最適STORM超解像顕微鏡のためのテストサンプル

この手順の全体的な目的は、高品質なSTORM超解像画像を撮影する方法を実証することです。まず、蛍光標識したテストサンプルを調製します。次に、スイッチングバッファーを調製し、イメージングチャンバーをそのバッファーで満たします。

次に、STORM顕微鏡を用いて生データを取得します。最終ステップは、Rainstorm処理ソフトウェアを使用して、生データから超解像画像を再構成することです。最終的に、これらのテストサンプルを用いて高品質な生データの取得方法を示し、それを処理することで、細胞内の30～50 nanometersの分解能を持つSTORM超解像画像を生成します。これは、TIRFや共焦点顕微鏡を含む従来の蛍光顕微鏡技術と比較して、5倍から10倍の分解能向上に相当します。

一般的に、この手法に慣れていない方は、高品質なスパースリンクを大量に収集することの重要性に気づかず、苦労することがあります。適切なスイッチングバッファーを用いてAlexa 647 dyeを使用することで、この作業は格段に容易になります。SPR分解能画像を生成するには、高品質な生データを取得することが不可欠であるため、この手法の視覚的なデモンストレーションが重要となります。

この手法の生のビデオシーケンスは、他のあらゆる形式の蛍光顕微鏡法とは全く異なって見えます。ガラスに蛍光デキストリンをコーティングする手順を開始するには、まず8チャンバーカバーガラスの各ウェルに0.01% polylysine溶液を200 µL加え、10分間インキュベートします。10分後、ピペットでpolylysine溶液を取り除き、液体が残っていないことを確認してください。

デキストリン Alexa 647の2 mg/mLストック溶液0.25 µLを脱イオン水25 µLに加え、20 µg/mL溶液を調製することで、デキストリン Alexa 647溶液の高密度コーティングを作成します。

20 µg/mL溶液20 µLを、脱イオン水で最終的に200 µLになるように希釈します。中密度の溶液にする場合は、2 µLを脱イオン水200 µLで希釈します。低密度の溶液にする場合は、0.2 µLを希釈します。

脱イオン水200 µLに対し、希釈したデキストリン Alexis X 47溶液200 µLを各ウェルに加え、10分間インキュベートします。インキュベート時間を長くすると、より緻密なデキストリンコーティングが得られる場合があります。最後に、Dexter Xis X 47溶液を除去し、水で3回洗浄します。

ガラス上に蛍光アクチンフィラメントを調製するには、まず、8ウェルのチャンバーの各ウェルに0.01%ポリリシン溶液を200 µL加えます。カバーガラスで覆い、10分間インキュベートします。その後、液体が残らないようにピペットで除去します。

メーカーの指示に従ってあらかじめ調製した一般アクチンバッファーを、各チャンバーに 90 µL 加えます。次に、10 µM の既製アクチンフィラメント溶液を 10 µL、および foid と Alexa 647 を 1 µL 加え、ピペッティングで穏やかに混合します。室温で 30 分間インキュベートし、基準マーカーとなる蛍光マイクロビーズを調製します。テペックビーズ 1 µL を 200 µL の PBS で希釈し、混合します。希釈したビーズをイメージングチャンバーに加え、15 分間待ちます。

15分後、溶液を除去し、イメージングを行う前にPBSで3回洗浄します。本実験では、コンフルエンシーが約80%になるまで培養した細胞を使用します。培地を除去してPBSで洗浄します。その後、4%ホルムアルデヒド溶液500 microlitersを加え、10分間置きます。

ホルムアルデヒドを除去し、PBSで3回洗浄します。細胞を乾燥させないようにし、常にPBS緩衝溶液を使用してください。低張ストレスを避けるため、50 µg/mLのEGF Alexa 647ストック溶液2 µLを0.1%BSA溶液200 µLに加え、その後、この溶液をHeLa細胞に添加します。

室温で30分間インキュベートします。溶液を除去し、PBSで3回洗浄します。0.1%BSAのブロッキング溶液を加え、室温で15分間静置します。

その後、ブロッキング溶液を除去し、イメージング前にPBSでさらに3回洗浄します。イメージングの直前に、酵素グルコースおよび還元剤のストック溶液を50 µL、400 µL、100 µLの比率で混合し、PBSを加えて最終容量を1 mLにしてスイッチングバッファーを調製します。イメージングチャンバーからPBSを除去し、スイッチングバッファーを上まで満たします。

カバーガラスをチャンバーの上に慎重に載せ、気泡が全くなく、チャンバー全体が覆われていることを確認します。気泡が見られる場合は、バッファーまたはPBSを追加して補充してください。そうしないと、バッファーの性能が低下する可能性があります。

この手順を成功させるには、高品質で疎なリンキングデータの収集が不可欠であるため、顕微鏡の焦点が適切に合っていること、および正しい取得設定が使用されていることを確認してください。イメージングの対象となる目的の蛍光構造を特定します。希望する照明角度を選択してください。

