Name: 末梢血幹細胞移動の解析のためのマウス精巣挙筋で微小循環の生体顕微鏡 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-05T18:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 36 s
Description: 学ぶマウス精巣挙筋の生体顕微鏡法による末梢血幹細胞と血管内皮細胞の相互作用の可視化と定量化。この手法は再生医療における幹細胞動態の理解に貢献します。

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細胞単離後、プロトコル全体で約2時間かかります。 1。顕微準備<ol><li>標準化されたプロトコル9,12に係るドナー骨髄および単離された亜集団の蛍光標識からの幹細胞の単離を行う細胞は、動物の動作が行われる時間の間休止することを許可する。蛍光標識のために我々はCFDA（カルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル）をお勧めします。 </li><li>ケタミン（75 mg / kgで）およびキシラジン（2.5 mg / kg）を用いて体重20〜25gの雄マウ​​スを麻酔。外科的手順および実験プロトコール全体を通して、麻酔補助剤によって維持されるべきである（最初の注射の10％、腹腔内）必要に応じて（通常、毎分30〜60）。 </li><li>そっと右陰嚢の前面だけでなく、右太ももと脚の付け根を剃る。すべては湿らせた綿棒で髪を失って収集しています。プレキシガラスの観察ステージ上でマウスの腹側を上に置き、手数料を修正弾性ドレープを使用してT。ステージは、脚と陰嚢の両方を昇降するためのベースプレートの尾側端でベース板と第2板からなる、カスタムメイドされている。 37℃の体温を維持するために加温パッド上にステージを配置ステージ上で固定後、手術用顕微鏡の下で動物を配置し、10を使用して、以下の操作手順を実行します - 16倍の倍率に。 </li><li>鼠径部にまで右太もも、膝から大腿血管のちょうど前方の皮膚のはさみを使って最初の切開を行います。 </li><li>大腿動脈を特定し、周囲の軟組織から動脈を動員し、近位にそれに従ってください。焼灼器を使用して、左睾丸への大規模なブランチを特定し、カット。その後、左睾丸で表面的に滞在縫合を置く。穏やかな牽引力は、大腿動脈の近位のさらなる動員を促進する。 </li><li>近位の動員が完了した後、識別し、大規模なブランチをカット実行中mediall焼灼器による大腿部のY。その後、右大腿部の遠位部での大腿動脈を結紮。合字にやさしい牽引、さらに準備を支援します。 </li><li>再び近位大腿動脈に今の目を向けるなど近位にできるだけ動脈の周りに縫合糸を配置します。結び目を準備しますが、まだそれを接続しないでください。縫合糸に優しいトラクションを適用し、動脈よじれを作成します。 </li><li>よじれを確立した後、動脈が慎重にmicroscissorを使用している切開。大腿静脈を損傷しないように特に注意してください。 </li><li>切開を介して製造マイクロカテーテル（内径0.28ミリメートル）を挿入します。カテーテルは、（0.9％塩化ナトリウム、NaCl）を脱気し、1 mlシリンジ挿入の前に接続されなければならない。 </li><li>カテーテルの挿入が成功した後、慎重にカテーテルの通過を容易にするために、ねじれを緩めます。動脈血流は、カテーテル内ですぐに表示されるはずです。優しくカテーテルを数ミリメートルを進める前のよじれを超えてS。その後、カテーテルの固定のために準備合字を縛り付ける。 </li><li>そっと正しい位置を確認するために、カテーテル（0.9％NaCl）にして吸引をフラッシュします。さらに運用段階にカテーテルを固定するためにテープの一部を使用してください。 </li><li>十分な固定後、精巣挙筋の次の準備ステップのために取ってカテーテルを入れた。