の端に4つの6 oh prolene Stay縫合糸を配置し、伸縮性のあるドレープで固定します。
この時点からクレマスター筋組織を広げるためには、1ミリリットルの注射器を使用して、PBSで組織を継続的に湿らせます。調製物を15分間休ませた後、微小血管系の造影剤増強のために、左大腿動脈を介して0.05〜0.1ミリリットルの1%ロジンデキストリンを注入します。.次に、マウスとステージを電荷結合デバイスの下に移動します。
ビデオカメラは、大腿動脈カテーテルを脱臼しないように特別な注意を払って、エピ照明用に改造された蛍光顕微鏡を接続しました。chma微小循環の十分な視覚化のために水浸対物レンズを調整した後、確率的に定義された6ポストキャピラリーESは、後で幹細胞の固い接着を分析するためのものです。次に、1ミリリットルの注射器に、以前に標識した蛍光ドナー骨髄幹細胞の200マイクロリットルをロードします。
シリンジを軽くたたいて蘇生し、細胞懸濁液を懸濁した後、大腿骨カテーテルを通して細胞を40マイクロリットルの注射で合計5回連続して投与します。細胞注入直後の幹細胞の転がりを記録します。ローリングとは、内皮内層に沿った細胞速度を50%以上減少させ、典型的な細胞スティックとリリースの動きと組み合わせ
ることと定義しています。生体内顕微鏡検査の終了後、火葬筋を慎重に取り外し、後で分析するために保管します。一般に、直接注入された幹細胞または前駆細胞と火葬場の微小循環内の血管内皮との相互作用はまれなイベントであり、蛍光標識のために毛細血管後でのみ発生します。黒矢印で示されたローリングセルと、白矢印で示された強固に付着した幹細胞は、esの循環内因性白血球と明確に区別できます。
血流速度と壁のせん断速度で表される微小循環条件は、通常、ケモカイン処理が異なるそれぞれの実験グループ間で有意差はありません。カーマスター筋組織の局所治療は、さまざまなケモカインまたは炎症反応のメディエーターによる。例えば、間質細胞由来の因子1αまたは腫瘍壊死因子αは、特定の微小環境条件を模倣することができる。
このような条件は、適用される特定のケモカインまたはメディエーター、および注入される幹細胞集団に応じて、幹細胞内皮細胞の相互作用をさまざまな程度に増強します。このビデオを見た後、CreER筋微小循環の生体内顕微鏡検査を通じて、幹細胞と細胞相互作用をin vivoで視覚化する方法を十分に理解できるはずです。
完全なトランスクリプトを表示し、数千本の科学動画にアクセス
概要
本研究では、生体イメージング（intravital microscopy）を用いて、マウスの M. cremaster 微小循環における幹細胞と内皮細胞の相互作用を解析します。この手法は、末梢骨髄幹細胞の遊走を調査するための標準化された in vivo モデルを提供します。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 再生医療
- 細胞生物学
背景
- 幹細胞の遊走を理解することは、再生医療において極めて重要です。
- 生体内顕微鏡（イントラバイタル顕微鏡）を用いることで、細胞間相互作用のリアルタイムでの可視化が可能になります。
- マウスの陰嚢挙근（cremaster）微小循環は、これらの研究において効果的なモデルとなります。
- これまでの研究により、幹細胞の挙動における内皮細胞との相互作用の重要性が明らかにされています。
研究目的
- 生体内で幹細胞と血管内皮細胞の相互作用を可視化すること。
- 生体内の幹細胞の遊走を定量化すること。
- 再生医療分野における重要な課題に取り組むこと。
使用した手法
- 動脈内アクセスを目的とした、鎮静化マウスにおける大腿動脈のカテーテル留置。
- 生体内蛍光顕微鏡観察のための、クロマ筋の外科学的準備。
- 大腿動脈カテーテルを介した幹細胞集団の注入。
- 内皮細胞と幹細胞の相互作用の可視化および定量化。
主な結果
- 幹細胞と血管内皮細胞の相互作用をリアルタイムで可視化することに成功した。
- 幹細胞の遊走パターンに関する定量的データを取得した。
- 幹細胞の遊走における調節機構についての知見を得た。
- 再生医療の向上に向けた潜在的な影響が示唆された。
結論
- 生体内顕微鏡技術は、幹細胞のダイナミクスを研究するのに有効です。
- このモデルにより、生体内における幹細胞の挙動への理解を深めることができます。
- 得られた知見は、将来の再生医療戦略に寄与する可能性があります。
よくある質問
産業界における重要性