本ケースでは、特に細胞サンプルの場合に、焦点外の光を最小限に抑えてSN比を向上させることができるため、ターフ（turf）または高傾斜角が推奨されます。STORMイメージングを行う前に、構造の分画制限画像（fraction limited image）をリファレンスとして取得してください。カメラ設定を露光時間10 millisecond、サイクル時間を約50 hertzまたはframes per secondに設定し、励起レーザーを約2 kilowatts per centimeter squaredに相当する高出力に上げてイメージングを行います。

flora foursがまばらな点滅パターンに移行したら、10,000フレームを収集します。この再構成を開始するには、MATLAB内でRAINSTORM Mファイルを開き、rainstormウィンドウで実行してください。

参照ボタンを使用して、解析する画像ファイルを選択します。ファイル形式はTIFである必要があります。使用した顕微鏡システムの生データに合わせてピクセル幅を変更してください。

その他の値はデフォルトのままにします。「process images」ボタンを押し、暫定的な画像が表示されるまで待ちます。処理にかかる時間は、ファイルサイズ、コンピュータのスペック、および生データ内の候補リンクの数によって異なります。

更新された超解像画像を生成するには、[open reviewer]ボタンを押すと、2つ目のウィンドウが表示されます。[adjust contrast]ボタンを押して、必要に応じて画像表示を変更してください。画像が非常に暗い場合は、最大値を下げてください。

レビュアーウィンドウを使用して、有用な画像品質メトリクスを生成し、超解像画像をさらに精査します。最初の3つの品質管理パラメータは、それぞれ5,000、0.1、0.8～3.5のデフォルト値のままにします。photonあたりのカウント値を更新してください。

局在化精度のカットオフ値を変更することで、平均局在化精度と局在化数のトレードオフを最適化します。最終画像では、データの品質やサンプルに応じて30から50 nanometersの値を推奨します。再構成スケール因子のデフォルトは5であり、元の画像の画素サイズが160 nanometersであると仮定すると、32 nanometersの超解像画素が生成されます。

元の画像のピクセルサイズが100 nanometersである場合、ピクセルサイズ20 nanometersの超解像画像が生成されます。スケール係数を大きくすると、より小さい超解像ピクセルを生成できます。最終画像で、「run reviewer」ボタンを押して、更新された超解像画像を生成してください。

画像品質メトリクスを表示するために、view histogramsボタンを押します。最後に、レビュアーにあるsave imageボタンを押し、これらのすべてのデータを保存します。前述の手順と同様の方法で画像を生成し、この操作を開始してください。

レビュアーのボックス追跡ボタンを押し、レビュー中の画像上のフィデューシャルマーカーを囲むようにボックスをクリックしてドラッグします。ボックスの位置が表示された新しい画像が現れるまで待ちます。関心対象がフィデューシャルマーカーである場合は、必要に応じてこの画像を保存してください。

ここで行っているように、「set anchor」ボタンをクリックし、続いて「subtract drift」ボタンをクリックしてドリフト補正を行います。最後に、再度「run reviewer」をクリックして、新しいSTORM画像を生成します。デキストリンのコーティングが成功すると蛍光単分子層が形成され、この図に典型的なデキストリンのデータを示しています。

回折限界画像は、STORMイメージング前の異なる濃度のデキストリンを示しています。超解像再構成のピクセルサイズは 25 nanometers です。128 by 128 pixel のフレームサイズで 10,000 枚の画像が収集され、そのシーケンスから個々のフレームが表示されています。

デキストリン濃度が高い場合、これらの画像およびビデオセグメントに示されているように、蛍光単分子層は比較的均一に現れます。低濃度では、点滅がよりまばらに、かつ焦点が合った状態で現れます。

一定のレーザー照射下でのこの画像取得フェーズにおいて、顕著なバックグラウンドが存在しない場合、高密度サンプルにおけるフレーム2000とフレーム8,000の比較で示されるように、ブリンキングの回数は時間とともに減少します。高、中、低デキストリン濃度の超解像画像における主な違いは、ローカリゼーション数の減少です。このグラフは、各デキストリン濃度の10,000フレームのシーケンス3回の平均を示しており、エラーバーは標準偏差を表しています。

しかしながら、生データにおける蛍光分子の濃度、ブリンク回数、および局在化回数の間の比例関係は、この1フレームあたりの承認済み局在化回数のプロットで示されているように、単純な線形関係ではありません。非常に高い分子密度において100フレームの移動平均を用いた場合、ソフトウェアはどのようなサンプルをイメージングしても分子の局在化に成功できなくなります。よくある問題として、媒体を通じて拡散した蛍光物質によって、画像全体に明るいが焦点の合っていない蛍光ヘイズ（霧状の光）が発生することが挙げられます。

これらの脱離した蛍光分子は、スイッチングバッファーを添加する前にPBSによる洗浄回数を増やすか、またはチャンバーに新しいスイッチングバッファーを添加することで、防止または除去することが可能です。各画像シーケンスから得られたデータを処理し比較すると、超解像画像に大きな違いが生じます。パネルCおよびDは、それぞれパネルAおよびBで収集されたデータに対応する超解像画像の構築結果です。このグラフは、100フレームの移動平均を用いて、1フレームあたりの許容ローカリゼーション数をプロットしたものです。

