Name: 最適STORM超解像顕微鏡のためのテストサンプル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 52 s
Description: 学ぶ STORM超解像顕微鏡の最適化のためのテストサンプル調製法。蛍光標識サンプルの作成、スイッチングバッファの使用、Rainstormソフトウェアによる画像再構成を含む。30〜50nmの解像度を達成する方法を解説。

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私たちは、英国の国家計量局の生物化学計測技術プログラムから資金提供を認めている。我々は技術的なアドバイスや提案のためにセバスチャン·ファン·デ·リンデ、ミクロスErdelyi、エリックリースに感謝します。私たちは、有益なコメントや、この原稿の議論のためにミクロスErdelyi、エリック·リースとMax Ryadnovに感謝します。

我々は、開示することは何もありません。

我々はいくつかの簡単なテストサンプルと、それは、嵐の超解像イメージングを最適化することが可能で、自由に利用可能な処理ソフトウェアの暴風雨で示しています。これらのツールや方法は、新規ユーザーとその顕微鏡での自信と前例のないディテールで生物学的および細胞構造を研究するためにそれらの利用を高めるために、経験豊富なユーザのための方法のための有用な出発点を提供します。このような精度の推定値、局在番号と、画像品質を向上させるため、より大きな自信を持つことが可能で示すヒストグラムを意味するように、既知の又は十分に理解された構造および有用な画像品質メトリックの数を生成することができるアルゴリズムを有するサンプルとの組み合わせを使用することによりSTORMイメージングプロセスにおいて。誰サイズを用いることができる別の商業的および自作の顕微鏡構成の数があるので、データを取得するすべてのアプローチに適合していないが存在する。また、インフルできる多くのサンプル調製および画像取得ステップがあります最終的なイメージは、そのためのソフトウェア·ツールとテストサンプルを持つことが理解とSTORM画質を最適化するために重要であるリファレンス。 さらに、これらのプロトコルは、発生する可能性のある問題のトラブルシューティングの役に立つと少ない曖昧な方法を提供することができます。例えばデキストランサンプルは任意のレーザービームの位置ずれや、サンプルの照明ムラがあるかどうかを識別するための非常に便利な方法です。スイッチングバッファは任意の「点滅」は役立つがあるかどうかを確認するのは非常に簡単な目視検査作業できないことが懸念されている場合。アクチンフィラメントは、FWHMの比較を使用して、解像度を測定するだけでなく、ドリフトや誤局在アーティファクトを強調表示する便利な方法です。しかしながら、局在型超解像法はフルオロフォア濃度に敏感であることができるように、例えば、露光時間、フレームレート、レーザパワーと画像が処理される方法のような他の要因、にもかかわらず、それを割り当てることが不可能であることに留意すべきである解像度特に顕微鏡や全ての画像がその解像度を持っていることを前提としています。何が可能であることは、しかしながら、そのような平均局在化精度、定位数と解像度の種々の態様を測定し、27ドリフトすることである。基準マーカは、彼らができる全ての実験に組み込むことができない場合でも、少なくとも、その環境、顕微鏡システムを特徴付けるために使用することが、より良いような起動時の後に熱平衡に到達するために必要な時間などの操作の考慮事項を理解する。この画像43を獲得している一方で、試料位置を補正する非点収差レンズとフィードバック機構の使用を必要とするが、同様に横方向のドリフトを補正するような、基準マーカは、軸方向のドリフトを特徴付け、正しいするために使用することができる。商業的な超解像システムは、通常、安定制御やフォーカスドリフトを補正するためのより実用的な解決策とすることができるフォーカスロック機構のいくつかの並べ替えを含む。 そこ非特異的な直接染料を使用するなど、デキストラン、または二次抗体のような他の共役分子とガラスをコーティングに代わる再。これらのアプローチの制限は、ガラスに結合した分子の数は知られていないことである。使用されている代替の糸状の構造は、微小管28とDNA 21が含まれています。しかし、非常に小型で便利な市販の試薬 ​​の組合せはまた、システム27の性能測定に有用であり得る、特に分岐または分岐状のフィラメントの分離距離として、魅力的な代替アクチン行う。 試験サンプルの更なる発展の余地がこのエリア28,29,46,47の最近の進歩にもかかわらず、そこにある。特に、マルチカラーイメージングは​​、イメージングのすべての3つの主要な側面で多くの課題は、サンプルラベリング、画像取得（ハードウェア）、ソフトウェア（画像処理及び配向）を示す。が行われているこれらの態様4-6に対処する多くの刊行物及び適切な試験サンプルおよび方法論は確実に画像を生成して、これらのタイプの解釈に重要であることは明らかである。実際、最近ではdSTORMがの2色画像を撮影し、解決し、核膜孔複合体の対称性の高い性質のために使用できることが示されており、著者らは、この色収差補正45の性能を評価するための理想的な方法であることが示唆された。もう一つの興味深いアプローチは、離れて46特定のサブ回折距離で位置決め蛍光体の可能性が作成さnanorulerを作成するためのDNA折り紙を使用することである。これは、解像度を評価し、距離測定を行う方法を提供する。しかし、究極の目的は、このような複雑な三次元構造である細胞のような非理想化されたサンプルを、これらの超解像技術を適用することである。この場合、tは、より完全な理解の組合せ彼は、データを取得し、適切な方法でそれを処理し、画像指標を提供する際にユーザを支援するソフトウェアツールと組み合わせた技術は、最終的な回答である可能性が高い。28,29,47,48

