ハイスループットの使用インビトロマイクロ流体システム

この手順の全体的な目的は、組成的に代表的な多種の歯垢バイオフィルムを作成することです。分析と並行して、これは最初に代表的な培地と接種物を作成することによって達成されます。次に、接種物は一晩のインキュベーション後にマイクロ流体チップに導入され、マイクロチャネル内にバイオフィルムが形成されます。

最後に、バイオフィルムを洗浄して染色し、in situ 2共焦点レーザー走査型顕微鏡または落射蛍光顕微鏡法を行います。この手法がフローセルのような既存の方法と比較した場合の主な利点は、複数の実験を並行して行うことができるハイスループットシステムであり、使用する材料が少なく、人工的な実験用培地を必要としないことです。まず、5人以上のボランティアのコホートから、個々の50ミリリットルのプラスチックチューブに唾液サンプルを採取します。

唾液サンプルを氷の上に置かれた1つのプラスチックビーカーに引き込みます。唾液バイオポリマーはガラス表面に付着する傾向があるため、この設定ではガラスビーカーの使用を避けてください。次に、最終濃度が2.5ミリモルになるまで、サンプルにdithio3sホールを追加します。

混合物を氷の上で10分間攪拌します。すべての内容物をいくつかのプラスチックチューブに引っ張ります。摂氏4度の冷却遠心分離機で30分間の高速スピンダウンを行い、サンプルから微粒子を分離します。

唾液を新鮮な滅菌容器に移し、ペレット画分を廃棄して、サンプルからバクテリアフリーの増殖培地を調製します。まず、デイデブリフリーサンプルを3容量の脱イオン水で希釈します。次に、0.22 μ 低タンパク質結合メンブレンフィルターを使用します。

ポストろ過された画分を氷の上で冷やしたまま、唾液を滅菌します。滅菌した溶液を雄弁に扱い、必要になるまで摂氏マイナス80度で保管します。5人以上のボランティアのコホートから、滅菌された50ミリリットルのプラスチックチューブで唾液サンプルを収集します。

唾液サンプルを室温の滅菌済みプラスチックビーカー、または50ミリリットルのチューブに引き込みます。滅菌したグリセロールを25%グリセロールになるまで加えます。75%の唾液混合物に達します。

汚染物質をろ過ステップで除去した増殖培地プロトコルとは異なり、ここでは非経口特異的な細菌や真菌からの汚染を防ぐために滅菌技術が重要です。唾液グリセロール溶液を混合します。唾液グリセロール混合物をよく分注し、サンプルを開始する必要があるまで摂氏マイナス80度で保存します。

ここに示すようなマイクロ流路を備えたマイクロ流路チップを購入または製造してから、室温でベンチ上のバクテリア陰性増殖培地とバクテリア陽性接種物の両方のサンプルをマイクロチップに接種します。各チューブを5秒間渦巻いて混合し、メイン実験に進む前に、マイクロチップ出口リザーバーに100マイクロリットルの成長培地を追加することから始めます。コンピュータ制御ポンプを使用して、マイクロチャネルを2分間中程度に流し始めます。

室温で、各チャネルを目視検査して、適切な液体が充填されていることを確認します。マイクロチップを室温で20分間インキュベートします。これにより、マイクロチャネルの側壁がバイオポリマーの足場でコーティングされ、成長中にバイオフィルムが固定されます。

次に、出口リザーバーから手動で吸引または残りの媒体を吸引し、この画分を移送すると、流体力学的バランス負荷としてインレットリザーバーに作用します。バイオポリマー足場の堆積後、100マイクロリットルのバクテリア陽性接種物を出口リザーバーに加えます。マイクロチップを摂氏37度のホットプレートに置き、中せん断逆流を開始します。

出口から入口リザーバーまで正確に6秒間移動します。次に、ポンプをオフにし、チップを37°Cの静的条件下で40分間インキュベートして、マイクロチャネル側壁への細菌または真菌の付着を促進します。次に、出口リザーバーからすべての接種物をピペットで取り出して廃棄し、1ミリリットルのバクテリアフリー増殖培地を追加して同じリザーバーを補充します。

マイクロチップを摂氏37度で約20時間、低流量でインキュベートし、一晩の成長時にチャネル内バイオフィルムの成長を促進します。インレットリザーバーとアウトレットリザーバーの両方からすべての溶液をピペットで取り出します。インレットリザーバーに100マイクロリットルのPBSを塗布し、マイクロチャネルを20分間洗浄します。

入口から出口への低い前方の流れの下で、バイオフィルムは今や生きた死者染色の準備ができています。バイオフィルム染色の直前に、染色するすべてのチャネルについて、テキストプロトコルに記載されている生存率染色混合物を100マイクロリットル調製します。バイオフィルムを染色し、入口から残っているすべての液体を吸引し、同じリザーバーに100マイクロリットルの生存率染色混合物を補充する必要があるまで、この溶液を光曝露から保護します。

次に、染色液をマイクロチャネルに45分間押し込みます。室温でのシェアフローが低い場合は、チップを光にさらさないように保護してください。インレットリザーバーから残りのすべての液体を吸引し、100マイクロリットルのPBSを補充します。

室温で低シェアフロー下でマイクロチャネルを20分間洗浄し、余分な未結合の染料を除去します。染色されたバイオフィルムは、バイオフィルムの3次元構造を測定するための蛍光顕微鏡検査の準備が整いました。共焦点顕微鏡による水平スキャンを使用したデジタル再構成を使用して、任意の斜め角度からフィルム構造全体を表示することができます。

さらに、生死染色分析を同じデータデータセットに適用して、バイオフィルム内の細胞生存率の空間依存性をさまざまな化学処理の関数として研究することができます。バイオフィルムをイメージングすると、未染色のチャネルから細胞を抽出できます。高せん断流で作動する蒸留水を使用して、バイオフィルムフローラをゲノムDNAから4 5 4パイロシーケンシングによって同定できます。

この手順に従います。さまざまな条件下で複数種のバイオフィルムに何が起こるかなど、さまざまな質問に答えるために、異なる種や化合物を追加するなどの他の方法を実行できます。