赤線はバックグラウンドが高いストームシーケンスAおよびCに対応し、青線はバックグラウンドが低いBおよびDに対応しています。高および低バックグラウンドデータに対応する画像の許容ローカライゼーション数は、2番目のグラフに示されています。これら3つの回折限界画像は、スイッチングバッファーの添加およびストームイメージングを行う前に、ガラス表面に付着した事前形成アクチンフィラメントの典型的なデータを示しています。

フィラメントの長さにはばらつきが見られます。非常に明るいフィラメントは、多くの場合、複数のフィラメントが絡まり合ったものです。取得段階において、絡まり合った領域ではなく、比較的明るい単一のフィラメントを選択することで、より高品質な画像が得られます。

フィラメントの全長にわたって、焦点が合った明るい点滅が観察されるはずです。点滅は、データ取得段階およびその後のデータ処理において、まばらに観察されるはずです。細く連続したフィラメントが認められ、1フレームあたりの局在数は緩やかに減少していくはずです。

通常、フィラメントの半値全幅（FWHM）は、Image Jのプロファイルプロット機能を用いてアクチンフィラメントの拡大領域に直線を drew し、その後にガウスフィッティングを行うことで、解像度の経験的推定値として算出されます。この例では、FWHMは 43.2 nanometers と計算されます。また、多くのアクチンフィラメントが分岐または交差している場合に誤局在の問題が発生することがありますが、これはフレームのサブセットを処理し、最初と最後の 5,000 フレームを比較することで確認できます。

最初の5,000フレームを用いた超解像画像では、異なる画像が得られます。画像の中央に多くのローカライゼーションが認められます。しかし、最後の5,000フレームを用いた場合、これらのローカライゼーションの多くは消失し、フィラメントのみが残りますが、画像内のローカライゼーション数が少ないため、やや不連続な状態となります。

点滅密度が高すぎると疑われる場合、画像とフレームごとのローカライゼーションデータを比較することで、最初のフレーム群の間にこの問題が発生していることを強く示唆できます。最後のフレーム群では1フレームあたりの平均ローカライゼーション数が約4回であるのに対し、最初の方は10回を超えています。STORM顕微鏡におけるもう一つの潜在的な問題はドリフトであり、これは対物レンズに対して試料が移動したときに発生します。データ取得段階において、画像取得中に検出することは非常に困難ですが、アクチンフィラメントなどの既知の構造の超解像画像でドリフトを検出することが可能です。

横方向のドリフトが発生したことを示す最初の兆候は、構造体が予想よりも大きくなることです。例えば、rainstormの精度限界データと比較して、半値全幅が相対的に大きくなる場合が挙げられます。この例では、67 nanometersに対して90 nanometersとなります。ドリフトを検出するより優れた方法は、時間の関数として局在化を比較すること、すなわち、初期フレームの局在化と比較して、後続フレームの局在化が変位しているかを確認することです。

これは、アクチンフィラメントをカラーコードで表示した場合に明確に確認できます。パネルBおよびCに示すように、rainstormのボックストラッキング機能を使用すると、ローカリゼーションは取得時のフレーム番号に対応する色で表示されます。例えば、取得シーケンスの初期のローカリゼーションは青色で、取得シーケンスの後期のローカリゼーションは赤色で表示されます。

色のずれは、測定および補正が必要なドリフトが発生したことを示しています。ドリフトの測定には、直径100 nanometerの蛍光ビーズを基準マーカーとして使用できます。1から4の番号は、個別に切り出して拡大したビーズを示しています。取得フェーズ中の3分10秒間で、約100 nanometersという比較的激しいドリフトが発生した例では、同じボックストラッキング機能を使用して色分けし、ドリフトの発生を確認できます。この例では4つのビーズすべてにほぼ同一のドリフトが見られるため、そのうちの1つ（この場合はビーズ2）をリファレンスとして選択し、他のビーズからドリフト分を差し引くことが可能です。

パネルEとの比較により、横方向のドリフトが補正されたことがわかります。最後に、上皮成長因子で染色したHeLa細胞を用いて、画像解像度の現実的な例を示します。細胞の例では、パネルAにHeLa細胞の一部の回折限界画像を示しており、基底細胞表面に焦点が合わせられています。ここで、黄色のボックスは拡大した関心領域を示しており、回折限界画像における不明瞭な関心領域とは対照的に、パネルBおよびCにその拡大像が示されています。

超解像画像では、クラスターと、時折現れる孤立した単一ピクセルの混合状態が示されるはずです。クラスターの直径は約100 nanometersであり、形成されつつあるピットや小胞に対応していると考えられます。EGFが主にダウンレギュレーションおよびエンドサイトーシスされる経路は、パネルDの1フレームあたりの局在データに基づき、グラフGに提示されています。このビデオを視聴することで、簡単なテストサンプルの作製、データの取得、および高品質なSTORM超解像画像の再構成方法について十分な理解を得ることができます。

これらの手法を用いることで、ドリフトなどの一般的なフィッティングにおける落とし穴を回避し、STORMを最適化することができます。解像度実験を参照してください。