最近、光学顕微鏡技術の範囲は、典型的には、回折限界をバイパスし、100nm以下の1,2の良好な解像度を有する画像を生成することができる超解像顕微鏡またはナノスと呼ばれる、開発されている。 2008年のネイチャーメソッドメソッドであるとして超解像顕微鏡の発表以来、ローカリゼーションに基づく顕微鏡の開発に多大があった。例えば、マルチカラー用途3-6、3Dの実装7-12、さらに生細胞アプリケーション5,13-17がある。さらに、これらのシステムとして商品化されて、現在は生物医学の質問に、それらの使用およびアプリケーションのさらなる増加がありそうである細胞生物学者の手に光学研究室の外に自分の道を作っている。 このファミリーの一つの分岐は、画像分子ごとの分子を構築することにより動作するローカライズに基づいた方法である。私少数の空間的に分離された分子が一度にアクティブになるようにこれを行うには、n個の順序は、試料内の蛍光分子の大部分はオフにされなければならない。これらの分子は、その後急速にオンとオフを切り替えられ、人口のかなりの部分は、サブ回折精度で基本的な構造を反映して画像化されるように、多くの画像が取得されます。多くのアプローチがGSDIM 18パーム19、fPALM 20嵐21とRESOLFT 22を含め公表されている。単一分子検出の位置を測定するアルゴリズムは、次いで、例えばrapidSTORM 24,25 QuickPALM 26は、12 palm3d及び暴風雨27ガウスフィッティング23を用いて、20 nmより良好な精度で分子の実際の位置を特定するために使用することができる。細胞または高い分子密度を有する他の生物学的試料を撮像するときには、フレームの何千を取ることが必要であるこの点滅、空間的に分離され、信号の画像標識分子のかなりの割合するためである。 確率的光学再構築顕微鏡法（STORM）と高度に関連dSTORMとGSDIM方法は、市販の有機色素21を操作することが実証されている局在型超解像方式である。それらは、十分に確立されたので免疫標識の特異性および相対的な利便性の蛍光顕微鏡を実行するために接近するための方法論としては、特に魅力的な異なる色素の数28-30、に適用可能であることが示されている。その結果、局在型超解像イメージングに使用される可能性を有する色素 - 抗体および色素生体分子コンジュゲートの範囲への容易なアクセスがあった。 STORMと同様のアプローチの一般的な原則は、比較的簡単であり、一目で、ハードウェアとサンプル調製は比較的STRA思えるながらightforward、高品質、アーチファクトのない、超解像を実現するために不可欠なプロセスのステップがいくつかあります。 すべての顕微鏡技術と同様に、プロセスは、主に3つのステップであると考えることができる：第一、第二試料調製、画像取得と、第三の、画像処理および/または画像解析および解釈。局在ベースのアプローチを使用して超解像画像を生成する追加の解像力及び方法は、いくつかの新たな問題および考慮事項31-33を導入する。免疫標識は、一次及び二次抗体の組み合わせが使用され、特に間接免疫蛍光を行う際に試料調製から出発し、それは蛍光色素が離れて、​​目的の分子から最大20nmであってもよいことに留意すべきである。微小管の場合、これは、25ナノメートル28,30の予想される微小管の直径に比べて35〜50ナノメートルの直径をもたらす。また、標識密度べきメートル高品質な画像14を生成するためにナイキスト基準をEET。糸状構造に沿っ20nmの予想される画像の解像度については、例えば、少なくとも10nm毎27色素分子があるはずです。 、上の平衡 - 多くの染料は、ローカライズ系色素の全体的なパフォーマンスは、少なくとも4つの重要な基準は、イベントを切り替えるごとに、すなわち検出された光子（明るい方がよい各まばたきの明るさ）が混在しているアプローチのための仕事を出版されている一方でオフデューティ·サイクル（オフ状態での対中の染料のコントラスト比 - オフよりは一般的に優れている）、生存率（低脱色率が優れている）と、スイッチングサイクルの数（蛍光団ごとの点滅の数 - 詳細蛍光団ごとに1回点滅）は、分子の計数のために優位することができますが、高解像度のためのより良いです。状況はさらに、任意の所与の色素のためのこれらの特性は、異なる緩衝液条件で変化し得るという事実によって複雑になるレーザパワー28,29と。さらに、ならびにこれらのユニークなSTORMの考慮、画質が固定条件と消光試薬の使用の改変により自己蛍光を最小化することによって、例えば、より伝統的な蛍光顕微鏡法と同様にして試料調製を最適化することによって改善することができる。