前立腺癌におけるバイオマーカーの発見への応用：個々のHERV座発現のマイクロアレイベースの識別

このヒト前立腺がん組織のトランスクリプトーム解析では、個々のヒト内因性レトロウイルス発現遺伝子座を同定し、バイオマーカー発見のためのスクリーニングツールとしてカスタム高密度マイクロアレイを評価します。外科医が患者から前立腺臓器を切除した後、病理医は腫瘍組織と隣接する正常組織をラボ抽出物で別々に調製し、MRを精製して適格化します。正常組織および腫瘍組織由来のNAは、全トランスクリプトームオベーションキットを使用してmRNAを増幅し、得られた増幅産物を切断して標識します。次に、H-E-R-V-V 2つのマイクロアレイを充填、ハイブリダイジング、洗浄、スキャンして順次処理します。

最終的には、バイオコンピューティング法のプローブセットを使用して、有意なシグナルを示し、発現差を追跡できるため、転写活性のある個々の遺伝子座の同定につながります。何年も前に、多発性硬化症のサンプルを含むさまざまな状況でのIRV Wファミリーの行動を調査しました。胎盤精巣。

私が最初にその方法のアイデアを得たのは、ファミリー内のIRV要素の重複するまたは重複しないサブグループが表現されることを理解し始めたときです。文脈によります。船舶技術を使用することで、複数の家族を協調的に探索し、各軌跡の異なる領域を同時に分析することができます。

例えば、LTRのUS 3およびUFドメインは、病理学における直接的な役割をサポートする可能性があります。この方法は、PSAのような既存のタンパク質バイオマーカーが特異性と感度を欠いている前立腺がんの診断など、がん分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。一方、PCA 3のようなノンコーディングRNAはより有望に見えます、前立腺の取り扱い手順を実証することは、病理学部の技術者をミシェルに売り込むことになります。

Philippe perがRNA抽出ターゲットの準備と分析を実演し、John Unit研究室の技術者が船の手順を実演します。凍結ティッシュコースをクライオスタットの小さなOCTの山に垂直に取り付けます。5ミクロンの切片を1つ取り、Blu udineで染色し、その後、腫瘍組織の組織の性質を調べるために迅速な組織学的検査を行います。

腫瘍細胞の量を推定し、腫瘍細胞が80%を超えるコアのみを選択します。さらに5ミクロン切片をカットし、ヘマチン、エオイン、サフランで染色します。次に、厚さ30ミクロンの切片を15個切断し、RNAフリーのeend orphチューブに移します。

次に、ヘマチン、エオイン、サフランで染色するための最後の5ミクロン切片を取り、腫瘍細胞の量を制御します。手順の最後に、ドライアイス上のサンプルをトランストランスで分子生物学研究室に移します。組織が完全に溶解するまで、ハンドヘルドグラインダーを使用して、氷上のトリオール溶液で組織を均質化します。

サンプルを室温で5分間インキュベートします。次に、300マイクロリットルのクロロホルムとボルテックスを15秒間加えます。室温で2分後、摂氏2〜8度で15分間、12、000 Gで遠心分離

RNAについては、上部の水相を新しいチューブに慎重に移します。750マイクロリットルのイソプロパノールを加え、反転して混合し、室温で10分間インキュベートします。サンプルを遠心分離して沈殿したRNAをペレット化し、RNAペレットを1ミリリットルの80%エタノールで洗浄します。

次に、サンプルを7, 500Gで摂氏4度で10分間遠心分離します。P 1000 と P 10 の先端を使用して上清を取り除きます。残りのエタノールを風乾させます。

次に、100マイクロリットルのRNAフリーウォーターを追加します。サンプルを摂氏70度のヒートブロックに移します。ペレットを溶解するには、製造元の指示に従って、バイオアナライザーとNanoDropを使用してRNAの品質とRNAの完全性を確認します。

理想的なRNA抽出では、RNAの完全性数は通常7以上です。サプライヤーの指示に従って、トランスクリプトームオベーション、RNA増幅キット全体を続行します。次に、得られた一本鎖CDNA製品を精製します。

