最適STORM超解像顕微鏡のためのテストサンプル

この手順の全体的な目標は、高品質のストーム超解像画像を取得する方法を示すことです。これは、最初に蛍光標識された試験サンプルを調製することによって達成されます。2番目のステップは、スイッチングバッファーを準備し、イメージングチャンバーにバッファーを充填することです。

次に、生データをストーム顕微鏡で取得します。最後のステップは、暴風雨処理ソフトウェアを使用して生データから超解像画像を再構築することです。最終的に、テストサンプルは、高品質の生データを取得する方法を示すために使用され、その後、30〜50ナノメートルの解像度で細胞内のストーム超解像画像を生成することができます。これは、芝や共焦点などの従来の蛍光顕微鏡技術よりも5〜10倍高い解像度です。

一般に、この方法に不慣れな個人は、高品質のスパースリンクをたくさん収集することの重要性を認識していないため、苦労します。これは、Alexa 6 4 7色素を正しいスイッチングバッファーで使用することで、はるかに簡単になります。SPR解像度の画像を生成するには、高品質の生データを取得することが重要であるため、この手法の視覚的なデモンストレーションが不可欠です。

この手法の生のビデオシーケンスは、他の形態の蛍光顕微鏡とはまったく異なるように見えます。8チャンバーカバーガラスの各ウェルに200マイクロリットルの0.01%ポリリジン溶液で蛍光デキストリンでガラスをコーティングする手順を開始し、10分間インキュベートします。10分後、ポリリジン溶液をピペットで取り出し、液体が希釈されていないことを確認します。

デキストリンのミリリットル原液あたり2ミリグラムの0.25マイクロリットル。Alexa 6 47を25マイクロリットルの脱イオン水にして、ミリリットルあたり20マイクログラムの溶液を作成し、デキストリンの高密度コーティングを作成します。Alexa 6 47ソリューション。

20マイクログラム/ミリリットル溶液の20マイクロリットルを合計200マイクロリットルの脱イオン水に希釈します。中密度溶液の場合、200マイクロリットルの脱イオン水で2マイクロリットルを希釈します。低密度溶液の場合は、0.2マイクロリットルを希釈します。

200マイクロリットルの脱イオン水に、希釈したデキストリンAlexis X 47溶液200マイクロリットルを各ウェルに加え、10分間インキュベートします。インキュベーション時間を長くすると、デキストリンコーティングの密度が高くなる可能性があります。最後に、Dexter Xis X 47溶液を取り出し、水で3回洗います。

蛍光アクチンフィラメントをガラス上に調製するには、まず、8チャンバーの各ウェルに200マイクロリットルの0.01%ポリリジン溶液を加えます。ガラスを覆い、10分間インキュベートします。ピペットで取り外して、液体が残らないようにします。

各チャンバーに、製造元の指示に従って以前に再構成した一般的なアクチン緩衝液90マイクロリットルを追加します。次に、10マイクロリットルの10マイクロモルの予め形成されたアクチンフィラメント溶液と1マイクロリットルのフォイドとAlexa 6 47を加え、静かに上下させて混合し、室温で30分間インキュベートして、フィデューシャルマーカーとして微小球蛍光ビーズを調製し、1マイクロリットルのtepecビーズを200マイクロリットルのPBSに希釈して混合します。希釈したビーズをイメージングチャンバーに加え、15分間待ちます。

15分後、溶液を取り出し、PBSで3回洗浄してからイメージングし、この実験で約80%coの流暢さで培養した細胞をイメージングします。培地を取り出し、PBSで洗浄します。次に、500マイクロリットルの4%ホルムアルデヒド溶液を10分間加えます。

ホルムアルデヒドを取り除き、PBSで3回洗います。細胞を乾燥させず、常にPBS緩衝液を使用してください。低張性ストレスを避けるために、EGF Alexaの50マイクログラム/ミリリットルの原液を2マイクロリットル、0.1%BSA溶液を6 47〜200マイクロリットル加えてから、この溶液をヘラ細胞に加えます。

室温で30分間インキュベートします。溶液を取り出し、PBSで3回洗浄します。0.1%BSAのブロッキング溶液を加え、室温で15分間放置します。

その後、ブロッキング溶液を取り出し、イメージング前にPBSでさらに3回洗浄します。イメージングの直前に、酵素グルコースと還元剤ストック溶液を一緒に混合してスイッチングバッファーを調製します50マイクロリットル、400マイクロリットル、100マイクロリットルの比率で、PBSを添加して最終容量を1ミリリットルにします。イメージングチャンバーからPBSを取り出し、スイッチングバッファーを上部まで充填します。

チャンバーの上部にカバースリップを慎重に置き、気泡がまったくなく、チャンバー全体が覆われていることを確認します。気泡が見られる場合は、追加のバッファーまたはPBSを補充します。そうしないと、バッファのパフォーマンスが低下する可能性があります。

この手順を成功させるには、高品質でスパースなリンクデータを収集することが不可欠であるため、顕微鏡の焦点が適切で、正しい取得設定が使用されていることを確認してください。イメージングする対象の蛍光構造を見つけます。目的の照明角度を選択します。