血栓形成を防止するため、定期フラッシングとカテーテルごとに5〜10分間の吸引を適用します。 </li><li>右陰嚢に今注目を回して、右陰嚢の腹側面上の皮膚および筋膜を切断することによって切開する。どんな機器とその下の組織に触れないように注意してください。 </li><li>陰嚢の先端に鼠径倍と尾側まで切開を拡張します。 </li><li>それに触れることなく、精巣挙袋上記の基本的なソフトで結合組織を慎重に分離します。精巣挙の先端部を特定し、SLにここに滞在縫合を配置ightly筋肉を伸ばす。優しく尾側と前方の筋肉を引っ張って筋肉の袋の下に今残っている軟組織を切除。 </li><li>結合組織から完全に分離した後、ハ​​サミで頭蓋端に1点で精巣挙袋を開きます。筋肉の先端部に、この開口部から下に切開を延長する。 </li><li>その後、はさみを使って筋肉と精巣の間の残りの接続を切る、焼灼器を使用して睾丸と精巣挙をつなぐ小さな容器を密閉する。 </li><li>顕微鏡分野のうち、睾丸を脇に置きます。 </li><li>開かれた精巣挙は今、ステージの上に平らに産む。精巣挙筋組織を広げるために、組織の端に4 6-0プロレン滞在縫合糸を配置し、弾性ドレープでそれらを修正。これから連続的に1mlシリンジ（ 図1）を用いてリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で組織を湿ら。 </li><li>今15分間休む調製を可能にする。その後注入微小血管のコントラスト強調のため左大腿動脈を介して、1％ローダミン-デキストラン0.05〜0.1 mlである。任意のケモカインや炎症剤がアプリケーションのために計画されている場合は、ここで局所的に1ミリリットルの注射器を使用して、それぞれの試薬で筋肉を湿らすべきである。対照実験の場合には、PBSで湿らせ続ける。 </li></ol> 2。生体顕微鏡検査<ol><li>操作ステージに固定されたマウスを維持し、落射照明用に変更し、CCD（電荷結合素子）ビデオカメラに接続され、蛍光顕微鏡下で移動する。大腿動脈カテーテルを脱臼しないよう特に注意してください。 </li><li>水浸対物レンズを用いて実験を行う。 </li><li>精巣挙微小循環の十分な視覚化のために、細胞の注射の前に目標を調整した後、確率的にしっかりした幹細胞の接着の後の分析のために6毛細血管細静脈を定義します。 </li><li>蛍光標識された幹細胞を投与し、大腿動脈カテーテルを利用して5つの連続した注射剤との合計1mlシリンジで、注射当たり0.4×10 6個の細胞で、200μlのPBSに溶解した。慎重に最初の注射前に細胞サンプルを振る。 </li><li>レコードの幹細胞は、それによって典型的なセルラと組み合わせた内皮内層に沿った細胞の速度の50％以上の減少として「ローリング」を定義する、細胞注射の直後にローリング」棒と解放」運動を。ローリング幹細胞の計数およびすべての単一の注射後の観察の1分の間に事前定義された細静脈の距離を通過するすべての幹細胞を実行します。幹細胞ローリングの量は全て通過する細胞の割合として表される。ローリング細胞のようなランダムな簡単なテザリング現象を示す細胞をカウントされません。 </li><li>最後のセルの注射後の計数でしっかりと接着性幹細胞の数を決定し、目の計算された内皮表面に関連して金額を表現接着細胞/ mm 2のようなE 6事前定義された細静脈（直径×長さ×π）。まだ細胞運動が30秒間検出されないときに強固な接着が考えられる。 </li><li>生体顕微鏡が完了した後、慎重に精巣挙筋を取り外し、後で分析（免疫組織化学や分子生物学）に対応して保管してください。頚椎脱臼により動物を生け贄に捧げる。幹細胞のローリングと企業内皮接着、ならびに赤血球速度（100mm /秒）、血管長さ（μm）、血管径（μm）を、壁のシェア率などの微小血管血行動態の定量化のための生体顕微鏡記録の解析（秒-1）;画像処理ソフトを利用し、それぞれの実験組織処置を知らされていない研究者がオフラインで実行する必要があります。 </li></ol>