製造元の指示に従って、バイオアナライザーとNanoDropを使用して、一本鎖CDNAの収量とサイズ分布を確認します。増幅されたCD NAのサイズ分布は、通常、101、500塩基の長さで、ピークは約600塩基で、全体的にベル型の分布を持つ必要があります。次に、CDNAをフラグメント化するために、30マイクロリットルのCD NAの2マイクログラムに6.6マイクロリットルのフラグメンテーションミックスを加え、37°Cで10分間回転し、インキュベートします。

次に、DNAのものを摂氏95度で10分間不活性化し、氷上に保ちます。断片化されたCDNAの1マイクロリットルをAgilentベースのサイズ分布検証のために分注します。DNAの1つの処理では、ハイブリダイゼーションの前にCD NAサイズ分布を約100ヌクレオチドに均質化します。

バイオアナライザーPfizerのプレウェットを使用して、一本鎖CDNAのサイズ分布を確認します。200マイクロリットルのプレハイブリダイゼーションを備えたHERV遺伝子チップ。混合し、摂氏50度、60RPMで10分間インキュベー

131マイクロリットルのハイブリダイゼーションミックスを、室温ミックスで、そして95°Cで2分間自然界で断片化して標識したCD NAの69マイクロリットルに加える。その後、摂氏50度で5分間インキュベートし、最高速度で5分間遠心分離します。次に、事前に濡らしたHERV遺伝子チップを空にし、200マイクロリットルのターゲット調製物をロードします。

2つのSEPTAハイブリダイズにタフスポットを適用し、摂氏50度、60RPMで18時間ハイブリダイズします。HERV遺伝子チップを空にし、プローブを満たします。250マイクロリットルの洗浄バッファー、600マイクロリットルのSAPE溶液混合物、および600マイクロリットルの抗体溶液混合物を位置1と2の位置に配置し、800マイクロリットルのアレイ保持バッファーを位置に配置します。

その3、針を押し下げる。各モジュールに適切なチップを割り当てます。FS 4 5 0 0 0 4プロトコルを選択し、ソフトウェアの指示に従って各モジュールを実行します。

SEPTAにタフなスポットを当てて、漏れを防ぎます。次に、チップをオートローダーにロードするか、スキャナーに直接ロードします。スキャンを開始します。

スキャン後、チップドットCELファイルが生成され、画像を確認し、グリッドをスポットに合わせ、プローブセルを特定します。また、チップをいくつかの品質管理測定にかけます。次に、チップを正規化し、階層的クラスタリングアプローチを適用してデータセットを探索します 正規化後、マイクロアレイ手順から差次的に発現する遺伝子を検索するために重要な分析が実行され、その後、5つのマッチペアの腫瘍と正常な前立腺RNAサンプルで誤った発見率の修正が行われました。

これにより、発現差値を持つ207のHERVプローブセットが同定されました。さらに、他のがん組織から採取した35のマッチペアサンプルを解析した結果、44の前立腺特異的HERVプローブセットが同定されました。これらは、最も関連性の高い10のHERV構造です。

最後に、機能解析は、H-E-R-V-V twoアレイ上に存在し、機能レトロウイルス領域LTR gag POLE Nで標識された上位10の同定されたプロウイルス構造で選択された1つのH-E-R-V-Wエレメントによって示される関心のあるアノテーション付き配列からなる専用のインターフェースで実施することができ、5つの主要なLTRU 3およびU 5つのサブドメインに焦点を当てて、 その後のRT PCRバリデーション用のPCRプライマーの設計。このビデオを見れば、マイクロレイを地球に使用するための品質上の前提条件であるサンプルとターゲットの調製に関連する重要なステップを習得する方法や、従来のバイオマーカーの発見を十分に理解できるはずです。私たちは、乾燥した非コン領域のNA転写またはコード遺伝子発現の調節が遺伝子発現を調節する場合に遺伝子座が活性を持つかどうかをよりよく理解するために、遺伝子座発現の個々の最適特性を明らかにすることを目的として、アメトリ形式で高密度マイクロアレイを設計しました。

この技術は、活性vociの体系的な同定により、さまざまな病状の引き金となる要因として遺伝的、ウイルス的、および環境的仮説を統一する可能性があるため、慢性および感染症の分野の研究者に道を開きます。技術的な概念実証実験で限られた数のサンプルを扱うことは、バイオマーカーの発見を成功させるのは難しい場合があります。これには、メソッドの堅牢性や、対象となる患者集団の代表的なサンプリングなど、統計的に検証されたワークフローを尊重するなどの予防策が必要です。