Name: バイオフィルムの細胞内および細胞外成分の同時定量(英語) (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-10T20:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: 学ぶバイオフィルムの細胞内・細胞外成分の同時定量法。共焦点レーザー走査型顕微鏡と蛍光染色を用いて、抗菌剤処理後のバイオフィルム構造を三次元的に可視化・解析する手法です。

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この研究の資金は、国立衛生研究所/NIDCR助成金1R15DE019566-01A1によって提供されました。 Dr. Jim Henthorn (OUHSC Flow and Image Cytometry Laboratory) は、共焦点レーザー走査型顕微鏡の技術支援を提供したことで知られています。フェルナンド・エステバン・フローレス博士(歯科材料学科)は、このビデオの撮影中に技術支援を提供してくれたことで知られています。

1. 培地および試薬の調製
<ol>
	<li>300 mlのオーバーナイト培養培地（THY；メーカーの指示に従って調製した3% Todd Hewitt Brothに、超純水で0.3% Yeast Extractを添加したもの）を作成し、オートクレーブ滅菌する。室温で最大2か月間保存可能である。</li>
	<li>1 LのTHY寒天培地（超純水に3% Todd Hewitt Broth、0.3% Yeast Extract、1.5% agarを溶解したもの）を作成し、オートクレーブ滅菌後、60 °Cまで冷却してからシャーレに分注する。4 °Cで最大3か月間保存可能である。</li>
	<li>150 mlのバイオフィルム増殖培地（10 mM sucrose添加0.5X TY；超純水に1.5% Tryptone、0.5% Yeast Extract、10 mM sucroseを溶解したもの）を作成し、フィルター滅菌する。室温で最大1か月間保存可能である。</li>
	<li>1 Lのリン酸緩衝生理食塩水（PBS；超純水に8 g NaCl、0.2 g KCl、1.44 g Na2HPO4、0.24 g KH2PO4を溶解したもの）を作成し、オートクレーブ滅菌する。室温で数か月間保存可能である。</li>
	<li>超純水を用いて、10 mM CaCl2を添加した600 mlの10 mM Tris HCl緩衝液（TC緩衝液；pH 7.2）を作成し、オートクレーブ滅菌する。室温で数か月間保存可能である。</li>
	<li>1 Lの超純水をオートクレーブ滅菌する。室温で数か月間保存可能である。</li>
</ol>
2. 試料の作製
<ol>
	<li>Point 4 (PF)およびTPHのディスク状試料を作製する3 カスタムメイドのステンレス製モールドに、歯科用コンポジットレジン（TP）を2回に分けて充填します。各層をLED光重合器を用いて40秒間光照射します。これら2つの製品は組成とフィラー含有量がわずかに異なり、その結果、バイオフィルムを形成させる表面形態に差異が生じます。
	<ol>
		<li>ステップ2.1の代わりに、他分野で確立されたプロトコルを用いて、関連する基質の試料を作製することも可能です。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>試料を適切に研磨し、許容される最終表面仕上げ状態まで仕上げます。 例： 半自動研磨機を用いて研磨する。研磨後の試料を超純水で洗浄し、圧縮空気で乾燥させる。</li>
	<li>エチレンオキシドガスまたは別の滅菌法を用いて、検体を滅菌する。</li>
</ol>
3. バイオフィルムの増殖
<ol>
	<li>S. mutansの単一コロニーを4 mlのオーバーナイト培養基（ステップ1.1）に接種する。37 °Cで16〜18時間、オーバーナイト培養する。培養液の吸光度（OD600）は≥0.9である必要がある。
	<ol>
		<li>バイオフィルムの増殖をより一定にするため、元のストックから2回継代させたプレート培養のコロニーを使用することが望ましい。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>オーバーナイト培養液（ステップ1.1）を用い、10 mlのバイオフィルム増殖培地（ステップ1.3）で1:100希釈液を作成する。</li>
	<li>滅菌済みのレジン複合樹脂試料（e.g. PF, TP）を滅菌済みの12ウェルプレートに移す。</li>
	<li>処理群（マウスウォッシュ）および対照群のウェルに、希釈した培養液（ステップ3.2）を2.5 mlずつ加える。無菌対照ウェルには、接種前の滅菌済みバイオフィルム増殖培地を2.5 ml加える。</li>