<ol><li>Madlambayan, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((marrow+stem+and+progenitor+cell+contribution+to+neovasculogenesis+is+dependent+on+model+system+with+SDF-1+as+a+permissive+trigger%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">marrow stem and progenitor cell contribution to neovasculogenesis is dependent on model system with SDF-1 as a permissive trigger.</a> Blood. 114, 4310-4319 (2009).</li>
<li>Lapidot, T., Dar, A., Kollet, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+do+stem+cells+find+their+way+home%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">How do stem cells find their way home?</a> Blood. 106, 1901-1910 (2005).</li>
<li>Lehr, H. A., Vollmar, B., Vajkoczy, P., Menger, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+fluorescence+microscopy+for+the+study+of+leukocyte+interaction+with+platelets+and+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Intravital fluorescence microscopy for the study of leukocyte interaction with platelets and endothelial cells.</a> Methods Enzymol. 300, 462-481 (1999).</li>
<li>Gavins, F. N., Chatterjee, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy+for+the+study+of+mouse+microcirculation+in+anti-inflammatory+drug+research%3A+focus+on+the+mesentery+and+cremaster+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Toxicol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy for the study of mouse microcirculation in anti-inflammatory drug research: focus on the mesentery and cremaster preparations.</a> J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 49, 1-14 (2004).</li>
<li>Leister, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+peritoneal+cavity+chamber+for+intravital+microscopy+of+the+liver+under+conditions+of+pneumoperitoneum%5BTitle%5D)+AND+%22Surg.+Endosc%22%5BJournal%5D)">A peritoneal cavity chamber for intravital microscopy of the liver under conditions of pneumoperitoneum.</a> Surg. Endosc. 17, 939-942 (2003).</li>
<li>Sriramarao, P., Anderson, W., Wolitzky, B. A., Broide, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+bone+marrow-derived+mast+cells+roll+on+P-selectin+under+conditions+of+flow+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">Mouse bone marrow-derived mast cells roll on P-selectin under conditions of flow in vivo.</a> Lab Invest. 74, 634-643 (1996).</li>
<li>Baez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+open+cremaster+muscle+preparation+for+the+study+of+blood+vessels+by+in+vivo+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc.+Res%22%5BJournal%5D)">An open cremaster muscle preparation for the study of blood vessels by in vivo microscopy.</a> Microvasc. Res. 5, 384-394 (1973).</li>
<li>Bagher, P., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+cremaster+muscle+preparation+for+intravital+imaging+of+the+microcirculation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">The mouse cremaster muscle preparation for intravital imaging of the microcirculation.</a> J. Vis. Exp. , e2874(2011).</li>
<li>Kaminski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+NOS+is+required+for+SDF-1alpha%2FCXCR4-mediated+peripheral+endothelial+adhesion+of+c-kit%2B+bone+marrow+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">Endothelial NOS is required for SDF-1alpha/CXCR4-mediated peripheral endothelial adhesion of c-kit+ bone marrow stem cells.</a> Lab Invest. 88, 58-69 (2008).</li>
<li>Furlani, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HMGB-1+induces+c-kit%2B+cell+microvascular+rolling+and+adhesion+via+both+toll-like+receptor-2+and+toll-like+receptor-4+of+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">HMGB-1 induces c-kit+ cell microvascular rolling and adhesion via both toll-like receptor-2 and toll-like receptor-4 of endothelial cells.</a> J. Cell Mol. Med. 16, 1094-1105 (2012).</li>
<li>Furlani, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+the+intravascular+administration+of+mesenchymal+stem+cells+safe%3F+Mesenchymal+stem+cells+and+intravital+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Is the intravascular administration of mesenchymal stem cells safe? Mesenchymal stem cells and intravital microscopy.</a> Microvasc. Res. 77, 370-376 (2009).</li>
<li>Donndorf, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysing+migratory+properties+of+human+CD+133%28%2B%29+stem+cells+in+vivo+after+intraoperative+sternal+bone+marrow+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Analysing migratory properties of human CD 133(+) stem cells in vivo after intraoperative sternal bone marrow isolation.</a> Cell Transplant. , (2012).</li>
</ol>

