Name: 哺乳動物細胞に関連して細菌の生存を決定するための蛍光顕微鏡法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-05T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: 学ぶ蛍光顕微鏡法で哺乳動物細胞に関連する細菌の生存を評価する方法です。蛍光色素を用いて細菌膜の透過性に基づき生存細菌と死滅細菌を区別し、宿主細胞内の細菌の局在と生存率を可視化します。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

私たちは、原稿の重要な読書のためにアシャスミルノフとローラGonyarに感謝します。この作品は、NIH T32 AI007046によって部分的にサポートされていましたAKCMBJへの助成金NIHのR00 TW008042とR01 AI097312によってサポートされていました。

1。ヨウ化プロピジウムとSYTO9と細菌の生存率を評価する<ol><li>目的の細菌で24ウェルプレートに直径12mmの円形のカバーガラスに付着している細胞に感染する。アルデヒドまたは有機溶媒を用いて細胞を固定しないでください。 </li><li>一旦穏やかで細胞をすすぎ、0.1M 3 - （N-モルホリノ）、1mMのMgCl 2（MOPS /のMgCl 2）を含有するプロパンスルホン酸（MOPS）、pH7.2で、。 </li><li>外部の細菌を検出するために、MOPS /のMgCl 2に、関心対象の細菌種に特異的に結合するアレクサフルーア647結合抗体またはレクチンを用いて室温で暗所で10分間、細胞をインキュベートする。 </li></ol> NOTE：行動、関心のあるレクチンまたは抗体に関係なく生存率（ 図1）の全ての細菌に特異的に結合することを示すために、宿主細胞の非存在下で、生および死細菌を制御する。 <ol start="4"><li> MOPS / MgCl 2を用いて細胞を2回すすいでください。 </li><li>吸引物M細胞からEDIAと0.5ミリリットル生/死染色溶液を加える。生/死染色溶液は、MOPS / 塩化マグネシウムが5μmのSYTO9、30μMのヨウ化プロピジウム、0.1％サポニン（最終濃度）である。 </li><li>暗所で室温で15分間、細胞をインキュベートする。 </li><li> MOPS / 塩化マグネシウム中で細胞を2回すすいでください。 </li><li>反転したカバーは、スライドガラス上に裏向きと明確なマニキュアで密封する。封入剤は使用しないでください。 </li><li>緑、赤、遠赤の画像取得と互換性のフィルターセットで蛍光顕微鏡を用いて、30分以内に画像を取得する。 </li></ol>注：従来の蛍光顕微鏡法および共焦点レーザー走査顕微鏡法の両方を使用することができる。 30分後、蛍光色素は、細菌から漏れ始めておらず、取得したデータはもはや正確である。この記事に示されている画像は、のOpenLABソフトウェアを使用して、浜松オルカ-ERデジタルカメラニコンエクリプスE800直立蛍光顕微鏡で得た。 650 nmおよび663の発光フィルター - - アレクサフルーア647の蛍光は、590の励起波長を有するフィルターを用いて検出した735 nmであり、偽色の青である。 580と600nmの発光フィルター - - 660 nmのヨウ化プロピジウムの蛍光を、540の励起波長を有するフィルターを用いて検出した。 495 nmおよび515の発光フィルター - - 555 nmのSYTO9からの蛍光は、465の励起波長を有するフィルターを用いて検出した。 <ol start="10"><li>このプロトコルは、外部生育不能細菌が赤+青表示され、内部の生育不能細菌は、外部生菌が緑+青表示され、内部の生菌のみを緑色にのみ赤く表示された画像になります。目で、外部の生育不能生育不能内部、実行可能な外部、および内部生存している細菌の数を数える。 </li><li>外部の細菌の総数（外部によって生菌数で割ることによって、外部生菌の割合を計算する実行可能なプラスnonviでき）。内部の細菌の総数（実行可能なプラス生育不能）（ 図4）により、内部生菌数を割ることによって、内部生菌の割合を計算します。 </li><li>このプロトコルで実行するには、2つの本質的なコントロールがあります。まず、すべての生育不能細菌はヨウ化陽性であり、すべての生菌がSYTO9陽性であることを検証します。 （任意の宿主細胞の非存在下）の細菌の中間対数文化が&gt; 95％のSYTO9陽性である必要があります。 N.の中間対数培養物は、 図2にも示されている淋菌 （ミリリットル当たりの単位を形成する10 8コロニーでの）生/死染色溶液と共にインキュベートした。第二に、ヨウ化プロピジウムとSYTO9両方が透過処理、感染した宿主細胞に入ることができることを検証します。 <ol><li>死んだ細菌の集団を生成するために、1.5mlマイクロ遠心チューブ内のユニットを形成し、2×10 8個の細菌コロニーを採取し、70％のイソプロパノールを添加し、10分間放置。マイクロフュージA中の細菌をペレットND残留イソプロパノールを除去するためにPBSで2回細菌を洗い流す。 1.7 - その後、プロトコルは1.5ステップに従ってください。ガラススライドに細菌懸濁液の5μLを加え、カバーガラスでオーバーレイ。プロトコルステップ1.9のように、画像サンプル。これらの条件下では、人口の100％がヨウ化陽性（ 図2）である必要があります。いくつかの細菌種では、ヨウ化プロピジウムは完全SYTO9染色を圧倒できず、生育不能細菌は黄色やオレンジ色表示されることがあります。 </li><li>好中球のような食細胞の場合は、イソプロパノール-死菌に細胞を公開し、細胞内細菌の100％がヨウ化陽性（ 図3）であることを確認してください。死菌を内在化しないことができる非食細胞のためには、アジ化ナトリウム又は生/死染色溶液を添加する前に、他の細胞浸透性抗菌剤を用いて感染細胞を治療するのに十分であり得る。 </li></ol></li></ol> 2。 SYTOXグリーと評価する細菌生存率NおよびDAPI <ol><li>ラベル暗所で室温で20分間、モースの限定培地25中10μg/ mlのDAPIで目的の細菌。 </li><li> DAPIで標識した細菌と24ウェルプレートに直径12mmの円形のカバーガラスに付着している細胞に感染する。アルデヒドまたは有機溶媒を用いて細胞を固定しないでください。 </li><li> MOPS / MgCl 2をで細胞を1回すすいでください。 </li><li>外部の細菌を検出するために、MOPS /のMgCl 2に、関心対象の細菌種に特異的に結合するアレクサフルーア647結合抗体またはレクチンで暗所で室温で10分間、細胞をインキュベートする。提案しコントロールするためのプロトコルのステップ1.3の注を参照してください。 </li><li>細胞から培地を吸引し、MOPS / 塩化マグネシウムで0.5ミリリットル0.4μMSYTOXグリーンを追加します。 </li><li>暗所で室温で5分間、細胞をインキュベートする。 </li><li> MOPS / 塩化マグネシウム中で細胞を2回すすいでください。 </li><li> 5分間のMOPS / 塩化マグネシウム中で細胞を1回洗浄します。 </li><li&gt;蛍光顕微鏡で30分以内に画像を取得します。顕微鏡、デジタルカメラ、および取得ソフトウェアの説明については、プロトコルのステップ1.9を参照してください。 </li></ol>注：アレクサフルーア647からの蛍光は590の励起波長のフィルターを用いて検出した - 650 nmおよび663の発光フィルター - 735 nmであり、偽色の赤です。 495 nmおよび515の発光フィルター - - 555nmのSYTOXグリーンからの蛍光は、465の励起波長を有するフィルターを用いて検出した。 375と400nmのバリアフィルター - DAPIからの蛍光は、355の励起波長を有するフィルターを用いて検出した。 <ol start="10"><li>このプロトコルは、外部生育不能細菌が緑+赤表示され、内部の生育不能細菌は青+緑に表示され、外部の生菌は青+赤で表示され、内部の生菌のみ（ 図4）青く見える画像になります。プロトコルセントで説明したように外部と内部の細菌の割合を定量化P 1.11。 </li><li>プロトコールステップ1.12に記載されたコントロールは、DAPI / SYTOX Green色素の組み合わせ（ 図2および図3）を用いて実施されるべきである。 </li></ol> 3。細胞内局在と並んで細菌の生存率を評価する<ol><li>ラベル暗所で室温で20分間、モースの定義された培地中で10μg/ mlのDAPIで目的の細菌。 </li><li> DAPIで標識した細菌と24ウェルプレートに直径12mmの円形のカバーガラスに付着している細胞に感染する。アルデヒドまたは有機溶媒を用いて細胞を固定しないでください。 </li><li> MOPS / MgCl 2をで細胞を1回すすいでください。 </li><li>外部の細菌を検出するために、MOPS /のMgCl 2に、関心対象の細菌種に特異的に結合するアレクサフルーア647結合抗体またはレクチンで暗所で室温で10分間インキュベートする。提案しコントロールするためのプロトコルのステップ1.3の注を参照してください。 </li><li>細胞から培地を吸引し、細胞を2 TIをすすぐMOPS / 塩化マグネシウム中でMES。 </li><li> MOPS / MgCl 2を0.2％サポニンを含有する、20分間の関心の細胞内マーカーに対するアレクサフルーア555結合抗体で細胞を培養する。 </li><li> MOPS / 塩化マグネシウム中で細胞を2回すすいでください。 </li><li> 5分間のMOPS / 塩化マグネシウム中で細胞を1回洗浄します。 </li><li>細胞から培地を吸引し、MOPS / 塩化マグネシウムで0.4μMSYTOXグリーンを追加します。 </li><li>暗所で室温で細胞を5分間インキュベート。 </li><li> MOPS / 塩化マグネシウム中で細胞を2回すすいでください。 </li><li> 5分間のMOPS / 塩化マグネシウム中で細胞を1回洗浄します。 </li><li>蛍光顕微鏡での30分以内に、スライドの画像を取得する。顕微鏡、デジタルカメラ、および取得ソフトウェアの説明については、プロトコルのステップ1.9を参照してください。 </li></ol>注：アレクサフルーア647からの蛍光は590の励起波長のフィルターを用いて検出した - 650 nmおよび663の発光フィルター - 735 nmであり、偽色の紫色である。蛍光fは580と600nmの発光フィルター - - 660 nmのロムアレクサフルーア555が540の励起波長を有するフィルターを用いて検出した。 495 nmおよび515の発光フィルター - - 555nmのSYTOXグリーンからの蛍光は、465の励起波長を有するフィルターを用いて検出した。 375と400nmのバリアフィルター - DAPIからの蛍光は、355の励起波長を有するフィルターを用いて検出した。 <ol start="14"><li>このプロトコルは、外部生育不能細菌が緑+紫に見える画像になり、内部の生育不能細菌は青+緑に表示され、外部の生菌は青+紫に見える、内部生菌は青表示され、細胞内のタンパク質（ 図4）、赤が表示されます。プロトコールに記載されているように外部と内部の生菌perecentを定量化することは1.11を繰り返します。 </li><li>プロトコールステップ1.12に記載されたコントロールは、DAPI / SYTOX Green色素の組み合わせ（ 図2および図3）を用いて実施されるべきである。 </li><li>で生存可能で、生育不能細菌をカウントすることに加え、目的の細胞内マーカーと共局在するため、正または負のいずれかとし、各細菌を分類する。 </li><li>生菌数の合計で共局在生菌数で割ることによって細胞内のマーカーと共局在生菌の割合を計算する。生育不能細菌の総数で生育不能共局在した細菌の数を割ることによって細胞内のマーカーと共局在生育不能細菌の割合を計算します。 </li></ol>