また、非特異的に結合したフルオロフォアを最小化するラベル濃度、インキュベーション時間、ブロッキングおよび洗浄工程を調整することによって行うことができ、これは重要である。 画像取得の第二段階は、非常に重要です。顕微鏡上の最適な設定は、染料、緩衝液条件、標識密度、およびサンプルタイプ、ガラス、細胞または組織サンプル上で、例えば単層に依存するであろう。主な考慮事項は、カメラ露出時間、フレーム番号、照明角度（TIRF、HILO、エピ）及びレーザーパワーである。目的は、可能な限り迅速な限り多くの明るい空間的に分離された点滅を収集することである。もし背景I再構成アルゴリズムは、正確な位置をローカライズすることができなくなり、非常に高いのか点滅し、非常に明るくはない、換言すれば、信号対雑音比が悪い。ならびに定位の精度を最大化する、各分子の位置に精度を測定することができる、すなわち 、画質もローカライゼーションの高い数に依存する。目的の分子の数が不足が画像化されている場合は、どちらかが悪い標識効率のために、過度の光退色または不適切なフレーム番号、ナイキスト基準が14,27の満たされてないので、結果の超解像画像は、点状かつ不連続になります。 そして最後に、第3の工程と、画像処理が、標準的な蛍光顕微鏡技術と比較して特に重要である。それはワット知って混乱することができるという選択肢の面で利点、および欠点でもあり、自由に、商業的に利用可能なアルゴリズムの範囲が、、ありますHICHは使用するのが最も適切である。例えば、生データが適切に間隔をあけ空間的に別個の点滅がある場合は、単一分子フィッティングアルゴリズムは暴風雨27、rapidSTORM 24,25で利用可能なスパースフィッティングアルゴリズムによって、たとえば、高精度かつ効率的にすることができ、12とQuickPALM 26ソフトウェアをpalm3d 。生データ信号をオーバーラップが多く含まれている場合は、より適切であるかもしれないアルゴリズムがDAOSTORM 34、図3（b）35とdeconSTORM 36が含まれています。さらに、これらのアルゴリズムは、超解像の画素サイズがあり得るような信号数、または点滅当たりの光子、並びにそのような平滑化ガウス関数、またはピクセルグリッドのヒストグラムとして可視化するような様々な異なる画像の表示オプションとして、様々な基準のしきい値を含有するユーザによって選択された。これらのオプションはすべて、最終的なイメージの外観を変更し、読影と分析のための意味を持っている。 <p class="jove_content"&gt;したがって、我々は明確化のために、私たちは、嵐のように呼びます染料ベースの局在型超解像実験、および、より経験のあるユーザの機会への出発点で新しいユーザーを提供する3試験サンプルを提示さらに彼らの実験を最適化します。まず、デキストラン - 色素複合体の蛍光体層をガラスの表面を被覆することができる。これは、顕微鏡、色素とバッファは蛍光シグナルを点滅生成する機能していることを確立するための迅速かつ簡単な方法を提供します。次に、この方法は、緩衝液条件を最適化する、画像取得の設定と異なる色素をテストするために風雨により生成された平均局在化精度および数のメトリックを比較することによって拡張することができる。第二に、我々は容易にファロイジン-色素複合体を用いて標識することができるガラス上のアクチンフィラメントを製造するための単純なプロトコルを提示する。これらは、解像度27の測定値を取ると、通常の半値全幅（FWHM）のに理想的な構造を提供するフィラメントの決議37の経験的な推定値として与えられている。これは、局在型超解像顕微鏡の解像度がフルオロフォアの明るさ、背景雑音および局在密度27の関数であり、これらは、試料全体にわたって必ずしも一定ではないので、解像度がサンプル間で、同一試料内の画像の間で変化することに留意すべきである。アクチンフィラメントは、mislocalizationsとドリフトとどのように暴風雨の中のソフトウェア機能と同一視されるように潜在的な成果物を示すために使用されている。また、我々は、メジャー、正しいドリフトの両方に蛍光基準マーカの使用を記載している。第三に、上皮成長因子（EGF） - 色素複合体を用いた細胞の染色は記載されている。細胞表面での受容体の割合は約50〜150 nは、サブ回折サイズの構造である小胞を介してエンドサイトーシスを受けるため、EGFは、超解像性能の有用な指標を提供する直径27,38,39中のm。

