Name: クローズ頭蓋窓を使用してマウス脳の微小循環の生体顕微鏡 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-18T18:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: 学ぶマウス脳微小循環の生体顕微鏡法。クローズ頭蓋窓を用いて血流動態と炎症マーカーの動的変化を長期観察し、神経疾患における微小循環ダイナミクスを解明する強力な手法です。

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この作品は、LJMCに国立衛生研究所からの補助金R01 - HL87290、R01 - HL87290 - S1とR01 - AI082610によってサポートされていました。

1。開頭術 8〜10週齢のマウスの開頭術では、チタンのバーは、動物の頭部に配置されていないことを除いて、前述の1として事前に実行する必要があります。慢性頭蓋ウィンドウが注入された後、軟膜微小循環にも数ヶ月の検査を可能にする安定な製剤である。通常、我々は2〜3週間頭蓋窓の移植後に研究を行う。 2。生体顕微鏡検査<ol><li>開頭後の2〜3週間、体温をチェックしてから、マウスは軽く（誘導は4％、メンテナンスのため1〜2％）イソフルランで麻酔です。光麻酔は、実験手順の間に動物のストレスや不快感を防ぐために使用されます。 </li><li>動物は、定位固定フレームと慎重に耳のバーを使って安全に頭の上に腹臥位に配置されます。レベルは、右と左のレバーを使用して調整されます。中核体温は、加熱パッドを使用して維持されます。脳マラリアとマウスは低体温を開発しているので、温度設定は、各動物のために調整する必要があります。 </li><li>頭蓋窓上にカバースリップを静かに綿棒がウィンドウの下に鉱物油と容器のパノラマ画像で湿らせた綿棒でクリーニングされる実体顕微鏡の助けとデジタルカメラ（ニコンCOOLPIX 995、日本）で取得されます。画像は、印刷同定され、日付と血管径と赤血球（RBC）速度の測定のためのマップとして使用されますされています。 </li><li>マウスは、生​​体内顕微鏡ステージ（ライカ-マクベインカスタマイズ、サンディエゴ、CA）に転送されます。一滴の水がよく歯のアクリルで形成されるのを利用して頭蓋ウィンドウ上に配置され、フォーカスが調整されます。測定値は、20X（LUMPFL - WIR、開口数0.6、オリンパス）水浸対物レンズを用いて実施されています。同船舶は、そのベースラインのレベルへの直接の比較は小さなサンプル集団のための、より堅牢な統計を可能に実行できるように続いている。画像はデジタル低光を高速度カメラ（浜松ホトニクスC9300 - 221、日本）、またはビデオデッキのテープに接続された低光のアナログのカメラ（COHU 4815サンディエゴ、カリフォルニア州）（JVC、日本）、タイムスタンプが（縮小映像のビデオを使用してキャプチャされますシステム、ボイヤー、PA）とカラーモ​​ニター（PELCO、クロービス、CA）。テープが適切に記録を開始する前に識別、およびタイムスタンプは、このようなイベントが再コーディングされれるまでの期間を文書化することで、イベントの識別を可能にしています。 </li><li>船の最初のチェックは準備の質を評価するために作られ、血液はすべての血管に流れている場合。その後、測定しようとする船舶の選択が行われ、それは、異なる直径の細静脈と動脈を（私たちのマウス軟膜の準備で、ほとんどの船が20と80μmの間の範囲）が含まれますと、ウィンドウによって公開されているエリア内の別の場所をカバーする必要があります。細動脈と細静脈は、容易に容器の影響で血流（それが配布や血液を収集するかどうか）の方向をチェックすることによって区別す​​ることができます。我々の研究では、測定は12隻で行われます。測定する各スポットの正確な場所は、軟膜血管系の画像に注釈が付けられます。 </li><li>各スポットには、血管の直径は、画像のせん断装置（画像せん断、Vistaのエレクトロニクス、サンディエゴ、カリフォルニア州）2を用いて測定されます。スポットを選択すると、容器の画像が垂直位置に整列されており、反対の極端が並んでいると読書が文書化されるまで、画像は、傾斜が設定されます。この値は、レチクルキャリブレーションステージのマイクロメータ（エドモンドオプティクス社、バーリントン、NJ）を使用して、各特定の倍率のため、以前のキャリブレーションを実行することでマイクロメートルに変換することができます。 </li><li>各スポットは、赤血球の追跡のために少なくとも30秒間に記録されます。追跡のために、血液のサンプルを採取し、赤血球は、蛍光色素DILを（Molecular Probes社、カールスバッド、カリフォルニア州）カルボシアニンと〜0.4から0.5パーセント3の生体内濃度を得るために尾静脈から注入で標識されています。 、標識のない注入、緑色蛍光タンパク質を発現する原虫berghei ANKA（PBA）（CJジェンシーとAPウォーターズによって堆積PBA - GFP、マラリアの研究とレファレンス試薬リソースセンターMR4、マナサス、バージニア州からの寄付）に感染した動物にセルが必要です。ビデオ画像は、毎秒150フレームで記録されます。この速度は、最大8 mm / sに速度を測定するための1つのビデオフレームにセルのいずれかに6つのイメージを取得するために設定されていますビデオ画像は、アドビプレミア4.0ソフトウェアを使用してパソコンでデジタル化され、各セル画像のXY座標データはSigmaScanプロ4.0ソフトウェア（SPSSシカゴ、イリノイ州）4を使用して得られる。