	<li>微好気条件下でバイオフィルムを増殖させる。プレートをシェーカーに設置し、37 °Cのインキュベーター内で100 rpmで24時間振盪培養する。</li>
	<li>24時間後、すべてのウェルから培地を無菌的に吸引し、滅菌PBS（ステップ1.4; 2.5 ml/well）で2回洗浄し、洗浄ごとにPBSを吸引する。各ウェルに新鮮なバイオフィルム増殖培地を2.5 ml補充し、前ステップと同一の条件でさらに24時間インキュベートし、バイオフィルムの総増殖時間を48時間とする。</li>
	<li>上記の手順に代えて、確立されたプロトコルを用いて他の種のバイオフィルムを基質上で増殖させることができる。</li>
</ol>
4. 抗菌剤／マウスウォッシュ処理
<ol>
	<li>バイオフィルムの増殖が完了した後、培地を吸引除去する。</li>
	<li>治療群のウェルにBiotène PBF (BIO) または Listerine Total Care (LTO) マウスウォッシュ、あるいはその他の治療手段を2.5 ml添加し、対照群のウェルには滅菌超純水を2.5 ml添加する。製造元の指示に従い、オービタルシェーカーを用いてプレートを150 rpmで振盪させながら、検体を60秒間浸漬させる。その後、直ちにウェルからマウスウォッシュまたは超純水を吸引除去する。</li>
	<li>オービタルシェーカーを用いて150 rpmで振盪させながら、滅菌超純水で1回15秒間の洗浄を5回行い、各洗浄ステップ後に水を吸引除去する。</li>
	<li>上記のステップに代わり、確立されたプロトコルを用いて他の抗菌剤を試験することも可能である。</li>
</ol>
5. 染色
<ol>
	<li>バイオフィルム解析用の染色希釈液を調製する。
	<ol>
		<li>0.1 M 重炭酸ナトリウム（pH 8.3）を用いて、Concanavalin A Alexa Fluor 647 共役体（AF）の 5 mg/ml ストック溶液を調製する。凍結融解は避けるべきであるため、1回使い切り分に分注し、-20 °C で数ヶ月間保存する。この AF ストック溶液を用いて、TC バッファーで 250 μg/ml に希釈した溶液を調製する。</li>
		<li>メーカー提供の 5 mM Syto 9 ストック溶液（SY）を TC バッファーで 10 μM に希釈して調製する。残った SY ストック溶液は -20 °C で数ヶ月間保存する。</li>
		<li>メーカー提供の 5,000x Sypro Red ストック溶液（SR）を滅菌超純水で 10x に希釈して調製する。残った SR ストック溶液は -20 °C で数ヶ月間保存する。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>すべてのバイオフィルムを TC バッファー（2.5 ml/ウェル）で、手で円を描くように振って 2 回洗浄し、2 回目の洗浄液をプレートに残したまま室温で 30 分間静置する。その後、吸引して除去する。</li>
	<li>各バイオフィルム検体に AF 染色液を 50 μl 滴下する。遮光条件下、室温で 30 分間染色する。TC バッファー（2.5 ml/ウェル）で 2 回洗浄し、各洗浄後に吸引して除去する。</li>
	<li>続いて、各バイオフィルム検体に SY 染色液を 50 μl 滴下する。遮光条件下、室温で 30 分間染色する。滅菌超純水（2.5 ml/ウェル）で 2 回洗浄し、各洗浄後に吸引して除去する。</li>
	<li>最後に、各バイオフィルム検体に SR 染色液を 50 μl 滴下する。遮光条件下、室温で 30 分間染色する。滅菌超純水（2.5 ml/ウェル）で 3 回洗浄し、各洗浄後に吸引して除去する。</li>
	<li>共焦点顕微鏡観察を容易にするため、検体を 6 ウェルプレートに移し、1 ウェルあたり 1 つの検体を 6 ml の滅菌超純水に入れる。</li>
</ol>
6. 共焦点レーザー走査顕微鏡を用いたイメージング
<ol>
	<li>表1に示す共焦点レーザー走査顕微鏡の設定を用いて、処理群および対照群のバイオフィルム内における各構成要素（染色）の画像を取得する。本研究では、開口数 0.9、作動距離 2.2 mm の 63X 水浸レンズを使用した。 
	<img alt="バイオフィルム染色チャート。EPS、核酸、タンパク質のレーザー波長 (nm) および蛍光波長 (nm)。" fo:content-width="4.75in" src="/files/ftp_upload/50639/50639table1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="表1"> 
	表1. 共焦点レーザー走査顕微鏡の設定。</li>
</ol>