この原稿のために行った全ての動物実験は、地元の動物管理使用委員会によって承認されている。 著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

<html>生体内蛍光顕微鏡検査は、直接視覚化および幹細胞、内皮相互作用の定量的な分析を可能にする。顕微露光および生体内視覚化技法はよく白血球 - 内皮相互作用および種々の化学成分の研究の間に選択的に単純な表面灌流技術によって標的組織に適用することができる確立されたので、精巣挙筋モデルは、特に有用である。による動きアーチファクトおよび重度画像ノイズが存在しないため、この特定のモデルは、他の生体内顕微鏡検査の設定値と比較して、細胞 - 細胞相互作用の視覚化のための最適条件を提供する。 モデルは、生体内で行われる初期の幹細胞動員のために、不可欠な微小環境の前提条件を明らかにすることができます。必要であれば、内因性白血球を検証するための陽性対照として機能し、幹細胞の挙動の原理を証明することができる。 jove_contentは&quot;&gt;急性動物モデルを表現し、代わりに、静脈アプリケーションの直接動脈注入を利用して、慢性の細胞遊走モデルおよび/ ​​または全身の細胞送達の潜在的な限界-による遠隔臓器内の挟み込みに、例えば細胞の損失は-他には回避することが...

本資料の目的は、末梢骨髄幹細胞の移動の直接観察および分析のためのマウス精巣挙筋の微小循環に塗布生体顕微鏡（IVM）の技術を記述することである。 幹細胞に基づく組織および臓器再生の現在の概念は、損傷組織1に骨髄由来幹細胞のホーミングを含む。成功した幹細胞の移動のための重要なステップは、経内皮移動、最終的には、臓器移植の2に続いて負傷した臓器内のローカル内皮と細胞の相互作用幹が含まれています。これらの幹細胞の生体内分析-内皮細胞相互作用は、 インビボで異なる病態生理学的な設定での幹細胞に基づく再生応答の定量のために理想的なパラメータを形成する。さらに、それは、考えられる思われる、将来的には、特定の幹細胞pの遊走能の生体内分析標準化された微小環境内opulationsは、さらなる臨床試験をこれらの集団を進める前に適用される可能性があります。 生体顕微鏡は、最初は炎症研究3分野におけるin vivoでの白血球-内皮細胞相互作用を観察し、定量化のために開発されました。生体顕微鏡研究の最初の成功の記録は、光学顕微鏡4の下にカエル」舌や腸間膜を勉強し、19世紀にはすでにコーンハイムから報告された。その最初の使用IVMは、驚異的な技術開発、今日を受けているので、ある種の必須成分は、定量IVMを行うために前提条件を形成は、（i）組織の光アクセスを可能にする製剤、（ii）は、顕微鏡によって検出できる分子プローブ、（三）検出システム、画像データから関心対象のパラメータを抽出することができる（iv）のコンピュータベースの分析システムに接続された顕微鏡4を設定します。 組織標本の様々な腸間膜およびマウスおよびラット5、マウス6、ハムスター、ウサギの耳といくつか例を挙げると、ハムスターの頬袋の背側皮下脂肪チャンバーの肝臓を含むIVM研究のために導入されている。 準備と可視化が十分に標準化された外科的手技によって可能であり、一般的には運動の成果物に問題が発生しないようにただし、次の年には、生体内の観察のための理想的な組織を代表する、マウスの精巣挙筋に焦点を当てます。オープン精巣挙筋標本はバエズや同僚7によって1970年に初めて実施された。当初のラットについて記載し、それはマウス8にも正常に採用されている。これまでの研究は、主に血管壁と白血球の相互作用に焦点を当てた後、私たち自身のグループは最近、評価引当として、マウス精巣挙筋標本を導入直接可視化し、定義微小環境9内の幹細胞内皮相互作用の定量分析のためのBLEツール。様々な幹細胞亜集団は、マウスのc-kit +骨髄幹細胞および間葉系幹細胞、ならびにヒトCD 133 +骨髄幹細胞を10〜12を含む、このモデルを用いて研究されている。ドナー骨髄および可視化のための蛍光標識からの細胞単離後に、幹細胞は、選択的に遠隔の臓器内の任意の細胞の捕捉を回避し、大腿動脈を介して動脈注入を利用して精巣挙筋の微小循環に適用される。潜在的に、それぞれの設定値内の局所幹細胞の遊走を媒介する種々のケモカインは、単純な局所灌流法により標的組織に適用することができるので、精巣挙筋モデルが特に有用である。

<table><tbody><tr><td>カルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル (CFDA)</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA, USA</td><td>C1157</td><td></td></tr><tr><td>ローダミン 6 G (1%)</td><td>Sigma-Aldrich, Munich, Germany</td><td>83697</td><td></td></tr><tr><td>Ketamin (Ketanest)</td><td>Pfizer, Berlin, Germany</td><td>利用不可</td><td></td></tr><tr><td>キシラシン (Rompun)</td><td>Bayer, Leverkusen, Germany</td><td>利用不可</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコのリン酸塩 - 緩衝生理食塩水(PBS)</td><td>PAN Biotech、アイデンバッハ、ドイツ</td><td>P04-36500</td><td></td></tr></tbody></table>