セルの位置は、訓練を受けた観察者の眼がどの、セルの中心の位置の良い推定を与えることが示されたことを考えると、画像解析によって手動ではなく、決定される一般的にhはほとんどの細胞の向きのために観察された最大蛍光の位置に対応しています。位置と速度の複数の測定は、各セルに対して行われ、平均赤血球速度を得るために平均化されます。 </li><li> RBCの速度測定がオフラインで実行されるときに、各マウスの総観測時間は、麻酔のcardiodepressiveの影響を最小限に10〜15分を超えることはありません。 </li><li>血管径と赤血球速度の測定値が利用可能になると、各血管における血流の計算は、式を使用して行うことができます：Q = V Xπ（D / 2）2、ここで、Q =血流、V = RBC速度とD =血管の直径。 </li><li>これらの手順は、時間をかけて繰り返すことができます。例えば、脳マラリアのマウスモデルでは、我々は、感染の4日目に始まる毎日の測定を行います。各マウスのために毎日得られた値を100％としています0日目との関係（感染前）、で正規化されます。 </li><li>血管径や血流の測定に加えて、追加の評価は、インスタンスの改善血流の評価と軟膜血管の白血球及び/または血小板のローリングと接着の分析のために、実行することができます。これらの測定は、蛍光標識マーカーの助けを借りて行われます。マラリアの場合には、我々はまた、GFPを発現しPBAの菌株を使用しての手段によって循環または付着寄生虫を検出することができます。 </li><li>血流評価のために我々はのソリューションを使用してFITC標識（シグマ、セントルイス、ミズーリ50μg/mouse）アルブミン、そして我々はテキサスレッド（TXR）で標識された汎白血球マーカーCD45に対する抗体を使用して軟膜血管への白血球付着を定量化する（インビトロジェン、カールスバッド、カリフォルニア州4μg/mouse）。アルブミン- FITC（2mg/mL）と20μLの抗CD45 - PE抗体（200μg/mL）を混合し、予め温めておいた尾静脈に注入される。この、25μlのためのマウスは、その後15分間循環させることが許可されている漏れの測定値はアルブミン- FITCかかるしかし、もし、すぐにイメージングすることができます。 XF100 - 2（オメガオプティカル、ブラトルバロ、バーモント州）、および抗- CD45 - TXR蛍光（615nm）を終了しています：アルブミン- FITCとGFP（PBA - GFP pRBC）によって放射される緑色蛍光（518nm）を使用し、鮮やかなALPHAキャプチャされます。 XF42：ビビッド標準で捕獲した。 </li><li>蛍光標識アルブミンが貫通血管を含む血管網の改良可視化を可能にし、それはそのような非灌流または下で灌流血管をチェックするために脳マラリアなどの疾病状態に特に便利です。また、血管漏出5を測定するために使用することができます。 </li><li>蛍光標識した抗CD45抗体は、軟膜血管への白血球のローリングと接着を識別し、定量化が容易になります。定量化のバイアスを避けるために、我々は、同じ箇所の血流を測定するために事前定義されたのローリングと接着性を定量化する。白血球付着の定量は、100μmの血管の長さが白血球の数をカウントすることによって行われます。ローリングは、30秒の間に、同じ100μmの長さで血液の速度よりもはるかに遅い速度で走行白血球の数をカウントすることにより定​​量される。 </li></ol> 3。代表的な結果<img src="/files/ftp_upload/2184/2184fig1.jpg" alt="図1"> 図1。頭蓋窓を介してアクセスできるマウス軟膜血管のネットワークの（ステップ2.6）写真。 <img src="/files/ftp_upload/2184/2184fig2.jpg" alt="図2"> 図2。マウス軟膜微小循環の生体顕微鏡用に設定されたの（ステップ3.1から3.5）回路図の表示。 1：生体内顕微鏡、2：20倍水浸対物レンズ、3：光源、4A：デジタル低光量、高速カメラ、4B：アナログカメラ、5：定位フレームのマウス、6：コンピュータモニター、7：アナログシアラー画像のせん断（矢印）が血管の直径を測定するために行われる方法を示す監視。 <img src="/files/ftp_upload/2184/2184fig3.jpg" alt="図3"> 図3。高速蛍光ビデオ録画からの細胞の追跡により（ステップ3.6から3.8）微小血管の赤血球速度測定。 Fまでの画像をカメラで顕微鏡フィールドの区切りを越えて、単一の移動RBCを示すone軟膜血管のシーケンスの画像です。そのプレキャリブレーションの距離で、フィールドを横断する15以上のセルの枠の位置でフレームの手動決定は、Excelスプレッドシートの助けを借りて、各容器内の平均赤血球速度の計算が可能になります。 <img src="/files/ftp_upload/2184/2184fig4.jpg" alt="図4"> 図4。 マラリア原虫berghei ANKA（PBA）に感染したマウス（n = 5）で、時間の経過と非感染コントロールマウスの軟膜血流の変化を示す代表的な実験の（ステップ3.9）のデータ（N = 5）。対照マウスに軟膜の血流が時間とともに比較的安定であるのに対し、PBA感染マウスは、血流の著しい減少を示す脳マラリアの開発（6日目）の時。データは平均± SEMである。 <img src="/files/ftp_upload/2184/2184fig5.jpg" alt="図5"> 図5。 （ステップ4.3）などの抗CD45 -テキサスレッド蛍光抗体で染色によって明らかにされたマラリア原虫berghei ANKAに感染したマウスの軟膜血管への接着白血球の数が多い。