<ol start="2">
	<li>定量解析に十分な解像度でCLSM画像を取得するため、スキャンサイズを250 μm x 250 μmに、最小ピクセル解像度を512 x 512に設定します。</li>
	<li>SY染色を用いてバイオフィルム画像スタックの上限点と下限点を設定し、次に定量解析に適したzステップ（本研究では0.6 μm）を設定します。スキャンを開始する前に、QLUTオプションを使用して、画像および染色のパラメータ（i.e. PMT電圧およびオフセット）を最適化します。3D構築において各バイオフィルム構成要素をより判別しやすくするため、カラールックアップテーブルを使用して各染色に擬似カラー（SYは緑、SRは赤、AFは青）を割り当てました。</li>
	<li>同じバイオフィルム内の複数の染色の画像キャプチャを最適化するため、「between stacks」モードのシーケンシャルスキャンを用い、400 HzでCLSM画像を収集します。</li>
</ol>
7. バイオフィルムの構造解析
<ol>
	<li>バイオフィルム用の画像解析ソフトウェアを用いて、収集したCLSM画像を解析する。以下に、収集したバイオフィルム画像の構造パラメータを算出するためのISA3Dソフトウェア12の使用手順を説明する。
	<ol>
		<li>ソフトウェアのマニュアルに従い、各バイオフィルムのCLSM画像ファイルをImagesフォルダにコピーする。その際、ソフトウェアが要求するCLSMファイルの命名規則に従っていることを確認する。本ソフトウェアはバッチモードでのサブフォルダ内ファイルの解析が可能なため、処理群と対照群のバイオフィルムを同一ランで効率的に解析できる。</li>
		<li>メインダイアログボックスのdxyおよびdzフィールドに、CLSM画像のx軸、y軸、z軸の寸法を入力する。ソフトウェアのマニュアルに従い、閾値および距離マッピングの設定を選択する（本研究では、それぞれOtsu法とQuasi-Euclidean法を使用した）。結果ファイルに適した名前を入力し、プログラムを実行する。ISAフォルダに結果ファイルが生成される。</li>
		<li>結果ファイルを確認し、バイオボリュームや平均バイオフィルム厚（本研究で測定）など、バイオフィルム内の各成分（染色）の3D分布を定量化する20種類の3D構造パラメータ12の値を取得する。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8. バイオフィルム構造の可視化
<ol>
	<li>画像解析ソフトウェアを用いて、各バイオフィルム内の重複したコンポーネント（染色）の再構築を行う。以下に、Volocityソフトウェアを用いて3D再構築を行う手順を説明する。
	<ol>
		<li>マニュアルの記載に従い、CLSM画像ファイルをソフトウェアにコピーして、各バイオフィルムのライブラリを作成する。</li>
		<li>3D Rendererメニューオプションを使用して、各バイオフィルムのCLSM画像から再構築された3D画像を生成する（本研究ではHR Opacity形式を使用した）。</li>
		<li>3D画像を回転させ、すべてのバイオフィルムをx軸、y軸、z軸に対して同様の方向に向ける。正しく方向付けられたバイオフィルム再構築のスナップショットをキャプチャし、そのスナップショットをTIFF、JPEGまたはその他の適切な形式でエクスポートする。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>再構築された画像上で、バイオフィルム内のEPS、タンパク質、および核酸コンポーネントの共分布について視覚的解析を行う。</li>
	<li>ピアソン相関係数およびマンダース重複係数を用いて、複数のバイオフィルムコンポーネントの共局在解析を行う（本研究では共局在の測定は行っていない）。</li>
</ol>
9. 統計解析
<ol>
	<li>マウスウォッシュ群と対照群の間で構造パラメータの平均値を比較するために、個別の混合モデル統計解析を用いました（α=0.05）。本研究では、統計解析の実行にSASソフトウェアを使用しました。</li>
</ol>