末梢血幹細胞移動の解析のためのマウス精巣挙筋で微小循環の生体顕微鏡

Intravital Microscopy of the Microcirculation in the Mouse Cremaster Muscle for the Analysis of Peripheral Stem Cell Migration

再生細胞治療の文脈における血管細胞のアプリケーションプロトコルの時代において、nonmarrow組織への幹細胞の遊走の基礎となるメカニズムは完全に解明されていない。ここでは、インビボで周辺の骨髄幹細胞の遊走の分析のためのマウスの精巣挙筋の微小循環に適用される生体顕微鏡の技術を記載している。 M.の精巣挙の生体顕微鏡は、以前の血管内皮と白血球の相互作用を直接観察するための炎症研究の分野で導入されている。十分な末梢幹細胞および前駆細胞の移動は、それを裏打ちする内皮に接着沿ってしっかりと圧延同様の初期ステップを含んでいるので内皮とintravasculary投与幹細胞の相互作用の観察および定量化のためM.精巣挙モデルを適用することが考えられる。様々な化学成分を選択的に標的tに適用することができるように初期の幹細胞の動員、骨髄外、生体内の場所を取るための単純な灌流技術による問題は、それが、本質的な微小環境の前提条件を確立することが可能である。

一般的には、精巣挙筋の微小循環内の血管内皮と直接注入幹細胞または前駆細胞の相互作用はまれな事象であると毛細血管細静脈（直径30〜80ミクロン）で独占的に発生します。による蛍光標識圧延しっかりと付着幹細胞に明らかに観察細静脈（ 図2）における内因性白血球の循環から分離して定量化することができる。 血流速度と壁剪断速度で表される微小循環条件は、通常、異なるケモカイン処置（ 表1）を用いて各実験群の間で有意に異ならない。 炎症応答の異なるケモカインまたはメディエーターとの精巣挙筋組織の局所治療、 例えば SDF-1α（間質細胞由来因子-1α）またはTNF-α（腫瘍壊死因子-α）は、特定のマイルを模倣することが可能であるcroenvironmental条件。このような条件は、特定のケモカイン/メディエーターに応じて、異なる量の幹細胞-内皮細胞相互作用を増強適用し、幹細胞集団（ 図3）12 <su...

マウスのM.精巣挙微小循環の生体顕微鏡は、ユニークと周辺の骨髄幹細胞の移動を解析するための生体モデルでよく標準化されています。

In the era of intravascular cell application protocols in the context of regenerative cell therapy, the underlying mechanisms of stem cell migration to ...