<ol><li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+craniotomy+surgery+procedure+for+chronic+brain+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging.</a> J. Vis. Exp. (15), (2008).</li>
<li>Intaglietta, M., Tompkins, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvascular+measurements+by+video+image+shearing+and+splitting%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Microvascular measurements by video image shearing and splitting.</a> Microvasc. Res. 5, 309-312 (1973).</li>
<li>Briceno, J. C., Cabrales, P., Tsai, A. G., Intaglietta, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radial+displacement+of+red+blood+cells+during+hemodilution+and+the+effect+on+arteriolar+oxygen+profile%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Radial displacement of red blood cells during hemodilution and the effect on arteriolar oxygen profile.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 286, 1223-1228 (2004).</li>
<li>Bishop, J. J., Nance, P. R., Popel, A. S., Intaglietta, M., Johnson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+between+erythrocyte+aggregate+size+and+flow+rate+in+skeletal+muscle+venules%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Relationship between erythrocyte aggregate size and flow rate in skeletal muscle venules.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 286, H113-120 (2004).</li>
<li>Baldwin, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modified+hemoglobins+produce+venular+interendothelial+gaps+and+albumin+leakage+in+the+rat+mesentery%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Modified hemoglobins produce venular interendothelial gaps and albumin leakage in the rat mesentery.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 277, H650-H659 (1999).</li>
<li>Cabrales, P., Zanini, G. M., Meays, D., Frangos, J. A., Carvalho, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+cerebral+malaria+is+associated+with+a+vasospasm-like+microcirculatory+dysfunction%2C+and+survival+upon+rescue+treatment+is+markedly+increased+by+nimodipine%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Murine cerebral malaria is associated with a vasospasm-like microcirculatory dysfunction, and survival upon rescue treatment is markedly increased by nimodipine.</a> Am. J. Pathol. 176 (3), 1306-1315 (2010).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