<ol><li>Woolard, M. D., Frelinger, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outsmarting+the+host%3A+bacteria+modulating+the+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Res%22%5BJournal%5D)">Outsmarting the host: bacteria modulating the immune response.</a> Immunol. Res. 41, 188-202 (2008).</li>
<li>Johnson, M. B., Criss, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resistance+of+Neisseria+gonorrhoeae+to+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Resistance of Neisseria gonorrhoeae to neutrophils.</a> Front Microbiol. 2, 77(2011).</li>
<li>Simons, M. P., Nauseef, W. M., Apicella, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+of+Neisseria+gonorrhoeae+with+adherent+polymorphonuclear+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Interactions of Neisseria gonorrhoeae with adherent polymorphonuclear leukocytes.</a> Infect. Immun. 73, 1971-1977 (2005).</li>
<li>Seib, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+oxidative+stress+defenses+of+Neisseria+gonorrhoeae+by+using+a+human+polymorphonuclear+leukocyte+survival+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Investigation of oxidative stress defenses of Neisseria gonorrhoeae by using a human polymorphonuclear leukocyte survival assay.</a> Infect. Immun. 73, 5269-5272 (2005).</li>
<li>Criss, A. K., Katz, B. Z., Seifert, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resistance+of+Neisseria+gonorrhoeae+to+non-oxidative+killing+by+adherent+human+polymorphonuclear+leucocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Resistance of Neisseria gonorrhoeae to non-oxidative killing by adherent human polymorphonuclear leucocytes.</a> Cell Microbiol. 11, 1074-1087 (2009).</li>
<li>Edwards, A. M., Massey, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invasion+of+human+cells+by+a+bacterial+pathogen%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Invasion of human cells by a bacterial pathogen.</a> J. Vis. Exp. (49), e2693(2011).</li>
<li>Bozzola, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conventional+specimen+preparation+techniques+for+transmission+electron+microscopy+of+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Conventional specimen preparation techniques for transmission electron microscopy of cultured cells.</a> Methods Mol. Biol. 369, 1-18 (2007).</li>
<li>Dorward, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+analysis+of+bacteria-host+cell+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural analysis of bacteria-host cell interactions.</a> Methods Mol. Biol. 431, 173-187 (2008).</li>
