バイオフィルムの細胞内および細胞外成分の同時定量(英語)

この手順の全体的な目標は、抗菌剤による処理後の 3 つの細胞内および細胞外バイオフィルム成分の同時 3 次元分布を定量化し、比較することです。これは、最初に樹脂複合試料を作製し、次に研磨することによって達成されます。第2ステップでは、目的のバイオフィルムを標本上に成長させ、抗菌剤で処理します。

次に、バイオフィルムを蛍光色素で染色して細胞外高分子物質、核酸、タンパク質に作製し、共焦点レーザー走査型顕微鏡でイメージングします。最終ステップでは、重ね合わせた蛍光色素の3次元画像を再構築して、バイオフィルム成分の同時可視化を容易にし、バイオフィルム画像から構造パラメータを計算します。最終的には、バイオボリュームや平均バイオフィルムの厚さなどのバイオフィルム構造パラメーターの統計分析を実行して、治療群と対照群の違いを比較できます。

この手順の主な利点は、既存の方法よりも、特定の条件下で成長したバイオフィルムの構造内の複数のコンポーネントの分布を特徴付けるために、異なるが相互接続された技術を使用することであり、手順が博士研究員のフェルナンド・フローレス博士と私の研究室の研究助手であるクリステン・スマート氏であることを示しています標本を作成するために、0.4またはTPHの3つの歯科用樹脂複合材料をカスタムに配置することから始まりますステンレス製の金型を作りました。次に、最初の増分をLED光硬化ユニットで40秒間重合します。2回目の増分で手順を繰り返した後、半自動グラインダーポリッシャーを使用して、硬化した試料を許容できる最終表面仕上げに研磨します。

最後に、標本を滅菌してバイオフィルムを成長させます。まず、Sミュータンスの単一コロニーを4ミリリットルの一晩培地に接種し、次いで37°Cで培養物を16〜18時間インキュベートして、少なくとも0.9の光学密度を達成する。次に、培養物を10ミリリットルのバイオフィルム成長液中で1対100の比率で希釈します。

培地は、滅菌樹脂複合試料を滅菌12ウェルプレートに無菌的に移し、次に希釈した培養物の2.5ミリリットルを各ウェルに加えます。うがい薬の治療および対照群では、無菌制御井戸に2.5ミリリットルの無菌未接種バイオフィルム成長剤を追加し、次いで100RPMのシェーカーでマイクロパラフィリック条件下で摂氏37度でバイオフィルムを成長させる。24時間後、すべての井戸から培地を無菌的に吸引し、各洗浄後に生理食塩水を吸引する2.5ミリリットルの滅菌PBSで各ウェルを2回洗浄し、次に各ウェルに2.5ミリリットルの新鮮なバイオフィルム成長培地を補充し、バイオフィルムの成長が完了してから48時間の持続時間の合計バイオフィルム成長について示したように、さらに24時間プレートをインキュベートします。 増殖培地を吸引し、2.5ミリリットルのうがい薬を各治療群の井戸に、2.5ミリリットルの滅菌超純水を対照群に分注します。

オービタルシェーカーでプレートを150RPMで攪拌し、60秒後に、うがい薬とウェルからの超純水の両方を吸引して、バイオフィルムのエキソ多糖成分を染色します。各バイオフィルムを50 μLのLORコンジュゲートと室温で30分間インキュベートします。次に、各洗浄後に吸引する2.5ミリリットルのTCバッファーで標本を2回洗浄し、光から保護された室温で50マイクロリットルのサイトナイン滴で各バイオフィルムの核酸を30分間染色します。

検体を2回洗浄した後、各バイオフィルムのタンパク質成分を50マイクロリットルのCipro redで室温で30分間染色し、光から保護します。検体を3回洗浄した後、ウェルごとに6ミリリットルの滅菌超純水を含む6ウェルプレートの個々のウェルに移し、共焦点顕微鏡による可視化を容易にし、処理群および対照群のバイオフィルム内の各成分染色の画像を取得します。Exorコンジュゲート染色によるエキソ多糖類の検出には、共焦点レーザー走査型顕微鏡のレーザーを以下の設定に設定し、633ナノメートルのレーザーと659〜749ナノメートルの発光バンドを使用して、Cyto nine染色による核酸の検出を行います。

488ナノメートルのレーザーと495〜500ナノメートルの発光バンドを使用し、シプロの赤色染色によるタンパク質の検出には、543ナノメートルのレーザーと615〜651ナノメートルの発光バンドを使用します。次に、開口数0.9、作動距離2.2mmの63倍ディッピングレンズを使用します。ビトウィーンスタックモードでのシーケンシャルスキャンを使用して、400ヘルツの共焦点レーザー走査型顕微鏡画像を収集し、同じバイオフィルム内の複数の染色の画像キャプチャを最適化します。

共焦点レーザー走査型顕微鏡画像を解析した後、速度画像解析ソフトウェアの3Dレンダラーメニューオプションを使用して、各バイオフィルム内の重ね合わせた成分染色の再構築された3D画像を作成します。次に、3D画像を回転させて、バイオフィルムの最適なビューを取得します。次に、バイオフィルム再構築のスナップショットをキャプチャし、スナップショットを適切な画像ファイル形式でエクスポートします。

最後に、バイオフィルム内のexo多糖類の核酸とタンパク質成分の同時分布の視覚的分析を行います。再構築された画像では、ISA 3Dソフトウェアを使用してバイオボリュームや平均バイオフィルム厚さなどのバイオフィルム構造パラメータを計算し、この表では、統計解析ソフトウェアを使用して計算されたバイオフィルム構造パラメータの平均値と標準偏差値が表示されます。マウスウォッシュで処理されたバイオフィルムの構造パラメータの平均値と標準偏差の値が、対照群のバイオフィルムの値と有意に異なっていた値は、赤い混合モデルで強調表示されています。

統計解析の結果、ビオテネPBFマウスウォッシュは、両レジンコンポジットの対照群と有意に異なるバイオフィルム構造を産生したのに対し、リステリントータルケアマウスウォッシュは、どちらのレジンコンポジットでも有意差を生じず、2回のマウスウォッシュ治療後に残った細胞内および細胞外のバイオフィルム成分の違いを明確に示しました。バイオフィルム内のエキソ多糖類、核酸、タンパク質の同時分布は、速度ソフトウェアを使用して生成された3D再構成によって視覚化できます。この図では、0.4上に成長した対照群バイオフィルムの代表的な再構成を、青色をエキソ多糖類に割り当てたことを示しています。

Sミュータンスバイオフィルム内では、緑色は核酸に、赤色はタンパク質に割り当てられました。介在する空間は、蛍光標識されていない水または他のバイオフィルム成分によって占められてもよい。この図では、TPH上に成長させた対照群バイオフィルムを、前の図と同じ成分を色で表した3つの樹脂複合材料で代表的に再構成したものです。

この手順は、医学、歯科、地質学、海洋科学など、さまざまな分野での応用をもたらしています。ここで使用されているものには多くの基質とバイオフィルムを置き換えることができるからです。