ここで説明する生体顕微鏡法は、マウスの軟膜微小循環の詳細な観察のためのユニークで強力なツールが用意されています。それは個々の細動脈と細静脈を疎かし、そのような血管径、赤血球の速度、血流、白血球、血小板などの血液の要素の遵守とローリング、血管漏出、組織のpHとPO2のようなパラメータの数の変化を測定し、潜在的に多くのことが可能となりますアプリケーション。 in vivoで血管反応で速やかにそのような薬剤の投与などの介入により評価、または病理学的プロセスの間にすることができます。また、微小循環の振る舞い​​は、動的に時間の経過とともに追跡することができます。我々はP.によって引き起こされる脳マラリアの間に軟膜微小循環の変化を研究するためにこの技術を使用しているbergheiマウスのANKA、そしてこのモデルでは神経学的症候群は脳血流量の減少、血管収縮、障害灌流、最終的には血管虚脱6によって特徴付けられる微小循環不全に関連付けられていることが示されている。

<table><tbody><tr><td>イソフルラン</td><td>Baxter Internationl Inc.</td><td>FDG9623</td><td></td></tr><tr><td>カルボシアニン色素 Dil</td><td>Molecular Probes, Life Technologies</td><td>D306</td><td></td></tr><tr><td>Albumin-FITC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9771</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD45-TxR 抗体</td><td>Invitrogen</td><td>MCD4517</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;P. berghei&lt;/em&gt; ANKA-GFP</td><td>MR4</td><td>MRA-865</td><td></td></tr></tbody></table>

クローズ頭蓋窓を使用してマウス脳の微小循環の生体顕微鏡

Intravital Microscopy of the Mouse Brain Microcirculation using a Closed Cranial Window

この実験モデルは 、in vivo蛍光顕微鏡で使用して、急性および慢性の、生理学的および病態生理学的血行動態、炎症、代謝状態のときにマウスの軟膜微小循環を評価するために設計されました。閉じた頭蓋ウィンドウは、マウスの左頭頂後頭葉皮質の上に配置されています。地元の微小循環は、エピと蛍光の照明を使用してウィンドウを使ってリアルタイムに記録されており、血管径と赤血球（RBC）速度の測定が実行されます。 RBCの速度は、リアルタイムの相互相関および/または蛍光標識赤血球を用いて測定されます。軟膜血管と血流と血管の漏出の評価に白血球や血小板の付着は、アルブミン- FITCおよび抗CD45 - TXR抗体などの蛍光標識マーカーの助けを借りて作られています。微小循環は、数日間にわたって繰り返して、ビデオを記録することができます。我々は、血液中の深遠な減少をマウスのマラリアberghei ANKAの感染症の経過中に動的な変化に追従する軟膜微小循環を研究し、CMの発現は血管収縮を特徴と微小循環機能不全に関連付けられていることを示すために最初にウィンドウを閉じるの脳生体顕微鏡を用い流れと最終的には血管虚脱。