<table><tbody><tr><td>Labtek イメージングチャンバーガラス</td><td>フィッシャー</td><td>CBR-166-390E</td><td>サンプル調製</td></tr><tr><td>倒立顕微鏡 </td><td>オリンパス</td><td>IX71</td><td>* 代替品については以下を参照してください</td></tr><tr><td>100 X TIRF 対物レンズ</td><td>オリンパス</td><td>UAPON 100XOTIRF</td><td>* 代替品については以下を参照してください</td></tr><tr><td>EMCCD カメラ</td><td>Andor</td><td>iXon 897</td><td>* 代替品については以下を参照してください</td></tr><tr><td>640 nm レーザー</td><td>Toptica</td><td>iBEAM-SMART-640-S</td><td>*150 mW - Alexa 647またはCy5色素のイメージング用</td></tr><tr><td>LabVIEW</td><td>National Instruments</td><td></td><td>*データ収集ソフトウェア(制御ハードウェア)</td></tr><tr><td>PC </td><td>Dell</td><td></td><td>Windows XP (64ビット)、Intel Xeon E5420 CPU、16 GB RAM *機器制御および画像処理</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td></td><td>画像解析および処理 <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij</a></td></tr><tr><td>rainSTORM</td><td>Laser Analytics Group (Cambridge) software</td><td></td><td><a href="http://laser.cheng.cam.ac.uk/wiki/index.php/Resources" target="_blank">http://laser.cheng.cam.ac.uk/wiki/index.php/Resources</a</td></tr><tr><td>>MATLAB</td><td>Running rainSTORM</td><td></td><td><a href="http://www.mathworks.co.uk/products/matlab/" target="_blank">http://www.mathworks.co.uk/products/matlab/</a></td></tr><tr><td>*自作のSTORM/PALM顕微鏡</td><td></td><td></td>の例 参考文献<td>29も参照してください<a href="http://code.google.com/p/quickpalm/wiki/Tutorial_CustomMicroscope" target="_blank">http://code.google.com/p/quickpalm/wiki/Tutorial_CustomMicroscope</a></td></tr><tr><td>*市販のSTORM/PALM超解像顕微鏡</td><td></td><td></td><td>Leica SR GSD, Nikon N-STORM, Vutara SR-200, Zeiss Elyra P.1, DeltaVision OMX Blaze (Monet Localization) 自作顕微鏡の代替品<</td></tr><tr>td colspan="4">表 1. 材料と機器 </td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>PBS (10X)</td><td>Fisher</td><td>VX70013065</td><td>1; 2; 3; 4</td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine</td><td>Sigma</td><td>P4707</td><td>1.1; 2.1</td></tr><tr><td>Dextran-Alexa fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>D-22914</td><td>1.2</td></tr><tr><td>General actin buffer</td><td>Cytoskeleton Inc</td><td>BSA01</td><td>2.2</td></tr><tr><td>Preformed-actin filaments</td><td>Cytoskeleton Inc</td><td>AKF99</td><td>2.2</td></tr><tr><td>Phallodin-Alexa fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>A22287</td><td>2.2</td></tr><tr><td>TetraSpeck Microspheres (0.1 micron)</td><td>Invitrogen</td><td>T-7279</td><td>3.1</td></tr><tr><td>HeLa細胞</td><td>ATCC</td><td>CCL-2</td><td>4.1</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Fisher</td><td>VX31966021</td><td>4.1</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Fisher</td><td>VX10500064</td><td>4.1</td></tr><tr><td>Pen/Step</td><td>Invitrogen</td><td>15070063</td><td>4.1</td></tr><tr><td>プラスチック皿</td><td>Invitrogen</td><td>734-0006</td><td>4.1</td></tr><tr><td>EGF - Alexa fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>E35351</td><td>4.3 BSA</td></tr><tr><td></td><td>Σ</td><td>A7906</td><td>4.3, 4.4</td></tr><tr><td>ホルムアルデヒド - 10% 溶液 EMグレード</td><td>Polysciences</td><td>04018-1</td><td>4.2</td></tr><tr><td>カタラーゼ</td><td>Σ</td><td>C100</td><td>5.1</td></tr><tr><td>グルコースオキシダーゼ</td><td>Σ</td><td>G2133</td><td>5.1</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Σ</td><td>P9541</td><td>5.1</td></tr><tr><td>TCEP</td><td>Σ</td><td>C4706</td><td>5.1</td></tr><tr><td>Tris Σ</td><td></td><td>93352</td><td>5.1</td></tr><tr><td>Glucose</td><td></td><td>Σ C7528</td><td>5.2</td></tr><tr><td>MEA-HCl</td><td>Σ</td><td>M6500</td><td>5.3</td></tr><tr><td>Glycerin</td><td>Σ</td><td>G2289</td><td>5.1; 5.2</td></tr><tr><td colspan="4"><強>表 2.</強>試薬</td></tr></tbody></table>

