末梢血幹細胞移動の解析のためのマウス精巣挙筋で微小循環の生体顕微鏡

マウスのM.精巣挙微小循環の生体顕微鏡は、ユニークと周辺の骨髄幹細胞の移動を解析するための生体モデルでよく標準化されています。

この手順の全体的な目標は、in vivo で幹細胞内皮細胞の相互作用を視覚化することです。これは、最初に大腿動脈カテーテルを鎮静剤を投与した動物に導入し、動脈内アクセスを行うことで達成されます。第2ステップでは、彩度筋は生体内蛍光顕微鏡検査のために外科的に準備されます。

次に、目的の幹細胞集団を大腿動脈カテーテルを介して注入します。最終的には、養子縁組移植された幹細胞とマスター筋微小循環の内皮との間の相互作用を視覚化し、定量化することができます。この方法は、治療用幹細胞の生体内での移動がどのように制御されているかなど、再生医療分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。

マイクロサージェリーDエアを開始する前に、カテーテルを0.9%塩化ナトリウムの1ミリリットルのシリンジに接続しました。次に、20〜25ミリグラムの麻酔をかけた雄マウスの右大腿部と鼠径部だけでなく、右陰嚢の前面を優しく剃ります。湿らせた綿棒ですべての抜け毛を集め、次にマウスの腹側を上にして、ベースプレートとベースプレートのコドルエッジにある2番目のプレートで構成されるプレキシガラスのカスタムメイドの視聴ステージに置きます。

伸縮性のあるドレープで足を固定した後、ステージを温熱パッドに置き、動物の体温を摂氏37度に保ちます。次に、10〜16倍の倍率を使用して、解剖顕微鏡とハサミを使用して、膝から鼠径部までの大腿骨血管のすぐ前方にある右大腿部に最初の切開を行います。大腿動脈を特定し、それを近位にたどり、周囲の軟部組織から動脈を動員します。

次に、サーモ焼灼を使用して、左睾丸につながる大きな動脈枝を特定して切断します。左の睾丸の表面に6 oh proleneステー縫合糸を配置します。次に、大腿部で内側に走る大きな動脈枝を特定し、熱焼灼します。

次に、穏やかな牽引力を使用して、右大腿部の遠位部分で大腿動脈を結紮し、次に近位大腿動脈の周囲に動物のできるだけ中心に近い縫合糸を留置します。次に、大腿動脈の周りに緩い結び目を置きますが、結ばないでください。次に、縫合糸に穏やかな牽引力を加えて、動脈のねじれを作り出します。

ねじれを確認したら、マイクロハサミを使用して動脈のサイズを慎重に調整し、大腿静脈を傷つけないように特別な注意を払います。次に、事前に準備したマイクロカテーテルを切開部に挿入します。カテーテルの通過を容易にするために、ねじれを慎重に緩めます。

動脈血流はカテーテル内ですぐに見えるはずです。カテーテルを前のねじれから数ミリメートルゆっくりと進めます。次に、準備した結紮糸を結んでカテーテルを固定します。

次に、カテーテルを塩化ナトリウムで静かに洗い流し、溶液を吸引してカテーテルの正しい位置を確認します。テープを使用して、カテーテルを手術段階にさらに固定します。カテーテルが適切に固定され、脇に移動した後、右陰嚢の腹側側面の上の皮膚と筋膜を切断します。

器具で下にある組織に触れないように注意してください。切開部を鼠径部のひだまで伸ばし、陰嚢の遠位端までこっそりと伸ばします。次に、組織自体に触れることなく、クレマスター嚢の上にある下にある軟組織と結合組織を慎重に分離します。

次に、クレマスターの遠位端に6 oh proleneステー縫合糸を配置して、筋肉をわずかに伸ばします。次に、筋肉をそっと前方に引っ張って、筋嚢の下に残っている軟組織を切除します。結合組織から完全に分離した後、ハサミを使用して頭蓋端のCマスター嚢を開き、この開口部から筋肉の遠位端まで切開部を伸ばします。

火葬場の睾丸をつなぐ小さな血管を熱焼灼した後、はさみを使って筋肉と睾丸の間の残りの接続を切ります。開いた火葬師は、ステージ上に平らに横たわります。次に、組織の端に4つの6 oh prolene Stay縫合糸を配置し、伸縮性のあるドレープで固定します。

この時点からクレマスター筋組織を広げるためには、1ミリリットルの注射器を使用して、PBSで組織を継続的に湿らせます。調製物を15分間休ませた後、微小血管系の造影剤増強のために、左大腿動脈を介して0.05〜0.1ミリリットルの1%ロジンデキストリンを注入します。.次に、マウスとステージを電荷結合デバイスの下に移動します。

ビデオカメラは、大腿動脈カテーテルを脱臼しないように特別な注意を払って、エピ照明用に改造された蛍光顕微鏡を接続しました。chma微小循環の十分な視覚化のために水浸対物レンズを調整した後、確率的に定義された6ポストキャピラリーESは、後で幹細胞の固い接着を分析するためのものです。次に、1ミリリットルの注射器に、以前に標識した蛍光ドナー骨髄幹細胞の200マイクロリットルをロードします。

シリンジを軽くたたいて蘇生し、細胞懸濁液を懸濁した後、大腿骨カテーテルを通して細胞を40マイクロリットルの注射で合計5回連続して投与します。細胞注入直後の幹細胞の転がりを記録します。ローリングとは、内皮内層に沿った細胞速度を50%以上減少させ、典型的な細胞スティックとリリースの動きと組み合わせ

生体内顕微鏡検査の終了後、火葬筋を慎重に取り外し、後で分析するために保管します。一般に、直接注入された幹細胞または前駆細胞と火葬場の微小循環内の血管内皮との相互作用はまれなイベントであり、蛍光標識のために毛細血管後でのみ発生します。黒矢印で示されたローリングセルと、白矢印で示された強固に付着した幹細胞は、esの循環内因性白血球と明確に区別できます。

血流速度と壁のせん断速度で表される微小循環条件は、通常、ケモカイン処理が異なるそれぞれの実験グループ間で有意差はありません。カーマスター筋組織の局所治療は、さまざまなケモカインまたは炎症反応のメディエーターによる。例えば、間質細胞由来の因子1αまたは腫瘍壊死因子αは、特定の微小環境条件を模倣することができる。

このような条件は、適用される特定のケモカインまたはメディエーター、および注入される幹細胞集団に応じて、幹細胞内皮細胞の相互作用をさまざまな程度に増強します。このビデオを見た後、CreER筋微小循環の生体内顕微鏡検査を通じて、幹細胞と細胞相互作用をin vivoで視覚化する方法を十分に理解できるはずです。