軟膜微小循環の時間的空間的血行動態および炎症性イベントに追従するように生体顕微鏡。

この実験モデルは、急性および慢性の、また生理学的および病理生理学的な血行動態におけるマウスの軟膜微小循環を評価するために設計されました。

本手順の全体的な目的は、生体顕微鏡を用いてマウス脳内の微小循環を研究することです。これにより、血流動態および炎症マーカーの動的な変化を、皮質微小循環において長期間にわたって追跡することが可能になります。この手法はLa Jolla Bioengineering Instituteで開発され、多くの種類の研究に使用されてきました。例えば、plasmodium burgi onca感染の経過中、および脳マラリア発現時の血流動態の変化の追跡などが挙げられます。これは、まず生体内顕微鏡観察の2週間前に慢性的頭蓋窓を設置することで達成されます。手順の第2ステップでは、低倍率の高解像度デジタル画像を用いて、頭蓋窓の全体的な形態を記録します。手順の第3ステップでは、通常光および蛍光照明を用いて生体内顕微鏡画像を撮影し、血管径とRBC速度をオンラインで測定するための特定の観察部位を選択します。本手順の最終ステップでは、蛍光標識した特異的抗体を用いて、小血管における白血球および血小板の接着について生体内解析を行います。最終的に、脳生体内顕微鏡観察を通じて、生理学的、病理生理学的、または疾患状態のモデルにおける脳内の微小循環変化をin vivoで得ることができ、これらの状態に関連する血行動態の変化を明らかにできます。この手法の主な利点は、外部薬剤や人工培剤にさらすことなく、生理学的環境下で脳を観察できることです。生体内顕微鏡観察は、磁気共鳴画像法（MRI）や血管造影法と比較して空間分解能と時間分解能に優れており、微視的なレベルでの観察を可能にします。本手法は、急性および慢性疾患における血行動態および炎症性変化など、脳微小循環の生理学および病態生理学における重要な疑問を解決するのに役立ちます。生体顕微鏡観察の2〜3週間前に、8〜10週齢のマウスに対して開頭術を行います。手順は既報の通りですが、動物の頭部にチタンバーは配置しません。慢性頭蓋窓は安定した調製法であり、埋込から数ヶ月後であっても、実験当日に脳微小循環の観察が可能です。まず、動物を定位固定装置に設置する前に、その体温を確認します。あらかじめ調製した蛍光標識赤血球をマウスの尾静脈から注入します。これにより、後ほど説明する赤血球のトラッキングが可能になります。その後、イソフルランを用いてマウスに軽度の麻酔をかけます。導入には4%、維持には1～2%を使用します。次に、動物を加熱パッド上の定位固定装置に腹臥位で配置します。イヤーバーを使用して頭部を慎重に固定し、左右のレバーを使用して水平度を調整します。ミネラルオイルで湿らせた綿棒を用いて、頭蓋窓のカバーガラスを優しく清掃します。次に、デジタルカメラに接続した実体顕微鏡を使用し、窓の下にある血管のパノラマ写真を数枚撮影します。パノラマ写真をコンピュータに転送した後、印刷・識別・日付記入を行うための最適な写真を選択します。この写真は、血管径と赤血球速度の測定用マップとして使用されます。これらは、この後に行う生体顕微鏡観察の開始手順の中で示します。マウスを専用の生体顕微鏡ステージに移動させます。歯科用アクリルで形成されたウェルの形状を利用して、頭蓋窓の上に水滴を落とします。開口数 0.5 の 20倍水浸対物レンズを使用します。画像は2台のカメラを用いて記録します。1台はコンピュータとモニターに接続されたデジタル低照度高速カメラであり、もう1台はVCRテープ、タイムスタンプ、およびカラーモニターに接続された低照度アナログカメラです。測定する血管を選択する前に、血管を確認して標本の作製品質を評価し、すべての血管で血流が認められる場合にのみ、測定対象となる血管を選択します。