膜タンパク質の単一分子局在顕微鏡法による単一抗体標識法

私の研究はT細胞の膜に焦点を当てており、治療的標的化に関連する新たなナノスケールの知見を明らかにすることを目指しています。既存の画像手法では、細胞内のナノスケールの抗体-エピトープ相互作用を直接可視化することは通常ありません。このプロトコルは、細胞環境内での直接観察を可能にすることで、その制約を克服しています。

試料を顕微鏡に取り付け、表面に金コロイドを堆着した後、明視野照射を用いて、関心領域内に十分なコロイドが沈着しているか確認します。進める前に、対象領域内に理想的な密度の5〜10金コロイドが存在することを確認してください。抗体プローブ蛍光色素の光学配置については、イメージングソフトを開き、光学設定にアクセスしてください。

適切な二色性ミラーを選択し、レーザー励起波長と出力密度を設定します。カメラの統合時間を調整し、放射フィルターを選択します。次に、カメラのピクセルビニングを150〜160ナノメートルのピクセルサイズに設定します。

次に、画像漂白のプロセスで画像漂白モードを選択して光学設定を作成します。レーザー出力を100%に設定し、カメラの統合時間を1秒に調整します。画像取得ソフトウェアで、非照明間隔、フレーム数、写真漂白ステップの周波数を定義してイメージングパラメータを設定します。

次に、CD81抗体をDPBS製の5%BSAを200マイクロリットル中に1マイクログラム/ミリリットル濃度に希釈してイメージングバッファーを準備します。最終推奨抗体濃度は、ジュルカットT細胞で0.5ナノモル、U-2 OS細胞で2ナノモルです。準備済みのイメージングバッファをセルを含む井戸に追加し、ソフトウェアで画像取得を開始してデータ収集を開始します。

膜単一抗体標識用に設定された画像診断ソフトのライブビュー機能を使い、抗体結合をリアルタイムで監視してください。画像取得ソフトウェアでイメージングパラメータを設定し、少なくとも10フレームの取得を得られるようにし、非照明の間隔を5秒に設定します。取得を開始し、録画中の単一分子局在の稀度を評価します。

イメージングバッファーを追加直後に複数の抗体結合イベントが重複したり、単一分子の局在が時間とともに蓄積した場合は取得を中止します。抗体濃度を2倍に減らし、新しいサンプルで同じ採取を繰り返します。抗体濃度を2倍に減らし、単位面積あたりのイベント数を再評価し、望ましい単一分子局在密度を達成するまで続けます。

イベント密度が低い場合は、イメージングバッファー内の抗体濃度を2倍に増やします。新しいサンプルで再度取得を行い、抗体濃度を2倍に増やしながら単位面積あたりの結合イベント数を再評価し、望ましい単一分子局在密度を達成するまで続けます。非照明間隔の最適化のために、画像取得ソフトウェアでイメージングパラメータを設定して50フレームの取得を実現します。

抗体を追加して取得を開始した後、録画中の単一分子局在の密度と稀度を評価します。最適な単一分子事象密度を得る非照射区間を最も低いものにします。最後に、画像取得の進行に伴い空間的に重なり合う結合イベントが発生した場合は、一定間隔で光漂白のステップを導入します。

結合抗体からの蛍光が重複する事象が蓄積する前に除去されるよう、光漂白の周波数を調整します。MATLABソフトウェアのファイルパスを、再構成されたMセルのコンマ区切られた数値ファイルを含むフォルダに設定します。MATLABのツールバーで「実行」をクリックしてコードを実行します。

求められたら、MセルのCSVファイルを選択し、「開く」をクリックしてプログラムに読み込みます。以前に定義した入力を出発点として解析を実行します。クラスタリングされていない局在化データを含む散布図の評価。

ノイズの局在数より大きく、セル上の局在数より低い最小点を選びます。クラスタ化されたデータを表示するウィンドウを評価してください。予想される表現型の細胞内でクラスターが保持され、細胞外の局在が最小限に抑えられていることを確認しましょう。

クラスタリングパラメータが厳しすぎる場合は、最小点を下げてイプシロンを増やします。クラスタリングパラメータがあまりにも包括的すぎる場合は、最小ポイント値を上げてイプシロンを下げます。最後に、最小点とイプシロンを調整した後、最適なクラスタリングを得るためにコードを再度実行します。

ジャーカットT細胞は膜の完全性を保ち、抗体が膜エピトープにアクセスできるように十分な間隔で固定されました。金コロイドは可視化され、M細胞画像取得中の側方ドリフト補正のためのフィデューシアルマーカーとして使用されました。非照射間隔の最適化により、5秒間隔は1ナノモル抗体濃度での短期間または長い間隔に比べて空間的重複が最小限で抗体結合イベントを生じることが示されました。

ドリフト補正の適用により、再構築されたM細胞画像は未補正再構築と比較して改善されました。密度に基づくM細胞局在のクラスタリングにより、低密度の背景相互作用が減少し、クラスター化されたCD81結合イベントが強調されました。細胞環境下で抗体が膜エピトープと相互作用する様子を観察でき、治療用抗体に関連する洞察を提供します。

抗体濃度、非照明間隔、光漂白のステップが最適化に不可欠です。最適でないパラメータは結果を損なう。単一抗体標識は、同一細胞環境内の複数の抗体による膜タンパク質結合を同時に評価するよう拡張可能です。