<ol><li>Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+biofilms%3A+a+common+cause+of+persistent+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections.</a> Science. 284, 1318-1322 (1999).</li>
<li>Hall-Stoodley, L., Costerton, J. W., Stoodley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+biofilms%3A+from+the+natural+environment+to+infectious+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Bacterial biofilms: from the natural environment to infectious diseases.</a> Nat. Rev. Microbiol. 2, 95-108 (2004).</li>
<li>Yang, Y., Sreenivasan, P. K., Subramanyam, R., Cummins, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparameter+assessments+to+determine+the+effects+of+sugars+and+antimicrobials+on+a+polymicrobial+oral+biofilm%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Multiparameter assessments to determine the effects of sugars and antimicrobials on a polymicrobial oral biofilm.</a> Appl. Environ. Microbiol. 72, 6734-6742 (2006).</li>
<li>Klein, M. I., Xiao, J., Heydorn, A., Koo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+analytical+tool-box+for+comprehensive+biochemical%2C+structural+and+transcriptome+evaluation+of+oral+biofilms+mediated+by+mutans+streptococci%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">An analytical tool-box for comprehensive biochemical, structural and transcriptome evaluation of oral biofilms mediated by mutans streptococci.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li>
<li>Conchello, J. A., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+sectioning+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Optical sectioning microscopy.</a> Nat. Methods. 2, 920-931 (2005).</li>
<li>Robinson, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Principles of confocal microscopy.</a> Methods Cell Biol. 63, 89-106 (2001).</li>
<li>Neu, T. R., Kuhlicke, U., Lawrence, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+fluorochromes+for+two-photon+laser+scanning+microscopy+of+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Assessment of fluorochromes for two-photon laser scanning microscopy of biofilms.</a> Appl. Environ. Microbiol. 68, 901-909 (2002).</li>
<li>Wood, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architecture+of+intact+natural+human+plaque+biofilms+studied+by+confocal+laser+scanning+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Dental+Res%22%5BJournal%5D)">Architecture of intact natural human plaque biofilms studied by confocal laser scanning microscopy.</a> J. Dental Res. 79, 21-27 (2000).</li>
<li>Chen, M. Y., Lee, D. J., Tay, J. H., Show, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staining+of+extracellular+polymeric+substances+and+cells+in+bioaggregates%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Microbiol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Staining of extracellular polymeric substances and cells in bioaggregates.</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 75, 467-474 (2007).</li>
<li>Zinchuk, V., Zinchuk, O., Okada, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+colocalization+analysis+of+multicolor+confocal+immunofluorescence+microscopy+images%3A+pushing+pixels+to+explore+biological+phenomena%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Quantitative colocalization analysis of multicolor confocal immunofluorescence microscopy images: pushing pixels to explore biological phenomena.</a> Acta Histochem. Cytochem. 40, 101-111 (2007).</li>
<li>Dunn, K. W., Kamocka, M. M., McDonald, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+to+evaluating+colocalization+in+biological+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">A practical guide to evaluating colocalization in biological microscopy.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 300, C723-C742 (2011).</li>
<li>Beyenal, H., Donovan, C., Lewandowski, Z., Harkin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+biofilm+structure+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional biofilm structure quantification.</a> J. Microbiol. Methods. 59, 395-413 (2004).</li>
</ol>