マウス陰嚢挙筋の微小循環における生体内顕微鏡観察により、幹細胞と血管内皮細胞の相互作用をin vivoで直接可視化および定量化することが可能となり、再生医療における末梢幹細胞遊走の理解における重要な課題が解決されます。このアプローチは、ケモカインが媒介する動員および接着プロセスのメカニズム的な洞察を提供し、初期創薬における標的バリデーションや予測モデリングを支援します。再現性のあるin vivoモデルを確立することで、幹細胞の挙動予測に対する信頼性が高まり、前臨床開発における意思決定（go/no-go判断）に有用な情報を提供します。
バイオ医薬品R&Dにおける戦略的応用
初期探索およびターゲットバリデーション
- 科学的価値：生理学的に適切な微小環境において、幹細胞のリクルートメカニズムおよび経路の解明に関する治療仮説の検証を可能にする。
- 運用的価値：血管内皮との相互作用の機能的読み出しとして、ローリングおよび強固な接着イベントを定量化することで、生物学的なリスク低減をサポートする。
- 予測的価値：幹細胞の遊走パターンに関する定量的なデータを生成し、ポートフォリオの選別および再生医療候補物質のメカニズム的なリスク低減に寄与する。
スクリーニングおよびアッセイの開発
- アッセイの準備：幹細胞と血管内皮細胞の相互作用分析のための標準化された条件を確立し、下流のワークフローに向けて検証済みの生物学的システムを準備します。
- 再現性：ケモカインの制御された超灌流と一貫した微小循環読み取りにより、アッセイの標準化を実現します。
- 拡張性：同一のイメージング条件下で、複数の幹細胞集団や微小環境調節因子を評価するためのプラットフォームの再利用可能性を強調します。
翻訳および前臨床研究
- 疾患との関連性：組織修復および再生医療への応用に不可欠な末梢幹細胞の遊走をモデル化することで、発見から前臨床検証までの継続性について議論する。
- リスク調整後の進展：特定のケモカイン処理（例：SDF-1α、TNF-α）下で観察された相互作用が、どのようにバイオマーカーの整合性と前臨床モデルにおける予測精度の向上を裏付けるかを述べる。
- メカニズムによるリスク低減：微小環境の前提条件と幹細胞動員効率を関連付けることで予測価値に焦点を当て、トランスレーショナルなバイオマーカー戦略に情報を供する。
パイプラインおよびワークフローの統合
この手法は、ターゲットの検証からリード化合物の同定、そして前臨床研究に至る創薬の連続的なプロセスに組み込まれ、生体システム内における幹細胞の挙動をリアルタイムかつ定量的に読み取ることができます。
- 探索生物学：この手法が、内皮細胞との相互作用ダイナミクスを介した幹細胞遊走調節の仮説検証および経路の解明をどのようにサポートするかを説明します。
- スクリーニング：精巣上体筋の標準化された調製と、ローリングおよび接着幹細胞の定量的可視化によるアッセイの準備について述べます。
- 分析：実験条件を比較するための定義された出力として、細胞速度の低下（>50%）やスティック・リリース動作などの測定値を強調します。
- トランスレーショナルリサーチ：組織特異的なホーミングに関連する、幹細胞リクルートに対するケモカイン介在効果の評価を可能にすることで、この手法を前臨床の連続性に結びつけます。
- 企業での再利用：様々なケモカインや細胞タイプへの適応性が高いため、複数のプロジェクトにわたる幹細胞製品や調節剤のスクリーニングに再利用可能な能力としてこの手法を位置づけます。
運用および企業への影響
- 科学的価値： 幹細胞の遊走メカニズムにおける予測精度の向上、血管内皮相互作用経路のターゲット検証、再生メカニズムにおける機序的な不確実性の低減。
- 運用的価値： 外科的準備およびイメージングプロトコルの標準化、微小循環条件の再現性確保、複数の変数を検証するためのスケーラビリティ。
- 戦略的価値： 定量的な相互作用データに基づく意思決定（go/no-go判断）の適正化、早期のリスク低減による資本効率の向上、細胞治療開発における後期の生物学的リスクの低減。
- ポートフォリオへの影響： 定義された微小環境条件下での内皮細胞への結合効率に基づく、幹細胞候補のリスク調整後優先順位付け。
実施上の検討事項
- カテーテル挿入および組織調製を成功させるには、微小外科手術、生体内顕微鏡観察、および蛍光細胞標識に関する専門知識が必要です。
- 装置として、生理学的条件を維持するための落射照明付き蛍光顕微鏡、水浸対物レンズ、および温度制御ステージが必要です。
- チーム間での標準化のため、ローリング（速度が50%以上低下）および強固な接着の基準について、操作者や施設を問わず一貫した定義が必要です。
- 適応上の検討事項として、異なる幹細胞集団およびモデル系に合わせて、ケモカインの灌流濃度および注入量を最適化することが挙げられます。
- 実用上の制限として、微小循環における幹細胞と内皮細胞の相互作用が稀であること、および内因性白血球と明確に区別するために蛍光標識に依存することが挙げられます。