最適storm超解像顕微鏡のためのテストサンプル

Test Samples for Optimizing STORM Super-Resolution Microscopy

嵐は標準的な蛍光顕微鏡技術よりも最大で10倍の分解能で最近開発された超解像顕微鏡技術です。しかし、画像は通常よりも非常に異なる方法で取得されるように、分子による分子画像を構築することにより、それらの画像取得を最適化しようとするユーザーのためのいくつかの重要な課題が存在する。このプロセスを支援し、嵐が、我々は3つの試験試料の調製とNM 30〜50の間の典型的な解像度で超解像画像を取得し、処理嵐の方法論を提示する仕組みを、より深い理解を得るために。無料公開暴風雨処理ソフトウェアを用いて、試験サンプルを組み合わせることにより、画質と解像度についての情報を大量に得ることができる。これらの指標を用いることで、調製、染料の選択、緩衝液条件、及び画像取得設定をサンプリングするために、光学系から撮像手順を最適化することが可能である。我々このような横方向のドリフト、「誤った局在」現象が、その結果、画像取得および密度に関連する問題中の試料の移動に伴って低画質になり、いくつかの一般的な問題のLSOの例を示している。

我々は3つの試験試料の調製及びそれらがどのように最適化し、STORM顕微鏡の性能を評価するために用いることができるが記載されている。これらの実施例を用いて、我々は、生データを取得し、次いで約30〜50 nmの分解能の細胞において、超解像画像を取得するためにそれを処理する方法を示す。

最適STORM超解像顕微鏡のためのテストサンプル

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy ...

