クローズ頭蓋窓を使用してマウス脳の微小循環の生体顕微鏡

この手順の全体的な目標は、生体内顕微鏡法によってマウスの脳内の微小循環を研究することであり、これにより、パイルの微小循環内の血行動態マーカーと炎症マーカーの動的な変化を長期間にわたって追跡できます。この技術はラホヤバイオエンジニアリング研究所で開発され、多くの種類の研究に使用されました。例えば、マラリア原虫感染の経過中、および脳マラリアの発現時の血行動態変化の追跡調査。

これは、生体内顕微鏡検査研究の2週間前に最初に慢性頭蓋窓を埋め込むことによって達成されます。手順の2番目のステップは、低倍率で高解像度のデジタル画像を使用して頭蓋窓の全体的な形態を記録することです。手順の3番目のステップは、従来の照明と蛍光照明を使用して生体内顕微鏡画像を取得し、血管の直径と赤血球速度のオンライン測定のために特定の研究サイトを選択することです。

手順の最後のステップは、蛍光標識特異的抗体を介して、パイル血管内の白血球および血小板付着の生体内分析を行うことです。最終的には、脳内生体内顕微鏡法を通じて、生理学的病態または疾患状態の脳ミラーリングモデルにおけるin vivoの微小循環変化を示す結果が得られ、これらの状態に関連する血行動態の変化を確立することができます。この技術の主な利点は、外部エージェントや人工媒体に脳をさらすことなく、彼の生理学的環境で脳を観察することです、画像磁気共鳴や血管造影と比較して、生体内顕微鏡検査は空間的および時間的な解像度を持ち、顕微鏡から顕微鏡レベルまで見ることができます。

この方法は、急性および慢性疾患の 2 週間から 3 週間前に生体内顕微鏡検査を行う際の血行動態や炎症性変化など、脳の微小循環の生理学および病態生理学における重要な質問に答えるのに役立ちます。開頭術は、8〜10週齢のマウスで行われ、チタンバーが動物の頭に配置されていないことを除いて、以前に実証されています。慢性頭蓋窓は安定した製剤であり、実験当日に移植されてから数ヶ月後でも杭の微小循環を調べることができます。

まず、マウスの尾静脈を介して蛍光標識赤血球を注入した動物を事前に調製した定位固定装置フレームに動物を配置する前に、動物の体温を確認してください。これにより、赤血球の追跡が可能になりますが、これについては後ほど説明します。次に、マウスにイソフッ素で軽く麻酔をかけます。

誘導のために4%、メンテナンスのために1から2%。次に、動物を温熱パッドの定位固定装置フレームに腹臥位に置きます。イヤーバーでヘッドを慎重に固定し、左右のレバーでレベルを調整します。

鉱物油で湿らせた綿棒で頭蓋窓のカバースリップをやさしく拭きます。次に、デジタルカメラに接続された実体顕微鏡を使用して、窓の下の容器のパノラマ写真を数枚撮ります。パノラマ写真をコンピューターに転送した後、印刷、識別、日付付けに最適なものを選択します。

この写真は、血管の直径と赤血球の速度を測定するためのマップとして使用され、次に生体内顕微鏡検査を開始するためにデモンストレーションされます。マウスをカスタマイズされた生体内顕微鏡ステージに移します。歯科用アクリルによって形成された井戸を利用して、頭蓋窓に水を一滴垂らします。

開口数が0.5の20 x 水浸対物レンズが使用されます。コンピュータとモニターに接続されたデジタル低照度高速カメラと、VCRテープに接続された低照度アナログカメラ、タイムスタンプ、カラーモニターの2台のカメラを使用して画像を記録し、測定する血管を選択し、血管をチェックして製剤の品質を評価し、すべての血管に血液が流れているかを評価します。 次に、測定する容器を選択します。それらは、さまざまな直径の会場と幹線道路を含み、窓によって露出する領域内のさまざまな場所をカバーする必要があります。

私たちの実験では、頭蓋窓内のさまざまなフィールドを見ながら、測定する12の血管を選択します。血管を選択し、各スポットについて先に撮影したPY血管系の写真で測定する各スポットの正確な位置に注釈を付け、画像せん断装置を用いて血管径を測定する。スポットが選択されると、容器の画像が垂直位置に整列し、画像が反対になるまでせん断されます。

極値が揃い、読み取り値が文書化されます。赤血球追跡のために、各スポットはデジタルカメラによって少なくとも30秒間記録され、ビデオ画像は毎秒150フレームで記録されます。このレートは、1つのビデオフレームでセルの1〜6枚の画像を取得して、毎秒最大6ミリメートルの速度を決定するように設定されています。

データ収集が完了したら、マウスを定位固定装置フレームから取り外し、ケージに戻して、適切なソフトウェアを使用して麻酔から回復します。取得したビデオ画像はデジタル化され、XYされます。各セル画像の座標データが取得されます。細胞の位置は、画像解析ではなく手動で決定されます。

訓練を受けた観察者の目は、細胞の中心の位置を適切に推定することを考えると、これは一般に観察される最大蛍光の位置に対応します。ほとんどの細胞配向では、位置と速度の決定は各血管の15個の細胞に対して行われます。血管の直径とRBC速度の測定が利用可能になった後に平均RBC速度を取得するための平均。

各血管内の血流の計算は、式 Q が PI × V の 2 乗で D に等しい (Q は血流に等しい、V は RBC 速度に等しい、D は血管径に等しい) を使用して、パイル血管内の白血球付着の豊富な評価と分析を行うことができます。生体内顕微鏡検査は、FSE 標識アルブミンとテキサスレッドで標識された汎白血球マーカー CD 45 に対する抗体の混合物を注入した動物に対して行われます。蛍光標識アルブミンは、穿通血管を含む血管網の可視化を改善し、特に脳マラリアなどの疾患状態で、灌流されていない血管や灌流されていない血管をチェックするのに役立ちます。

蛍光標識抗CD 45抗体により、白血球のローリングとパイル血管への接着を簡単に同定し、定量することができます。白血球接着の定量化は、100ミクロンの血管長の白血球の数を数えることによって行われます。ローリングは、同じ100ミクロンの長さで30秒間に血液速度よりも大幅に遅い速度で移動する白血球の数を数えることによって定量化されます。表示。

これは、高速蛍光による細胞追跡による微小血管赤血球速度測定の例です。ビデオ録画写真AからFは、微小循環のシーケンス画像です。各写真は、流れる単一の赤血球の位置を表しており、高速カメラによってフレームごとにキャプチャされます。

代表的な実験のグラフは、パイルの血流の経時的な変化を示しています。マラリア原虫、ブルギ、オンカ感染マウス、および非感染対照マウスでは、対照マウスでは、パイル血流は経時的に比較的安定しています。PBAに感染したマウスは、脳マラリアの発症時に血流が市場に減少することを示しています。

6日目に、抗CD45による染色では、テキサス赤色蛍光抗体により、マラリア原虫に感染したマウスのパイル血管に付着した多数の白血球が明らかになりました。この手順には、今日ここでの1つの仕事以外にも、幅広い用途があります。in vivoで使用できる任意の光学技術をこのモデルに適合させることができ、組織、酸素レベル組織、pH活性酸素種、白血球との内皮相互作用などのパラメータをこのモデルで研究できます。