この手順の全体的な目的は、生体内（in vivo）における幹細胞と血管内皮細胞の相互作用を可視化することです。まず、鎮静化した動物の大腿動脈にカテーテルを挿入し、動脈内へのアクセス経路を確保します。次に、生体内蛍光顕微鏡観察に向けて、クロマ筋肉を外科的に準備します。次に、目的の幹細胞集団を大腿動脈カテーテルから注入します。最終的に、養育的に移入された幹細胞と主筋肉微小循環の内皮との相互作用を可視化し、定量化することができます。この手法は、「治療目的で投与された幹細胞の生体内での遊走はどのように制御されているのか」といった、再生医療分野における重要な疑問への回答に寄与します。マイクロサージェリーを開始する前に、0.9% sodium chlorideを満たした1 mLシリンジにカテーテルを接続します。次に、麻酔をかけた20～25 mgの雄マウスの右陰嚢前面、および右大腿部と鼠径部を、優しく除毛します。湿らせた綿棒で抜け落ちた毛をすべて拭き取り、その後、マウスを腹側が上になるように、ベースプレートと、両後肢および陰嚢を挙上させるためのベースプレート端に配置された第2プレートからなる、特製のアクリル製観察ステージの上に置きます。弾性ドレープで足を固定した後、ステージをヒートパッドの上に置き、動物の体温を37 °Cに維持します。次に、10〜16倍の倍率で解剖顕微鏡と鋏を用い、膝から鼠径部にかけて、大腿血管の直前方の右大腿部に最初の切開を加えます。大腿動脈を特定し、周囲の軟組織から動脈を剥離しながら近位に向かって追跡します。次に、電気焼灼器を用いて、左精巣に至る太い動脈分枝を特定して切断します。左精巣の浅層に6-0 Proleneの保持縫合糸を留置します。その後、大腿部内側を走行する太い動脈分枝を特定し、電気焼灼します。次に、緩やかに牽引しながら、右大腿部の遠位側で大腿動脈を結紮し、次いで動物の中心にできるだけ近い大腿動脈の近位側に縫合糸をかけます。ここで、大腿動脈に緩い結び目を作りますが、締め付けないでください。その後、縫合糸を緩やかに牽引して、動脈にキンキング（折れ曲がり）を作ります。キンキングを形成した後、マイクロ scissors を使用して慎重に動脈のサイズを調整します。この際、大腿静脈を損傷させないよう十分に注意してください。次に、あらかじめ準備したマイクロカテーテルを切開部に挿入します。カテーテルが通過しやすいよう、慎重にキンキングを緩めてください。カテーテル内に動脈血流がすぐに確認できるはずです。カテーテルを、以前に屈曲していた箇所からさらに数ミリメートルゆっくりと進めます。その後、準備しておいた結紮糸でカテーテルを固定します。次に、カタテットに塩化ナトリウムを緩やかに注入し、その後、溶液を吸引してカタテットが正しい位置にあることを確認します。テープを使用して、カタテットを手術台にさらに固定します。カタテットを十分に固定して脇に寄せた後、右精嚢の腹側の上方にある皮膚と筋膜を切開します。器具が下層組織に触れないよう注意しながら、切開線を鼠径折襞まで、そして慎重に陰嚢の遠位端まで延長します。次に、組織自体に触れないように注意しながら、精索膜上の軟組織および結合組織を慎重に剥離します。次に、精索挙筋の遠位端に6-0 Proleneの保持縫合を行い、筋肉をわずかに伸展させます。続いて、筋肉を優しく尾側および前方へ牽引し、筋嚢の下にある残りの軟部組織を切除します。結合組織から完全に分離した後、ハサミを用いて精索挙筋嚢の頭側端を開口させ、この開口部から筋肉の遠位端まで切開線を延長します。提精筋上の精巣を繋いでいる小血管を熱凝固させた後、ハサミを用いて筋肉と精巣の間の残りの結合部を切断します。これにより、開いた提精筋がステージ上に平らに置かれます。次に、組織の縁に6-0プロレンのステイサチャーを4箇所配置し、弾性ドレープで固定します。ここから精索筋組織を広げるため、1 mLシリンジを用いてPBSで組織を継続的に湿らせます。準備後15分間静置し、微小血管を造影するため、左大腿動脈から1%ロジンデキストリンを0.05〜0.1 mL注入します。次に、マウスとステージを電荷結合素子（CCD）の下に移動させます。エピ照明用に改造し、ビデオカメラを接続した蛍光顕微鏡を用い、大腿動脈カテーテルをずらさないよう細心の注意を払いながら観察を行う。水浸対物レンズを調整してchma微小循環を十分に可視化した後、後で幹細胞の強固な接着を解析するために、6つの毛細血管後静脈（ES）をランダムに定義する。次に、1 mLシリンジに、あらかじめラベル化した蛍光ドナー骨髄幹細胞 200 µLを充填する。シリンジを軽く叩いて細胞懸濁液を再懸濁させ、その後、大腿動脈カテーテルを通じて40 µLずつ計5回連続で細胞を投与します。細胞投与直後の幹細胞のローリングを記録します。なお、ローリングの定義は、内皮細胞層に沿った細胞速度が50%以上低下し、かつ細胞特有の接着と離脱の動きが組み合わさった状態とします。生体内顕微鏡観察の完了後、精索筋を慎重に摘出し、後の解析のために保存します。一般的に、精索筋の微小循環内において、直接注入された幹細胞または前駆細胞が血管内皮と相互作用することは稀であり、蛍光標識により、後毛細血管静脈においてのみ発生することがわかります。黒い矢頭で示されるローリング細胞と、白い矢印で示される強固に接着した幹細胞は、血管内を循環する内因性白血球とは明確に区別できます。血流速度および壁剪断率で表される微小循環状態は、通常、異なるケモカイン処理を施した各実験群間で有意な差はありません。異なるケモカインや炎症反応のメディエーターを用いて、骨格筋組織に局所処理を行います。例えば、ストローマ細胞由来因子1α（SDF-1α）や腫瘍壊死因子α（TNF-α）を用いることで、特定の微小環境条件を模倣することが可能です。このような条件は、投与される特定のケモカインやメディエーター、および注入される幹細胞集団に応じて、幹細胞と血管内皮細胞の相互作用をさまざまな程度に増強します。このビデオを視聴することで、CreERマウスの筋肉微小循環の生体内観察（イントラバイタル顕微鏡観察）を通じて、幹細胞と細胞の相互作用をin vivoで可視化する方法について十分な理解が得られるはずです。

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微小循環の観察のための新たな汎用性の高い方法が提示される。それは長期的な観察のため、およびpharmacophysiologicalまたは分子生物学的介入との組み合わせに適して考えられている。...