この場合、芝生または非常に傾斜した角度が推奨されるため、焦点が合っていない光を最小限に抑えることでS/N比が改善され、これは特に細胞サンプルにとって有益です。嵐のイメージングの前に、構造物の画数制限された画像を参照してください。励起レーザーを、10ミリ秒の露光と約50ヘルツまたはフレーム/秒のサイクルタイムのカメラ設定でイメージングしながら、約2キロワット/センチメートルの二乗に対応する高出力に増やします。

フローラフォーがまばらな点滅パターンに移行したら、10, 000フレームを収集します。この再構築を始めるために。MATLAB 内から RAINSTORM M ファイルを開き、rainstorm ウィンドウで実行します。

参照ボタンを使用して、解析する画像ファイルを選択します。これはTIFファイルである必要があります。データの取得に使用した顕微鏡システムの生データと一致するようにピクセル幅を変更します。

他の値はデフォルトのままにします。画像処理ボタンを押して、予備画像が表示されるまで待ちます。処理にかかる時間は、ファイルサイズ、コンピューターの仕様、および生データ内の候補リンクの数によって異なります。

更新された超解像画像を生成するには、レビューアーを開くボタンを押すと、2番目のウィンドウが表示されます。コントラスト調整ボタンを押して、必要に応じて画像表示を変更します。画像が非常に暗い場合は、最大値を減らす必要があります。

レビュアー ウィンドウを使用して、有用な画質メトリクスを生成し、超解像画像をさらに絞り込みます。最初の3つの品質管理パラメータは、それぞれ5、000 0.1、0.8から3.5のデフォルト値のままにします。フォトン値あたりのカウントを更新します。

ローカリゼーション精度のカットオフを変更して、平均ローカリゼーションの最適化とローカリゼーション番号に対する精度の間でトレードオフします。最終的な画像では、データとサンプルの品質に応じて30〜50ナノメートルの値が推奨されます。再構成スケール ファクターのデフォルトは 5 で、元の画像内のピクセルが 160 ナノメートルであると仮定すると、32 ナノメートルの超解像ピクセルが生成されます。

生画像のピクセルサイズが100ナノメートルの場合、20ナノメートルのピクセルを持つ超解像画像が生成されます。スケール ファクターを大きくすると、生成される超解像ピクセルが小さくなります。最終的な画像で、レビューアーの実行ボタンを押して、更新された超解像画像を生成します。

ヒストグラムの表示ボタンを押して、画質メトリックを表示します。最後に、レビュアーの画像保存ボタンを押して、このデータをすべて保存します。この手順は、前に示したのと同じ方法でイメージを生成することから開始します。

レビューアーのボックス追跡ボタンを押し、レビューされた画像の基準マーカーの上にボックスをクリックしてドラッグします。新しい画像が表示され、ボックス化された位置が表示されるまで待ちます。必要に応じて、この画像を保存します (対象のオブジェクトが指標マーカーの場合)。

この場合と同様に、オフセット補正を実行するには、set anchor ボタンをクリックしてから subtract drift ボタンをクリックします。最後に、もう一度 [レビューアーの実行] をクリックして、新しい嵐の画像を生成します。デキストリンのコーティングが成功すると、蛍光単分子膜が生成され、典型的なデキストリンのデータをこの図に示します。

回折限界画像は、嵐のイメージング前に異なる濃度のデキストリンを示しています。超解像再構成のピクセルサイズは25ナノメートルです。10, 000枚の画像は、1 28 x 1 28ピクセルのフレームサイズで収集され、そのシーケンスから個々のフレームが示されています。

高デキストリン濃度で。蛍光単分子膜は、これらの画像とこのビデオセグメントに示されているように、比較的均一に見えるはずです。濃度が低いと、まばたきはまばらで焦点が合っているように見えます。

この画像取得フェーズでは、一定のレーザー照明で明らかな背景がないため、高密度サンプルのフレーム2000とフレーム8,000との比較で示されるように、点滅回数は時間とともに減少します。高、中、低のデキストリン濃度の超解像画像の主な違いは、局在化の数が減少することです。このグラフは、デキストリンの各濃度の3つの10, 000フレームシーケンスの平均を示しており、エラーバーは標準偏差を示しています。

ただし、生データ中の蛍光分子の濃度、点滅回数、および局在化の数との間のこの比例関係は、フレームごとに受け入れられる局在化の数のこのプロットに示されているように、単純な線形の関係ではありません。非常に高い分子密度で100フレームの平均ローリングを使用すると、ソフトウェアはサンプルをイメージングするときに分子をうまく位置特定できません。一般的な問題は、媒体全体に拡散するフルオロ力によって引き起こされる、画像全体に明るく焦点の合っていない蛍光霞が存在することです。

これらの分離した蛍光分子は、スイッチングバッファーを添加する前にPBSによる洗浄ステップの数を増やすか、チャンバー処理に新たなスイッチングバッファーを追加し、各画像シーケンスからのデータを比較することで、非常に異なる超解像画像が得られることを防止または除去できます。パネル C と D は、それぞれパネル A と B で収集されたデータに対応する超解像画像構成です。このグラフは、100 フレームの平均ローリングを使用して、フレームごとに受け入れられたローカリゼーションの数をプロットしています。