この手順の全体的な目的は、高品質なSTORM超解像画像を撮影する方法を実証することです。まず、蛍光標識したテストサンプルを調製します。次に、スイッチングバッファーを調製し、イメージングチャンバーをそのバッファーで満たします。次に、STORM顕微鏡を用いて生データを取得します。最終ステップは、Rainstorm処理ソフトウェアを使用して、生データから超解像画像を再構成することです。最終的に、これらのテストサンプルを用いて高品質な生データの取得方法を示し、それを処理することで、細胞内の30～50 nanometersの分解能を持つSTORM超解像画像を生成します。これは、TIRFや共焦点顕微鏡を含む従来の蛍光顕微鏡技術と比較して、5倍から10倍の分解能向上に相当します。一般的に、この手法に慣れていない方は、高品質なスパースリンクを大量に収集することの重要性に気づかず、苦労することがあります。適切なスイッチングバッファーを用いてAlexa 647 dyeを使用することで、この作業は格段に容易になります。SPR分解能画像を生成するには、高品質な生データを取得することが不可欠であるため、この手法の視覚的なデモンストレーションが重要となります。この手法の生のビデオシーケンスは、他のあらゆる形式の蛍光顕微鏡法とは全く異なって見えます。ガラスに蛍光デキストリンをコーティングする手順を開始するには、まず8チャンバーカバーガラスの各ウェルに0.01% polylysine溶液を200 µL加え、10分間インキュベートします。10分後、ピペットでpolylysine溶液を取り除き、液体が残っていないことを確認してください。デキストリン Alexa 647の2 mg/mLストック溶液0.25 µLを脱イオン水25 µLに加え、20 µg/mL溶液を調製することで、デキストリン Alexa 647溶液の高密度コーティングを作成します。20 µg/mL溶液20 µLを、脱イオン水で最終的に200 µLになるように希釈します。中密度の溶液にする場合は、2 µLを脱イオン水200 µLで希釈します。低密度の溶液にする場合は、0.2 µLを希釈します。脱イオン水200 µLに対し、希釈したデキストリン Alexis X 47溶液200 µLを各ウェルに加え、10分間インキュベートします。インキュベート時間を長くすると、より緻密なデキストリンコーティングが得られる場合があります。最後に、Dexter Xis X 47溶液を除去し、水で3回洗浄します。ガラス上に蛍光アクチンフィラメントを調製するには、まず、8ウェルのチャンバーの各ウェルに0.01%ポリリシン溶液を200 µL加えます。カバーガラスで覆い、10分間インキュベートします。その後、液体が残らないようにピペットで除去します。メーカーの指示に従ってあらかじめ調製した一般アクチンバッファーを、各チャンバーに 90 µL 加えます。次に、10 µM の既製アクチンフィラメント溶液を 10 µL、および foid と Alexa 647 を 1 µL 加え、ピペッティングで穏やかに混合します。室温で 30 分間インキュベートし、基準マーカーとなる蛍光マイクロビーズを調製します。テペックビーズ 1 µL を 200 µL の PBS で希釈し、混合します。希釈したビーズをイメージングチャンバーに加え、15 分間待ちます。15分後、溶液を除去し、イメージングを行う前にPBSで3回洗浄します。本実験では、コンフルエンシーが約80%になるまで培養した細胞を使用します。培地を除去してPBSで洗浄します。その後、4%ホルムアルデヒド溶液500 microlitersを加え、10分間置きます。ホルムアルデヒドを除去し、PBSで3回洗浄します。細胞を乾燥させないようにし、常にPBS緩衝溶液を使用してください。低張ストレスを避けるため、50 µg/mLのEGF Alexa 647ストック溶液2 µLを0.1%BSA溶液200 µLに加え、その後、この溶液をHeLa細胞に添加します。室温で30分間インキュベートします。溶液を除去し、PBSで3回洗浄します。0.1%BSAのブロッキング溶液を加え、室温で15分間静置します。その後、ブロッキング溶液を除去し、イメージング前にPBSでさらに3回洗浄します。イメージングの直前に、酵素グルコースおよび還元剤のストック溶液を50 µL、400 µL、100 µLの比率で混合し、PBSを加えて最終容量を1 mLにしてスイッチングバッファーを調製します。イメージングチャンバーからPBSを除去し、スイッチングバッファーを上まで満たします。カバーガラスをチャンバーの上に慎重に載せ、気泡が全くなく、チャンバー全体が覆われていることを確認します。気泡が見られる場合は、バッファーまたはPBSを追加して補充してください。そうしないと、バッファーの性能が低下する可能性があります。この手順を成功させるには、高品質で疎なリンキングデータの収集が不可欠であるため、顕微鏡の焦点が適切に合っていること、および正しい取得設定が使用されていることを確認してください。イメージングの対象となる目的の蛍光構造を特定します。希望する照明角度を選択してください。本ケースでは、特に細胞サンプルの場合に、焦点外の光を最小限に抑えてSN比を向上させることができるため、ターフ（turf）または高傾斜角が推奨されます。STORMイメージングを行う前に、構造の分画制限画像（fraction limited image）をリファレンスとして取得してください。カメラ設定を露光時間10 millisecond、サイクル時間を約50 hertzまたはframes per secondに設定し、励起レーザーを約2 kilowatts per centimeter squaredに相当する高出力に上げてイメージングを行います。