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CLSM画像の取得は、バイオフィルムの定量化および共局在解析に必要な方法と形式で実行されなければならず、各画像のシグナル強度の分布がバイオフィルムスタック内の各蛍光色素の分布を確実に表現します。シグナル強度は、ノイズおよびバックグラウンド10,11と区別可能であり、基板からの自家蛍光の影響を受けず、使用された蛍光色素11間のスペクトル干渉によるブリードスルーが最小限でなければなりません。ノイズは蛍光顕微鏡11の避けられない制限であり、技術的またはロジスティックな理由により画質が制限される場合があります。スペクトルの重複が最小限に抑えられた蛍光色素の同定は、この方法の成功に不可欠ですが、複雑になる可能性があります。さらに、複数の蛍光色素の定量化は多因子の問題を引き起こします。したがって、バイオフィルムの構造内の2つ以上の成分の同時分布を定量化することに成功した研究がほとんどないことは驚くべきことではありません。
この研究の目的は、バイオフィルム内の3つの細胞および細胞外成分の同時3次元分布を定量化および比較するための、異なるが相互に関連するステップで構成される方法論を報告することでした。記載されているバイオフィルム成長アッセイは、 表1に報告された結果で示されているように、関連する基質上でのバイオフィルム成長を可能にし、再現性のあるバイオフィルム構造を生成します。EPS、タンパク質、核酸成分の新規同時染色と3Dバイオフィルム構造パラメータの測定の組み合わせにより、バイオフィルム内の成分の定量化可能な分布が得られます。バイオフィルム内のEPS、タンパク質、核酸の同時分布の定性的視覚分析は、各バイオフィルム内の重ねられた染色を再構築することによって可能です。ISA3Dソフトウェア12 には、バイオフィルムの3D構造の定量化を強化するために、気孔率やバイオフィルムの厚さなどの従来測定されたパラメータに加えて、フラクタル次元、均質性、バイオフィルム粗さ係数などのいくつかのユニークな構造パラメータが含まれています。バイオフィルム構造パラメータの統計分析により、抗菌/防汚効果(うがい薬による治療後など)または経時的(時間的効果)などの特定の実験条件下でのバイオフィルムの適切な比較が容易になります。
この方法論は、関連する基質上で増殖した S. mutans バイオフィルム内の 3 つの主要成分の同時 3D 分布を効率的かつ成功裏に定量化し、比較することで、バイオフィルム成分の同時評価に対する 2 つの課題を克服しました。この方法は、この研究でうがい薬を使用して示されているように、複数のバイオフィルム成分に対する抗菌処理または防汚対策の有効性を判断するためにも使用できます。さらに、上記のプロトコルの大部分は、関連する基質の作製および関連微生物のバイオフィルム成長アッセイのためのプロトコルに置き換えることができます。したがって、この方法は、医学、歯科、地質学、海洋科学を含むさまざまな分野における in vitro および in vivo バイオフィルムの 3D 構造/構造の比較を容易にするため、幅広い用途があります。