イントラ不可欠な顕微鏡による骨格筋のin vivo微小循環測定における

軟膜微小循環の時間的空間的血行動態および炎症性イベントに追従するように生体顕微鏡。...

クローズ頭蓋窓を使用してマウス脳の微小循環の生体顕微鏡

組織の準備を可視化し、生活の微小循環の実験的操作のために説明されています。麻酔雄マウスでは、薄く、非常に血管形成精巣挙筋は細動脈、毛細血管と細静脈を含む微小血管のネットワークを研究する生体顕微鏡検査用に準備されています。この製剤は、容易にラットとハムスターに適合されている。...

微小循環の生体内イメージングのためのマウス精巣挙筋の準備

Microiontophoresisは、マイクロピペットの内側と外側との間の電位の差に応答して、マイクロピペットからのイオンの動きを伴います。生物学的活性分子は、それによって電流に比例して配信されます。我々は、微小循環の内皮依存性血管拡張を研究するためにマイクロマニピュレーションと連携してアセチルコリンのmicroiontophoresisを示しています。...

微小循環の生体内蛍光イメージングのためのMicroiontophoresisとマイクロマニピュレーション

我々は、in vivoでの好中球走化性因子のソースに対応して好中球動員中に動的な好中球 -...

生体内ビデオ顕微鏡による組織内好中球腔内クロールを追跡、経内皮移動と走

精巣挙筋微小循環における毛細血管細静脈のデジタル生体蛍光顕微鏡では、白血球 -...

ラットの精巣挙筋の虚血再灌流障害における白血球 - 内皮相互作用のリアルタイムデジタルイメージング（IRI）

ここでは、血管の炎症や生きたマウスにおける血栓形成の間に活性化内皮上の異血小板、好中球の相互作用を可視化する蛍光生体顕微鏡の実験手法を報告する。この顕微鏡技術は、血管疾患の分子メカニズムを研究することが、病態生理学的な条件下での薬理学的薬剤をテストするためにも役立ちます。...

生きたマウスにおける血管炎症及び血栓形成の間に活性化内皮上に異型血小板、好中球の相互作用のリアルタイムイメージング

この簡略化されたマウスの腸間膜静脈の生体内顕微鏡検査は、白血球-内皮および血小板-白血球の相互作用を観察するためのさまざまな炎症モデルで使用できます。...

マウスの腸間膜静脈内の生体顕微鏡白血球 - 内皮及び血小板 - 白血球の相互作用

単球は、末梢動脈疾患のコンテキストでの arteriogenesis...

単球のホーミングと末梢動脈疾患のマウスモデルにおける腫瘍関連血管新生の生体顕微鏡

ここでは、マウスクレマスター筋の毛細管後小胞に対して生体内顕微鏡を行う方法を示す。炎症および敗血症の異なるモデル、特にケモカインおよびサイトカインによって誘発されるものに一般的に適用され、我々は誇張された筋白血球浸潤を伴うムスコロパシーの研究におけるその関連性を強調する。...

インビタル顕微鏡で評価されたマウスにおけるクレマスター筋の白血球浸潤

白血球および血小板の動員は、動脈形成中の側副動脈の効果的な成長に必要な必須成分を構成する。多光子顕微鏡は、動脈形成中の白血球の動員と血管外漏出を研究するために、 in vivoで...

マウス後肢モデルにおける動脈形成中の白血球動員モニタリングのための多光子生体内イメージング

学ぶマウス精巣挙筋の生体顕微鏡法による末梢血幹細胞と血管内皮細胞の相互作用の可視化と定量化。この手法は再生医療における幹細胞動態の理解に貢献します。

末梢血幹細胞移動の解析のためのマウス精巣挙筋で微小循環の生体顕微鏡

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