赤い線は、背景が高い嵐のシーケンスAとCに対応し、青い線は背景が低いBとDに対応します。高バックグラウンドデータと低バックグラウンドデータに対応する画像の許容ローカリゼーション番号を2番目のグラフに示します。これらの3つの回折限界画像は、スイッチングバッファーとストームイメージングを添加する前に、ガラスの表面に付着した予備形成されたアクチンフィラメントの典型的なデータを示しています。

フィラメントの長さが可変であることが分かります。非常に明るいフィラメントは、多くの場合、複数のフィラメントが絡み合っています。絡まった領域ではなく、比較的明るい単一のフィラメントを選択すると、取得フェーズでより高品質の画像が得られます。

フィラメントの長さに沿って明るい焦点の点滅が見られるはずです。まばらな点滅は、取得フェーズ中、その後のプロセスデータで確認する必要があります。フレームあたりの局在化には細い連続フィラメントがあるはずで、緩やかな減少を示す必要があります。

通常、フィラメントの半値またはFWHMは、画像Jのプロットプロファイル機能を使用してアクチンフィラメントのズームイン領域を通る直線を描画し、その後ガウスフィットを実行することにより、解像度の経験的推定値として与えられます。FWHMは43.2ナノメートルとして計算されます。ミス局在の問題は、フレームのサブセットを処理し、最初と最後の5, 000フレームを比較することにより、多数のアクチンフィラメントが互いに分岐および/または交差している場合に発生する可能性があります。

最初の5, 000フレームを使用して、超解像画像で異なる画像が生成されます。画像の中央に多くのローカリゼーションが見られます。ただし、最後の5,000フレームを使用すると、これらのローカリゼーションのほとんどが明らかになり、画像内のローカリゼーションの数が少ないため、フィラメントのみが多少連続していますが、残されます。

点滅密度が高すぎると疑われる場合は、フレームごとのローカリゼーションデータと画像を比較すると、この問題が最初のフレームセットで発生していることが強く示唆されます。フレームあたりの平均ローカリゼーション数は 10 を超えていますが、最後のフレーム セットは約 4 です。ストーム顕微鏡法におけるもう一つの潜在的な問題はドリフトであり、これはサンプルが対物レンズに対して移動するときに発生しますデータ取得フェーズを通じて、画像取得フェーズ中に検出することは非常に困難ですが、ドリフトはアクチンフィラメントなどの既知の構造の超解像画像で検出することができます。

横方向のドリフトが発生した可能性がある最初の兆候は、構造が予想よりも大きいことです。たとえば、暴風雨の精度限界データと比較した半値を持つ比較的大きなフルの場合、この場合は 67 ナノメートルに対して 90 ナノメートルです。ドリフトを検出するより良い方法は、時間 IE の関数としてローカリゼーションを比較し、後のフレームのローカリゼーションが前のフレームのローカリゼーションと比較して変位しているかどうかを確認することです。

これは、アクチンフィラメントの場合、カラーコードで表示するとはっきりとわかります。パネル B と c に示すように、暴風雨でボックス トラッキング機能を使用すると、ローカリゼーションが取得されたときのフレーム番号に対応する色で表示されます。たとえば、取得シーケンスの早い段階からのローカリゼーションは青で、取得シーケンスの後半からのローカリゼーションは赤です。

ずれた色は、測定と修正のためにドリフトが発生したことを示します。ドリフトの場合、直径100ナノメートルの蛍光ビーズを基準マーカーとして使用できます(1番から4番までは、トリミングされたビーズとズームされたビーズを個別に表示します)。取得フェーズ中に3分、10秒の間に約100ナノメートルの比較的厳しいドリフトがある例では、同じボックストラッキング機能を使用して、ドリフトが色分けされ、ドリフトが発生したことを確認でき、この例では4つのビーズすべてがほぼ同一のドリフトを示しているため、そのうちの1つを選択して、この場合はビーズ2つを基準として使用し、ドリフトを差し引くことができる他のビーズから。

パネルEとの比較では、横方向のずれが修正されていることがわかります。最後に、上皮成長因子で染色されたヒラ細胞を使用して、画像解像度の現実的な例を示すことができます。細胞パネルAでは、基底細胞表面に焦点を絞ったヘラ細胞の一部の回折限界画像を示しており、黄色のボックスは、回折限界画像における不明瞭な関心領域のズームインされた関心領域とは対照的に、パネルBおよびCに示されている関心領域

超解像画像では、クラスターの混合、時折孤立した単一ピクセルが表示されます。クラスターの直径は約100ナノメートルで、ピットやベシクルの形成に対応する可能性があります。このビデオを見た後、簡単なテストサンプルの作成方法、データの取得方法、高品質の嵐の再構築方法について十分に理解しているはずです。

これらの方法は、ドリフトなどの一般的なフィットの落とし穴を回避し、ストームを最適化するのに役立ちます。解像度の実験を参照してください。