flora foursがまばらな点滅パターンに移行したら、10,000フレームを収集します。この再構成を開始するには、MATLAB内でRAINSTORM Mファイルを開き、rainstormウィンドウで実行してください。参照ボタンを使用して、解析する画像ファイルを選択します。ファイル形式はTIFである必要があります。使用した顕微鏡システムの生データに合わせてピクセル幅を変更してください。その他の値はデフォルトのままにします。「process images」ボタンを押し、暫定的な画像が表示されるまで待ちます。処理にかかる時間は、ファイルサイズ、コンピュータのスペック、および生データ内の候補リンクの数によって異なります。更新された超解像画像を生成するには、[open reviewer]ボタンを押すと、2つ目のウィンドウが表示されます。[adjust contrast]ボタンを押して、必要に応じて画像表示を変更してください。画像が非常に暗い場合は、最大値を下げてください。レビュアーウィンドウを使用して、有用な画像品質メトリクスを生成し、超解像画像をさらに精査します。最初の3つの品質管理パラメータは、それぞれ5,000、0.1、0.8～3.5のデフォルト値のままにします。photonあたりのカウント値を更新してください。局在化精度のカットオフ値を変更することで、平均局在化精度と局在化数のトレードオフを最適化します。最終画像では、データの品質やサンプルに応じて30から50 nanometersの値を推奨します。再構成スケール因子のデフォルトは5であり、元の画像の画素サイズが160 nanometersであると仮定すると、32 nanometersの超解像画素が生成されます。元の画像のピクセルサイズが100 nanometersである場合、ピクセルサイズ20 nanometersの超解像画像が生成されます。スケール係数を大きくすると、より小さい超解像ピクセルを生成できます。最終画像で、「run reviewer」ボタンを押して、更新された超解像画像を生成してください。画像品質メトリクスを表示するために、view histogramsボタンを押します。最後に、レビュアーにあるsave imageボタンを押し、これらのすべてのデータを保存します。前述の手順と同様の方法で画像を生成し、この操作を開始してください。レビュアーのボックス追跡ボタンを押し、レビュー中の画像上のフィデューシャルマーカーを囲むようにボックスをクリックしてドラッグします。ボックスの位置が表示された新しい画像が現れるまで待ちます。関心対象がフィデューシャルマーカーである場合は、必要に応じてこの画像を保存してください。ここで行っているように、「set anchor」ボタンをクリックし、続いて「subtract drift」ボタンをクリックしてドリフト補正を行います。最後に、再度「run reviewer」をクリックして、新しいSTORM画像を生成します。デキストリンのコーティングが成功すると蛍光単分子層が形成され、この図に典型的なデキストリンのデータを示しています。回折限界画像は、STORMイメージング前の異なる濃度のデキストリンを示しています。超解像再構成のピクセルサイズは 25 nanometers です。128 by 128 pixel のフレームサイズで 10,000 枚の画像が収集され、そのシーケンスから個々のフレームが表示されています。デキストリン濃度が高い場合、これらの画像およびビデオセグメントに示されているように、蛍光単分子層は比較的均一に現れます。低濃度では、点滅がよりまばらに、かつ焦点が合った状態で現れます。一定のレーザー照射下でのこの画像取得フェーズにおいて、顕著なバックグラウンドが存在しない場合、高密度サンプルにおけるフレーム2000とフレーム8,000の比較で示されるように、ブリンキングの回数は時間とともに減少します。高、中、低デキストリン濃度の超解像画像における主な違いは、ローカリゼーション数の減少です。このグラフは、各デキストリン濃度の10,000フレームのシーケンス3回の平均を示しており、エラーバーは標準偏差を表しています。しかしながら、生データにおける蛍光分子の濃度、ブリンク回数、および局在化回数の間の比例関係は、この1フレームあたりの承認済み局在化回数のプロットで示されているように、単純な線形関係ではありません。非常に高い分子密度において100フレームの移動平均を用いた場合、ソフトウェアはどのようなサンプルをイメージングしても分子の局在化に成功できなくなります。よくある問題として、媒体を通じて拡散した蛍光物質によって、画像全体に明るいが焦点の合っていない蛍光ヘイズ（霧状の光）が発生することが挙げられます。これらの脱離した蛍光分子は、スイッチングバッファーを添加する前にPBSによる洗浄回数を増やすか、またはチャンバーに新しいスイッチングバッファーを添加することで、防止または除去することが可能です。各画像シーケンスから得られたデータを処理し比較すると、超解像画像に大きな違いが生じます。パネルCおよびDは、それぞれパネルAおよびBで収集されたデータに対応する超解像画像の構築結果です。このグラフは、100フレームの移動平均を用いて、1フレームあたりの許容ローカリゼーション数をプロットしたものです。赤線はバックグラウンドが高いストームシーケンスAおよびCに対応し、青線はバックグラウンドが低いBおよびDに対応しています。高および低バックグラウンドデータに対応する画像の許容ローカライゼーション数は、2番目のグラフに示されています。これら3つの回折限界画像は、スイッチングバッファーの添加およびストームイメージングを行う前に、ガラス表面に付着した事前形成アクチンフィラメントの典型的なデータを示しています。フィラメントの長さにはばらつきが見られます。非常に明るいフィラメントは、多くの場合、複数のフィラメントが絡まり合ったものです。