バイオフィルムは、自己生成した細胞外マトリックスにカプセル化され、生物学的または不活性な表面1に付着した構造化された微生物群集です。バイオフィルムは、多くの細菌に共通する生活様式であり、自由浮遊(プランクトン性)細胞から複雑な多種群集へと段階的に移行することで形成されます。バイオフィルムの抗菌剤に対する固有の耐性は、経口バイオフィルム(歯垢)で示されているように、多くの持続性および慢性の細菌感染症の根源にあります1,2。ミュータンス連鎖球菌などの齲蝕原性微生物は、ショ糖やその他の炭水化物を処理して細胞外マトリックスを生成し、歯の構造を脱灰して虫歯を引き起こす可能性のある酸を生成します。ほとんどのバイオフィルムマトリックスは、エキソ多糖類(EPS)、タンパク質、核酸などの細胞および細胞外成分からなる生体高分子です3,4。
蛍光イメージングに最も広く使用されている技術である共焦点レーザー走査型顕微鏡(CLSM)は、固定せずに水和した生物学的構造の3D画像を収集する能力を備えているため、生物学における光学イメージングを根本的に変えました5,6,7。この非破壊技術では、標本上の関心領域内の薄い切片の画像を、焦点が合っていない光の寄与が取り除かれるように収集します。CLSMで撮影された画像の品質と解像度は、広視野蛍光顕微鏡で達成可能なものを超えています。CLSMの大きな欠点の1つは、画像全体が同時に収集される広視野顕微鏡技術よりも画像のスキャンが遅いことです5。しかし、蛍光色素、レーザー、フィルターの選択肢が広がるにつれ、CLSMはマルチスペクトルイメージングの主流の手法の1つになりました5,7。
以前の研究では、CLSMは、バイオフィルム内、特に細胞外マトリックス内のEPSと細胞の分布をよりよく理解するために、1つまたは2つの蛍光タグまたは染色剤を使用してバイオフィルムの構造または構造を調べるための有用なツールであることが示されています7,8。理論的には、バイオフィルム内の細胞および細胞外成分の詳細な構造と共局在を探索するためには、複数の成分の蛍光染色/標識が望ましいとされています。しかし、バイオフィルム内のさまざまな成分の同時分析は、1)スペクトルのオーバーラップが最小限に抑えられる蛍光色素の選択が複雑であること、2)複数の蛍光色素の定量化が多因子の問題を引き起こすことなどから、困難な場合があります。複数の蛍光色素を用いた共局在化では、2つの蛍光色素のスペクトルピークが大きく重なり、一方が他方の蛍光色素9よりも強く励起されるブリードスルー効果を回避するために、スペクトル干渉を最小限に抑えた特異性の高い染色剤を使用する必要があります。理想的には、励起スペクトルが重なっていない蛍光色素が最良の結果を提供しますが、この基準を満たす染色を見つけることは非常に困難です。その代わり、蛍光スペクトルの重なりが最小の蛍光色素を選択することにより、染色物の選択が最適化され、限られた観察波長帯9内で染色物を1つずつ観察することができる。
蛍光画像の重ね合わせは、蛍光色素の同時分布を評価するためにおそらく最も広く使用されている方法です。さまざまなコンポーネントの共局在は、検査対象の蛍光色素10によって作成された複数のチャネルを通じて、異なる色の重なりとして現れます。マルチチャンネル蛍光画像をマージカラー画像として表示するためのツールは、ほとんどのCLSMソフトウェアと生物学的画像解析ソフトウェアで利用できます。画像の重ね合わせは、共局在の空間評価には有用ですが、画像は視覚的分析によってのみ定性的に調べることができます。これらの表現は一般に、異なる実験条件下での共局在を定量化するのに役立たず、また、共局在がランダムな偶然性11を超えるかどうかを決定するため、これは限られた量の情報を提供する。バイオフィルムやバイオフィルム成分の3次元構造を定量的に解析した研究はこれまでほとんどなく、抗菌処理や防汚対策がバイオフィルム成分に及ぼす影響を定量化した研究はさらに少ないのが現状です。
この研究の目的は、バイオフィルムの3つの細胞および細胞外成分の同時3次元分布の定量化と比較の方法論を報告することでした。この方法は、バイオフィルムの成長、染色、バイオフィルムのCLSMイメージング、バイオフィルムの構造分析と視覚化、および構造パラメータの統計分析を含む、明確でありながら相互接続されたステップで構成されています。バイオフィルム成長アッセイは、関連する基質上でのバイオフィルム成長を可能にし、再現性のあるバイオフィルム構造を生成します。EPS、タンパク質、核酸成分の新規同時染色と3Dバイオフィルム構造パラメータの測定を組み合わせることで、バイオフィルム内の成分の分布を定量化することができます。バイオフィルムの構造パラメータの統計的分析は、次のセクションで説明するように、特定の実験条件(例えば、うがい薬による処理後)でのバイオフィルムの評価を容易にします。

<table><tbody><tr><td>バクト寒天</td><td>ベクトン、ディキンソンアンドカンパニー</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>バクトトッドヒューイットブロス</td><td>ベクトン、ディキンソンアンドカンパニー</td><td>249240</td><td></td></tr><tr><td>酵母エキス、粒状</td><td>EMDミリポア</td><td>1.03753.0500</td><td></td></tr><tr><td>バクトトリプトン</td><td>ベクトン、ディキンソンアンドカンパニー</td><td>211705</td><td></td></tr><tr><td>OmniPurショ糖</td><td>EMDミリポア</td><td>8510</td><td></td></tr><tr><td>塩化カリウム、ACS試薬、99.0-100.5%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911-500G</td><td></td></tr><tr><td>リン酸カリウム、一塩基性、&ge;99.0%、ACS試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0662-500G</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888-500G</td><td></td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム、一塩基性、一水和</td><td>物 EMD Millipore</td><td>SX0710-1</td><td></td></tr><tr><td>トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン、99.8+%, ACS試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252859-500G</td><td></td></tr><tr><td>Concanavalin A、Alexa Fluor 647 Conjugate</td><td>Invitrogen</td><td>C21421</td><td></td></tr><tr><td>Syto 9</td><td>Invitrogen</td><td>S34854</td><td></td></tr><tr><td>Sypro Red</td><td>Invitrogen</td><td>S12012 または S6653</td><td></td></tr><tr><td>Biot&egrave;ne PBFオーラルリンス</td><td>グラクソ・スミスクライン</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>リステリントータルケア</td><td>マクニール-PPC株式会社</td><td></td><td>該当なし</td></tr></tbody></table>

バイオフィルムの細胞内および細胞外成分の同時定量(英語)

