哺乳動物細胞に関連して細菌の生存を決定するための蛍光顕微鏡法
September 5th, 2013
微生物は、真核細胞への曝露後に存続した場合、どのように細菌の病原性の分野の中心となるのは、定義する機能です。この記事では、内部および宿主細胞に関連する個々の細菌の生存を明らかに蛍光色素を使用するためのプロトコルの概要を説明します。
この蛍光顕微鏡実験では、宿主細胞に関連する個々の細菌の生存率を評価し、さまざまな細胞内位置での細菌の生存率を決定します。まず、外部細菌を同定するために、感染した細胞を、細菌膜の完全性に基づいて生存可能な細菌と生存不可能な細菌を区別する蛍光色素の存在下で、感染した宿主である細菌パーミアーゼに特異的な蛍光試薬に曝露します。次に、宿主細胞内のどこに細菌が見つかっているかを示すために、感染した細胞を目的のマーカーに蛍光結合した抗体でインキュベー
トします。得られた免疫蛍光画像により、宿主細胞の内部および外部の生存可能な細菌の割合、および生存可能な細胞内細菌と生存不可能な細胞内細菌の細胞内局在を決定できます。コロニーカウントアッセイ、ゲンタマイシン保護アッセイ、電子顕微鏡法とは異なり、この方法では個々の細菌の生存率を直接評価することができます。また、異なる細胞内コンパートメントの細菌の生存率に違いがあるかどうかも明らかにすることができます。
この手順を実証するのは、私の研究室の大学院生であるブリタニー・ジョンソンであり、アトリーは24の円形ガラスカバースリップで細胞を培養し、ウェルプレートは目的の細菌を追加し、所望の時間インキュベートします。感染した細胞を一度やさしくすすいでください。次に、Alexa Fluor 6 4 7共役抗体、または外部細菌を検出するための細菌特異的レクチンを添加し、室温で暗所で10分間インキュベートします。
2回のすすぎ後、培地を吸引し、サイトナインとヨウ素プロピジウムを含む0.5ミリリットルの生死染色液を加えます。暗所で室温で15分間細胞をインキュベートし、モップ塩化マグネシウムで2回すすぎます。カバースリップを下向きにしてスライドガラスに反転させます。
透明なマニキュアでシールします。蛍光顕微鏡とテキストプロトコルに詳述されているフィルターセットを使用して30分以内に画像を取得し、細菌を標識します。DPI1ミリリットルあたり10マイクログラムをmors定義培地に添加し、暗所で室温で20分間インキュベー
トします。次に、接着細胞にDPI標識細菌を感染させます。細胞をアルデヒドや有機溶媒で固定しないでください。細胞を一度すすぎます。
次に、Alexa Fluor 6 4, 7共役抗体またはレクチンを添加し、暗所で室温で10分間インキュベートします。モップバッファーで2回すすぎた後、目的の細胞内マーカーに対するAlexa Fluor 5 5、5結合抗体を添加し、20分間インキュベートします 2回後、モップバッファーを含むRINは、モップ塩化マグネシウムで細胞を1回洗浄します。次に、培地を吸引し、0.4マイクロモルのcyt greenを室温で暗所で5分間インキュベートし、細胞をmops、塩化マグネシウムで2回リンします。
その後、細胞を洗浄します。もう一度、塩化マグネシウムをモップで5分間入れます。カバースリップを下向きにしてスライドガラスに逆さまにし、透明なマニキュアで密封し、蛍光顕微鏡で30分以内にスライドの画像を取得します。
この実験では、ヒトの好中球を淋病に感染させました。Alexa Fluor 6 4 7結合大豆レクチンは、細胞外淋病を検出します。その後、緑色の蛍光生存率が低下し、赤色の蛍光ヨウ化プロピジウムをサポニンの存在下で添加し、サポニンの存在下でコレステロールを隔離して宿主細胞の原形質膜に優先的に浸透させますが、感染した細胞の淋病膜には浸透しません。真核生物の細胞核は、サイトナインとヨウ化プロピジウムの両方で染色されます。
これらの淋病に感染した好中球の画像は、生存率色素、cyt、talk、screen、およびdpiを使用して生成されました。ヨウ化プロピジウム色素は、蛍光顕微鏡の赤色チャネルと紫外チャネルの両方で蛍光を発するため、使用されませんでした。すべての淋病はdpiで染色されますが、膜が損なわれた細菌のみがオックスグリーンで染色されます。
生存不能な細胞内細菌は、細菌を囲むCD63の染色輪を有する。このリングは、一次顆粒がこのファゴソームで濃縮されていることを示しています。生存可能な細胞内細菌は、CD 63の染色を欠いており、一次顆粒がそのファゴソームに濃縮されていないことを示しています。撮影。
まとめると、データは、淋病の生存率と一次顆粒陰性ファゴソームの居住者との間に相関関係があることを示しています。このビデオを見れば、宿主細胞内の細菌の生存率を評価する方法について十分に理解できるはずです。さらに、宿主細胞の異なるコンパートメントに局在する細菌の生存率を、これらの細胞内コンパートメントに対する抗体を用いて判断することができます。
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概要
この記事では、蛍光顕微鏡を使用して宿主細胞に関連する個々の細菌の生存能力を評価するためのプロトコルを概説します。詳細に説明されている方法により、様々な細胞内部位置での細菌の生存能力の決定が可能になります。
主要な研究構成要素
科学分野
- 細菌の病原性
- 蛍光顕微鏡
- 細胞間相互作用
背景
- 宿主細胞内での細菌の生存を理解することは、感染症の研究に不可欠です。
- 蛍光染料は、生存可能および非生存可能な細菌を区別できます。
- 従来の方法では、個々の細菌の生存能力を直接評価できない可能性があります。
- この研究は、宿主細胞内の細菌の挙動をより深く理解することを目的としています。
研究の目的
- 宿主細胞内の細菌の生存能力を評価する方法を開発すること。
- 生存可能および非生存可能な細菌の局在化を探索すること。
- 既存の生存能力評価方法のより正確な代替手段を提供すること。
使用した方法
- 細菌の透過酵素に特異的な蛍光試薬を感染細胞に露出させること。
- 生存可能および非生存可能な細菌を区別するために蛍光染料を使用すること。
- 細菌の位置を特定するために蛍光標識抗体でインキュベーションすること。
- 免疫蛍光画像を分析して細菌の生存能力を判断すること。
主要な結果
- この方法により、個々の細菌の生存能力を直接評価できます。
- 結果は細胞内局在に基づく生存能力の違いを示しています。
- 免疫蛍光イメージングにより、細菌の明確な可視化が可能になります。
- このアプローチは、細菌の生存能力を評価する上で従来の方法を上回ります。
結論
- 開発された方法は、宿主細胞内の細菌の生存能力を研究するのに効果的です。
- 蛍光顕微鏡は、細菌の病原性に関する重要な洞察を明らかにできます。