取得段階において、絡まり合った領域ではなく、比較的明るい単一のフィラメントを選択することで、より高品質な画像が得られます。フィラメントの全長にわたって、焦点が合った明るい点滅が観察されるはずです。点滅は、データ取得段階およびその後のデータ処理において、まばらに観察されるはずです。細く連続したフィラメントが認められ、1フレームあたりの局在数は緩やかに減少していくはずです。通常、フィラメントの半値全幅（FWHM）は、Image Jのプロファイルプロット機能を用いてアクチンフィラメントの拡大領域に直線を drew し、その後にガウスフィッティングを行うことで、解像度の経験的推定値として算出されます。この例では、FWHMは 43.2 nanometers と計算されます。また、多くのアクチンフィラメントが分岐または交差している場合に誤局在の問題が発生することがありますが、これはフレームのサブセットを処理し、最初と最後の 5,000 フレームを比較することで確認できます。最初の5,000フレームを用いた超解像画像では、異なる画像が得られます。画像の中央に多くのローカライゼーションが認められます。しかし、最後の5,000フレームを用いた場合、これらのローカライゼーションの多くは消失し、フィラメントのみが残りますが、画像内のローカライゼーション数が少ないため、やや不連続な状態となります。点滅密度が高すぎると疑われる場合、画像とフレームごとのローカライゼーションデータを比較することで、最初のフレーム群の間にこの問題が発生していることを強く示唆できます。最後のフレーム群では1フレームあたりの平均ローカライゼーション数が約4回であるのに対し、最初の方は10回を超えています。STORM顕微鏡におけるもう一つの潜在的な問題はドリフトであり、これは対物レンズに対して試料が移動したときに発生します。データ取得段階において、画像取得中に検出することは非常に困難ですが、アクチンフィラメントなどの既知の構造の超解像画像でドリフトを検出することが可能です。横方向のドリフトが発生したことを示す最初の兆候は、構造体が予想よりも大きくなることです。例えば、rainstormの精度限界データと比較して、半値全幅が相対的に大きくなる場合が挙げられます。この例では、67 nanometersに対して90 nanometersとなります。ドリフトを検出するより優れた方法は、時間の関数として局在化を比較すること、すなわち、初期フレームの局在化と比較して、後続フレームの局在化が変位しているかを確認することです。これは、アクチンフィラメントをカラーコードで表示した場合に明確に確認できます。パネルBおよびCに示すように、rainstormのボックストラッキング機能を使用すると、ローカリゼーションは取得時のフレーム番号に対応する色で表示されます。例えば、取得シーケンスの初期のローカリゼーションは青色で、取得シーケンスの後期のローカリゼーションは赤色で表示されます。色のずれは、測定および補正が必要なドリフトが発生したことを示しています。ドリフトの測定には、直径100 nanometerの蛍光ビーズを基準マーカーとして使用できます。1から4の番号は、個別に切り出して拡大したビーズを示しています。取得フェーズ中の3分10秒間で、約100 nanometersという比較的激しいドリフトが発生した例では、同じボックストラッキング機能を使用して色分けし、ドリフトの発生を確認できます。この例では4つのビーズすべてにほぼ同一のドリフトが見られるため、そのうちの1つ（この場合はビーズ2）をリファレンスとして選択し、他のビーズからドリフト分を差し引くことが可能です。パネルEとの比較により、横方向のドリフトが補正されたことがわかります。最後に、上皮成長因子で染色したHeLa細胞を用いて、画像解像度の現実的な例を示します。細胞の例では、パネルAにHeLa細胞の一部の回折限界画像を示しており、基底細胞表面に焦点が合わせられています。ここで、黄色のボックスは拡大した関心領域を示しており、回折限界画像における不明瞭な関心領域とは対照的に、パネルBおよびCにその拡大像が示されています。超解像画像では、クラスターと、時折現れる孤立した単一ピクセルの混合状態が示されるはずです。クラスターの直径は約100 nanometersであり、形成されつつあるピットや小胞に対応していると考えられます。EGFが主にダウンレギュレーションおよびエンドサイトーシスされる経路は、パネルDの1フレームあたりの局在データに基づき、グラフGに提示されています。このビデオを視聴することで、簡単なテストサンプルの作製、データの取得、および高品質なSTORM超解像画像の再構成方法について十分な理解を得ることができます。これらの手法を用いることで、ドリフトなどの一般的なフィッティングにおける落とし穴を回避し、STORMを最適化することができます。解像度実験を参照してください。

test-samples-for-optimizing-storm-super-resolution-microscopy

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

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単一のビリオン原子間力顕微鏡と超解像蛍光イメージングのサンプル調製

学ぶ STORM超解像顕微鏡の最適化のためのテストサンプル調製法。蛍光標識サンプルの作成、スイッチングバッファの使用、Rainstormソフトウェアによる画像再構成を含む。30〜50nmの解像度を達成する方法を解説。

最適STORM超解像顕微鏡のためのテストサンプル

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