Concurrent Quantification of Cellular and Extracellular Components of Biofilms

共焦点レーザー走査型顕微鏡(CLSM)は、バイオフィルムの調査のための強力なツールです。バイオフィルム内の2つ以上の成分の同時分布を定量化することに成功した研究はほとんどありません。その理由は、1)スペクトルの重複が最小限に抑えられる蛍光色素の選択が複雑であること、2)複数の蛍光色素の定量化が多因子の問題を引き起こすためです。目標：関連する基質上に成長したバイオフィルムの3つの細胞/細胞外成分の同時3次元分布を定量化および比較する方法論を報告します。メソッド：この方法は、バイオフィルムの成長、染色、CLSMイメージング、バイオフィルムの構造解析と可視化、構造パラメータの統計解析など、相互に関連し合った明確なステップで構成されています。Streptococcus mutans(UA159株)のバイオフィルムを、Point 4およびTPH3樹脂複合材料の無菌標本上で48時間増殖させた。その後、標本をBiotène PBF(BIO)またはListerine Total Care(LTO)のうがい薬、または水(対照群;n = 5 /グループ)のいずれかに60秒間浸しました。バイオフィルムは、CLSMでイメージングする前に、細胞外高分子物質、タンパク質、および核酸について蛍光色素で染色しました。ISA3D画像解析ソフトウェアを使用して計算されたバイオフィルム構造パラメータは、バイオボリュームと平均バイオフィルム厚さでした。混合モデルの統計解析により、マウスウォッシュ群と対照群の構造パラメータを比較した(SASソフトウェア;α=0.05)。Volocityソフトウェアにより、オーバーレイされたバイオフィルムコンポーネント(蛍光色素)の3D分布を視覚化することができました。 業績：マウスウォッシュBIOは、両方の樹脂複合材料で対照(p<0.05)と有意に異なるバイオフィルム構造を生成しましたが、LTOはどちらの製品でも差(p>0.05)を生じませんでした。結論：この方法論は、関連する基質上のS.ミュータンスバイオフィルム内の3つの主要成分の同時3D分布を効率的かつ成功裏に定量化および比較し、バイオフィルム成分の同時評価に対する2つの課題を克服しました。この方法は、うがい薬を使用して示されるように、複数のバイオフィルム成分に対する抗菌剤/防汚剤の有効性を判断するためにも使用できます。さらに、この方法は、さまざまな分野でバイオフィルムの3D構造/アーキテクチャの比較を容易にするため、幅広い用途があります。

処置群（マウスウォッシュ）および未処置の対照群の代表的な結果をTable 2、Figure 1およびFigure 2に示す。Table 2は、ISA3Dソフトウェアを用いて算出したバイオフィルム構造パラメータであるバイオボリューム（μm3）および平均バイオフィルム厚（μm）の平均値と標準偏差を示している。対照群のバイオフィルムと有意に異なる（p&lt;0.05）マウスウォッシュ処置バイオフィルムの構造パラメータについて、その平均値と標準偏差を赤色でハイライトしている。混合モデルによる統計解析の結果、マウスウォッシュBIOは両方のレジン複合樹脂において対照群と有意に異なる（p&lt;0.05）バイオフィルム構造を形成したが、マウスウォッシュLTOはどちらのレジン複合樹脂においても有意な差（p&gt;0.05）を示さなかった。この結果は、2種類のマウスウォッシュ処置後に残存したバイオフィルムの細胞成分および細胞外成分が異なることを明確に示している。また、2つの基材（PFおよびTP）上で育成されたS. mutansバイオフィルムは、同様の条件下で育成され、かつ両基材ともに同様の研磨剤で研磨されていたにもかかわらず、その3D構造に差があったことも注目すべきである。
バイオフィルム内におけるEPS、タンパク質、および核酸の同時分布は、Volocityソフトウェアを用いて生成された3D再構成により可視化できる。図1および図2は、それぞれPFおよびTPレジン複合材上で育成した対照群のバイオフィルムの代表的な再構成像である。青色の染色はS. mutansバイオフィルム内のEPSを、緑色の染色は核酸を、赤色の染色はタンパク質を示している。それらの間の隙間は、水またはその他の非蛍光標識バイオフィルム成分によって占められている可能性がある。
<img alt="3D散布図、ダイナミックなデータ可視化、グラフ、インタラクティブな研究ツール、分析ディスプレイ。" fo:content-width="4.75in" fo:src="/files/ftp_upload/50639/50639fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50639/50639fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="図1"> 
図1. 対照群（マウスウォッシュ未処理）のPFレジン複合樹脂上で増殖したS. mutansバイオフィルムの代表的な3D再構築像。単一のバイオフィルム内で3種類の染色を同時に重ね合わせることで、S. mutansバイオフィルム内のEPS（青色染色）、核酸（緑色染色）、およびタンパク質（赤色染色）成分を同時に可視化できる。(1 Unit = 24 μm)。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50639/50639fig1large.jpg" target="_blank"> こちらをクリックして拡大図を表示</a>。
<img alt="3D細胞構造の可視化、蛍光顕微鏡法、空間データ解析、科学的グラフ。" fo:content-width="4.75in" fo:src="/files/ftp_upload/50639/50639fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50639/50639fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="図 2"> 
図 2. 対照群（マウスウォッシュ未処理）のTPレジンコンポジット上で増殖したS. mutansバイオフィルムの代表的な3D再構築像。単一のバイオフィルム内で3種類の染色を同時にオーバーレイさせることで、S. mutansバイオフィルム内のEPS（青色染色）、核酸（緑色染色）、およびタンパク質（赤色染色）成分を同時に可視化できる。(1 Unit = 24 μm)。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50639/50639fig2large.jpg" target="_blank">ここをクリックして拡大図を表示</a>。
<table border="1">
	<tbody >
		<tr >
			<td >複合レジン</td>
			<td ></td>
			<td colspan="2" >Point 4</td>
			<td colspan="2" >TPH3</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >マウスウォッシュ</td>
			<td >成分</td>
			<td >BV (μm3)</td>
			<td >MT (μm)</td>
			<td >BV (μm3)</td>
			<td >MT (μm)</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Biotène PBF</td>
			<td >核酸</td>
			<td >279,517±53,291</td>
			<td >9.32±2.80</td>
			<td >195,033±42,014</td>
			<td >7.45±3.70</td>
		</tr >
		<tr >
			<td ></td>
			<td >EPS</td>
			<td >344,902±56,386</td>
			<td >35.22±17.19</td>
			<td >197,840±62,351</td>
			<td >9.83±7.26</td>
		</tr >
		<tr >
			<td ></td>
			<td >タンパク質</td>
			<td >298,796±62,868</td>
			<td >54.21±21.65</td>
			<td >216,033±66,654</td>
			<td >24.33±39.64</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Listerine Total Care</td>
			<td >核酸</td>
			<td >355,707±110,444</td>
			<td >26.45±14.21</td>
			<td >273,296±47,323</td>
			<td >13.43±2.89</td>
		</tr >
		<tr >
			<td ></td>
			<td >EPS</td>
			<td >494,099±180,592</td>
			<td >64.90± 26.68</td>
			<td >329,150±47,145</td>
			<td >34.35±30.32</td>
		</tr >
		<tr >
			<td ></td>
			<td >タンパク質</td>
			<td >348,416±161,316</td>
			<td >58.68±47.28</td>
			<td >303,150±54,705</td>
			<td >34.18±41.46</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >コントロール（未処理）</td>
			<td >核酸</td>
			<td >388,375±42,152</td>
			<td >51.15±40.66</td>
			<td >327,809±39,400</td>
			<td >17.08±1.65</td>
		</tr >
		<tr >
			<td ></td>
			<td >EPS</td>
			<td >660,448±173,197</td>
			<td >91.37±74.84</td>
			<td >363,850±67,612</td>
			<td >28.33± 15.07</td>
		</tr >
		<tr >
			<td ></td>
			<td >タンパク質</td>
			<td >517,274±119,475</td>
			<td >127.96±73.84</td>
			<td >353,161±56,518</td>
			<td >21.17±4.41</td>
		</tr >
	</tbody >
</table>
表 2. BIOまたはLTOで処理したバイオフィルム、および未処理（コントロール群）のバイオフィルムにおける、バイオボリューム（BV）および平均バイオフィルム厚（MT）の平均値と標準偏差。 コントロール群のバイオフィルムと有意に異なる（p&lt;0.05）マウスウォッシュ処理バイオフィルムの構造パラメータについては、平均値と標準偏差を赤色でハイライトしている。