- この研究は、微生物の生存戦略の理解を深めます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Direct quantification of individual bacterial viability within mammalian cells addresses a critical gap in infectious disease research and host-pathogen interaction studies. This fluorescence microscopy workflow enables precise mapping of viable versus non-viable bacteria at the subcellular level, supporting mechanistic de-risking and target validation in early discovery. The approach enhances predictive confidence for translational research and informs risk-adjusted portfolio decisions in anti-infective R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of bacterial survival mechanisms within host cell compartments.
- Supports functional validation of host-pathogen interaction targets.
- Facilitates mechanistic de-risking by distinguishing viable from non-viable intracellular bacteria.
- Improves predictive confidence for prioritizing anti-infective targets.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, quantitative imaging assays for downstream screening workflows.
- Standardizes viability assessment at the single-bacterium level for reproducibility.
- Enables robust comparison of compound effects on bacterial viability in host contexts.
- Supports scalable adaptation to diverse bacterial and host cell models.
Translational & Preclinical Research
- Aligns viability readouts with disease-relevant host-pathogen systems.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation of anti-infective strategies.
- Enables risk-adjusted advancement based on subcellular localization and survival data.
- Supports translational biomarker development for infection outcomes.
Pipeline & Workflow Integration
This fluorescence microscopy method integrates into the discovery-to-preclinical continuum for infectious disease programs, bridging early mechanistic studies and translational validation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on bacterial survival and host defense mechanisms.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible viability outputs for compound evaluation.
- Analytics: Provides high-content imaging data for statistical comparison of experimental conditions.
- Translational Research: Connects in vitro findings to disease-relevant cellular models.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform adaptable to multiple bacterial species and host cell types.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in host-pathogen studies.
- Operational Value: Standardizes viability assessment and enhances reproducibility across experiments.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and optimizes resource allocation in anti-infective portfolios.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets and candidate interventions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence microscopy and quantitative image analysis.
- Needs access to advanced imaging instrumentation and validated fluorescent reagents.
- Demands cross-team standardization of staining protocols and imaging parameters.
- Adaptable to various bacterial and mammalian cell models with protocol optimization.
- Dependent on careful timing and handling to preserve viability readouts.
