ハイスループットの使用

この手順の全体的な目的は、組成的に代表的な多種細菌による歯科プラークバイオフィルムを作製することです。分析に向けた並行的な手法として、まず代表的な培地と接種源を作製することでこれを達成します。一晩の培養後、接種源をマイクロ流体チップに導入すると、マイクロチャネル内部にバイオフィルムが形成されます。

最後に、バイオフィルムを洗浄し、共焦点レーザー走査顕微鏡または落射蛍光顕微鏡によるin situ観察のために染色します。フローセルなどの既存の手法に対する本手法の主な利点は、より少ない材料で、かつ人工的なラボ培地を必要とせず、複数の実験を並行して実施できるハイスループットシステムである点です。まず、5名以上のボランティアから、個別の50 milliliterプラスチックチューブに唾液サンプルを採取します。

唾液サンプルを氷上に置いた1つのプラスチック製ビーカーに回収します。この手順でガラス製ビーカーを使用すると、唾液中のバイオポリマーがガラス表面に付着しやすいため避けてください。次に、最終濃度が 2.5 millimolar になるまでジチオスレイトールをサンプルに加えます。

混合物を氷上で10分間撹拌します。内容物をすべて数本のプラスチックチューブに移します。4 °Cに冷却した遠心分離機で30分間高速スピンダウンを行い、サンプルから粒子を分離させます。

唾液上清を新しい滅菌コンテナに移し、サンプルから細菌不含の培地を調製するため、ペレット画分を廃棄します。まず、デブリ除去済みのサンプルを3倍量の脱イオン水で希釈します。次に、0.22 µmの低タンパク結合膜フィルターを用いてろ過します。

ろ過後の分画を氷上で冷却したまま、唾液を滅菌します。滅菌した溶液を分注し、必要になるまで-80°Cで保存します。5名以上のボランティアコホートから、滅菌済みの50mLプラスチックチューブに唾液サンプルを採取します。

唾液検体を室温で事前滅菌したプラスチックビーカーまたは50 milliliterチューブに移します。滅菌済みグリセロールを加え、グリセロール25%、唾液75%の混合液にします。

ろ過工程によって汚染物質を除去した培地調製プロトコルとは異なり、ここでは口腔特異的ではない細菌や真菌による汚染を防ぐため、無菌操作が重要となります。唾液グリセロール溶液を混合します。唾液グリセロール混合液を適切に分注し、使用開始時までサンプルを-80 °Cで保存します。

細菌不含増殖培地および細菌含接種液の双方を室温のベンチ上でマイクロチップに接種する前に、本資料に示したものと同様のマイクロチャネルを持つマイクロ流体チップを購入または作製します。本実験に進む前に、各チューブを5秒間ボルテックスして混合します。まず、マイクロチップの出口リザーバーに100 µLの増殖培地を加えます。コンピュータ制御ポンプを用いて、マイクロチャネル内に培地のせん断流を2分間発生させます。

室温で、各チャネルを視覚的に確認し、液体が適切に充填されているかを確認します。その後、マイクロチップを室温で20分間インキュベートします。これにより、マイクロチャネルの側壁にバイオポリマー足場がコーティングされ、バイオフィルムの成長時にそこに固定されるようになります。

次に、アウトレットリザーバーから残りの培地を手動で吸引し、この分画をインレットリザーバーに回収します。これにより、この分画が流体力学的なバランシングロードとして機能します。バイオポリマー・スキャフォールドの堆積後、細菌陽性接種液 100 µL をアウトレットリザーバーに加えます。マイクロチップを 37 °C のホットプレートに載せ、培地のせん断逆流を開始させます。

流出側から流入側のリザーバーまで正確に6秒間流します。その後、ポンプを停止し、細菌または真菌がマイクロチャネルの側壁に付着しやすくするため、チップを37 °Cの静止条件下で40分間インキュベートします。次に、ピペットを用いて流出側リザーバーからすべての接種液を除去して廃棄し、同じリザーバーに細菌を含まない増殖培地を1 mL加えて満たします。

マイクロチップを37°Cで約20時間、低剪断流下でインキュベートし、一晩の培養によってチャネル内でのバイオフィルム形成を促進させます。入口および出口の両リザーバーからすべての溶液をピペットで吸い出します。入口リザーバーに100 µLのPBSを加え、マイクロチャネルを20分間洗浄します。

入口から出口への低剪断前方流の下で、バイオフィルムは生死染色が可能な状態になります。バイオフィルムの染色の直前に、染色するチャンネルごとに、テキストプロトコルにある生細胞染色ミックスを100 µL準備します。この溶液は、バイオフィルムの染色に使用するまで遮光して保存してください。入口から残っている液体をすべて吸引し、同じリザーバーに生細胞染色ミックスを100 µL補充します。

次に、染色液をマイクロチャネル内に45分間流します。室温で低せん断流の状態にし、チップを遮光して保護してください。インレットリザーバー内の残液をすべて吸引し、100 µLのPBSで満たします。

室温で低せん断流を用いてマイクロチャネルを20分間洗浄し、結合しなかった過剰な染料を除去します。これで、染色されたバイオフィルムを用いた蛍光顕微鏡観察によるバイオフィルムの三次元構造の解析が可能になります。共焦点顕微鏡を用いた水平スキャンによるデジタル再構成を行うことで、任意の斜め方向からフィルム全体の構造を観察できます。

さらに、同一のデータセットに生死染色解析を適用することで、異なる化学的処理によるバイオフィルム内部の細胞生存率の空間的依存性を検討することが可能です。バイオフィルムのイメージング後、未染色のチャネルから細胞を抽出できます。高剪断流条件下で蒸留水を用いることで、その後、4 5 4パイロシーケンシングによるゲノムDNAからバイオフィルムのフローラを特定できます。

本手順に従ってください。異なる種や化合物を添加するなど、別の方法を用いることで、多様な条件下で多種バイオフィルムにどのような変化が生じるかといった、異なる疑問に対する検証を行うことが可能です。