選択する血管には、異なる口径の静脈と動脈を含め、ウィンドウによって露出した領域内の異なる部位をカバーするようにしてください。本実験では、頭蓋窓内のさまざまな視野を確認しながら、測定用に12本の血管を選択します。血管を選択するために、あらかじめ撮影したPY血管系の写真において、測定を行う各箇所の正確な位置をアノテーションします。各箇所について、イメージシェアデバイスを用いて血管径を測定します。測定箇所を選択したら、血管の画像を垂直方向に合わせ、反対側までイメージシェアリングを行います。両端を合わせ、読み取り値を記録します。赤血球のトラッキングでは、各スポットをデジタルカメラで少なくとも30秒間記録し、ビデオ画像は150 frames per secondで記録します。この速度は、最大6 millimeters per secondまでの速度を決定するために、1ビデオフレームあたり1〜6枚の細胞画像を取得するように設定されています。データ収集が完了したら、マウスを脳定位固定装置から取り外し、適切なソフトウェアを用いて麻酔から回復させるため、ケージに戻します。取得したビデオ画像はデジタル化され、各細胞画像のXY座標データが得られます。細胞の位置は、画像解析ではなく手動で決定します。熟練した観察者の目による判断は、細胞中心の位置を良好に推定でき、これは一般的に観察される最大蛍光強度となる位置と一致します。ほとんどの細胞の向きにおいて、各血管につき15個の細胞について位置と速度の決定を行います。血管径とRBC速度の測定値が得られた後、平均値を算出して平均RBC速度を求めます。各血管における血流量の算出は、灌流の評価および細血管における白血球接着の解析のため、公式 Q = (D/2)² × π × V（ここで Q は血流量、V は RBC 速度、D は血管径）を用いて行うことができます。生体内顕微鏡観察は、FSE 標識 albumin と Texas Red で標識した汎白血球マーカー CD 45 に対する抗体の混合物を注入した動物に対して実施します。蛍光標識された albumin により、貫通血管を含む血管ネットワークの可視化が向上し、特に脳マラリアなどの疾患状態で、非灌流または低灌流血管を確認する際に有用です。蛍光標識抗CD 45抗体を用いることで、白血球のローリングおよび血管壁への接着を容易に識別し定量することができます。白血球接着の定量化は、100 µmの血管長における白血球数をカウントすることで行います。ローリングの定量化は、同一の100 µmの長さにおいて、30秒間に血流速度よりも有意に遅い速度で移動する白血球数をカウントすることで行います。図に示す通りです。高速蛍光撮影による細胞トラッキングを用いた微小血管内赤血球速度測定の例を以下に示します。ビデオ録画の画像AからFは、微小循環の連続画像です。各画像は、高速カメラによってフレームごとに捉えられた、流動する単一の赤血球の位置を表しています。代表的な実験から得られたこのグラフは、時間の経過に伴う髄膜血流の変化を示しています。plasmodium, burgi, oncaに感染したマウスでは、非感染のコントロールマウスでは髄膜血流が時間とともに比較的安定しているのに対し、PBA感染マウスでは脳マラリアの発症時に血流の著しい減少が見られます。6日目に、抗CD 45 Texas red蛍光抗体で染色すると、plasmodium burgi oncaに感染したマウスの肺血管に多数の白血球が付着していることがわかります。この手順は、本日の目的以外にも幅広い応用が可能です。in vivoで使用可能なあらゆる光学技術をこのモデルに適応させることができ、組織、組織内の酸素レベル、pH、活性酸素種、および内皮細胞と白血球の相互作用などのパラメータをこのモデルで研究することが可能です。

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