バイオフィルム内の3つの細胞および細胞外成分の同時定量と比較のためのプロトコルが提示されます。この方法論には、共焦点レーザー走査型顕微鏡、バイオフィルム構造解析および視覚化ソフトウェア、および統計解析ソフトウェアの使用が含まれます。

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is a powerful tool for investigation of biofilms. Very few investigations have successfully quantified ...

この手順の全体的な目標は、抗菌剤による処理後の 3 つの細胞内および細胞外バイオフィルム成分の同時 3 次元分布を定量化し、比較することです。これは、最初に樹脂複合試料を作製し、次に研磨することによって達成されます。第2ステップでは、目的のバイオフィルムを標本上に成長させ、抗菌剤で処理します。次に、バイオフィルムを蛍光色素で染色して細胞外高分子物質、核酸、タンパク質に作製し、共焦点レーザー走査型顕微鏡でイメージングします。最終ステップでは、重ね合わせた蛍光色素の3次元画像を再構築して、バイオフィルム成分の同時可視化を容易にし、バイオフィルム画像から構造パラメータを計算します。最終的には、バイオボリュームや平均バイオフィルムの厚さなどのバイオフィルム構造パラメーターの統計分析を実行して、治療群と対照群の違いを比較できます。この手順の主な利点は、既存の方法よりも、特定の条件下で成長したバイオフィルムの構造内の複数のコンポーネントの分布を特徴付けるために、異なるが相互接続された技術を使用することであり、手順が博士研究員のフェルナンド・フローレス博士と私の研究室の研究助手であるクリステン・スマート氏であることを示しています標本を作成するために、0.4またはTPHの3つの歯科用樹脂複合材料をカスタムに配置することから始まりますステンレス製の金型を作りました。次に、最初の増分をLED光硬化ユニットで40秒間重合します。2回目の増分で手順を繰り返した後、半自動グラインダーポリッシャーを使用して、硬化した試料を許容できる最終表面仕上げに研磨します。最後に、標本を滅菌してバイオフィルムを成長させます。まず、Sミュータンスの単一コロニーを4ミリリットルの一晩培地に接種し、次いで37°Cで培養物を16〜18時間インキュベートして、少なくとも0.9の光学密度を達成する。次に、培養物を10ミリリットルのバイオフィルム成長液中で1対100の比率で希釈します。培地は、滅菌樹脂複合試料を滅菌12ウェルプレートに無菌的に移し、次に希釈した培養物の2.5ミリリットルを各ウェルに加えます。うがい薬の治療および対照群では、無菌制御井戸に2.5ミリリットルの無菌未接種バイオフィルム成長剤を追加し、次いで100RPMのシェーカーでマイクロパラフィリック条件下で摂氏37度でバイオフィルムを成長させる。24時間後、すべての井戸から培地を無菌的に吸引し、各洗浄後に生理食塩水を吸引する2.5ミリリットルの滅菌PBSで各ウェルを2回洗浄し、次に各ウェルに2.5ミリリットルの新鮮なバイオフィルム成長培地を補充し、バイオフィルムの成長が完了してから48時間の持続時間の合計バイオフィルム成長について示したように、さらに24時間プレートをインキュベートします。 増殖培地を吸引し、2.5ミリリットルのうがい薬を各治療群の井戸に、2.5ミリリットルの滅菌超純水を対照群に分注します。オービタルシェーカーでプレートを150RPMで攪拌し、60秒後に、うがい薬とウェルからの超純水の両方を吸引して、バイオフィルムのエキソ多糖成分を染色します。各バイオフィルムを50 μLのLORコンジュゲートと室温で30分間インキュベートします。次に、各洗浄後に吸引する2.5ミリリットルのTCバッファーで標本を2回洗浄し、光から保護された室温で50マイクロリットルのサイトナイン滴で各バイオフィルムの核酸を30分間染色します。検体を2回洗浄した後、各バイオフィルムのタンパク質成分を50マイクロリットルのCipro redで室温で30分間染色し、光から保護します。検体を3回洗浄した後、ウェルごとに6ミリリットルの滅菌超純水を含む6ウェルプレートの個々のウェルに移し、共焦点顕微鏡による可視化を容易にし、処理群および対照群のバイオフィルム内の各成分染色の画像を取得します。Exorコンジュゲート染色によるエキソ多糖類の検出には、共焦点レーザー走査型顕微鏡のレーザーを以下の設定に設定し、633ナノメートルのレーザーと659〜749ナノメートルの発光バンドを使用して、Cyto nine染色による核酸の検出を行います。488ナノメートルのレーザーと495〜500ナノメートルの発光バンドを使用し、シプロの赤色染色によるタンパク質の検出には、543ナノメートルのレーザーと615〜651ナノメートルの発光バンドを使用します。次に、開口数0.9、作動距離2.2mmの63倍ディッピングレンズを使用します。ビトウィーンスタックモードでのシーケンシャルスキャンを使用して、400ヘルツの共焦点レーザー走査型顕微鏡画像を収集し、同じバイオフィルム内の複数の染色の画像キャプチャを最適化します。共焦点レーザー走査型顕微鏡画像を解析した後、速度画像解析ソフトウェアの3Dレンダラーメニューオプションを使用して、各バイオフィルム内の重ね合わせた成分染色の再構築された3D画像を作成します。次に、3D画像を回転させて、バイオフィルムの最適なビューを取得します。次に、バイオフィルム再構築のスナップショットをキャプチャし、スナップショットを適切な画像ファイル形式でエクスポートします。最後に、バイオフィルム内のexo多糖類の核酸とタンパク質成分の同時分布の視覚的分析を行います。再構築された画像では、ISA 3Dソフトウェアを使用してバイオボリュームや平均バイオフィルム厚さなどのバイオフィルム構造パラメータを計算し、この表では、統計解析ソフトウェアを使用して計算されたバイオフィルム構造パラメータの平均値と標準偏差値が表示されます。マウスウォッシュで処理されたバイオフィルムの構造パラメータの平均値と標準偏差の値が、対照群のバイオフィルムの値と有意に異なっていた値は、赤い混合モデルで強調表示されています。統計解析の結果、ビオテネPBFマウスウォッシュは、両レジンコンポジットの対照群と有意に異なるバイオフィルム構造を産生したのに対し、リステリントータルケアマウスウォッシュは、どちらのレジンコンポジットでも有意差を生じず、2回のマウスウォッシュ治療後に残った細胞内および細胞外のバイオフィルム成分の違いを明確に示しました。バイオフィルム内のエキソ多糖類、核酸、タンパク質の同時分布は、速度ソフトウェアを使用して生成された3D再構成によって視覚化できます。この図では、0.4上に成長した対照群バイオフィルムの代表的な再構成を、青色をエキソ多糖類に割り当てたことを示しています。Sミュータンスバイオフィルム内では、緑色は核酸に、赤色はタンパク質に割り当てられました。介在する空間は、蛍光標識されていない水または他のバイオフィルム成分によって占められてもよい。この図では、TPH上に成長させた対照群バイオフィルムを、前の図と同じ成分を色で表した3つの樹脂複合材料で代表的に再構成したものです。この手順は、医学、歯科、地質学、海洋科学など、さまざまな分野での応用をもたらしています。ここで使用されているものには多くの基質とバイオフィルムを置き換えることができるからです。

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