<li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid%2C+absolute%2C+and+simultaneous+quantification+of+specific+pathogenic+strain+and+total+bacterial+cells+using+an+ultrasensitive+dual-color+flow+cytometer%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Rapid, absolute, and simultaneous quantification of specific pathogenic strain and total bacterial cells using an ultrasensitive dual-color flow cytometer.</a> Anal. Chem. 82, 1109-1116 (2010).</li>
<li>Mueller, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vibrio+cholerae+strains+possess+multiple+strategies+for+abiotic+and+biotic+surface+colonization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Vibrio cholerae strains possess multiple strategies for abiotic and biotic surface colonization.</a> J. Bacteriol. 189, 5348-5360 (2007).</li>
<li>Shen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+inactivation+of+Salmonella+and+Pseudomonas+biofilms+on+stainless+steel+by+use+of+T-128%2C+a+fresh-produce+washing+aid%2C+in+chlorinated+wash+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Enhanced inactivation of Salmonella and Pseudomonas biofilms on stainless steel by use of T-128, a fresh-produce washing aid, in chlorinated wash solutions.</a> Appl. Environ. Microbiol. 78, 6789-6798 (2012).</li>
<li>Hoefel, D., Grooby, W. L., Monis, P. T., Andrews, S., Saint, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enumeration+of+water-borne+bacteria+using+viability+assays+and+flow+cytometry%3A+a+comparison+to+culture-based+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microbiol+Methods%22%5BJournal%5D)">Enumeration of water-borne bacteria using viability assays and flow cytometry: a comparison to culture-based techniques.</a> J Microbiol Methods. 55, 585-597 (2003).</li>
<li>Oh, H., Siano, B., Diamond, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+isolation+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp.%22%5BJournal%5D)">Neutrophil isolation protocol.</a> J. Vis. Exp.. (17), e745(2008).</li>
<li>Allen, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunofluorescence+and+confocal+microscopy+of+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Immunofluorescence and confocal microscopy of neutrophils.</a> Methods Mol Biol. 412, 273-287 (2007).</li>
<li>Kaplan, E. L., Chhatwal, G. S., Rohde, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+ability+of+penicillin+to+eradicate+ingested+group+A+streptococci+from+epithelial+cells%3A+clinical+and+pathogenetic+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Reduced ability of penicillin to eradicate ingested group A streptococci from epithelial cells: clinical and pathogenetic implications.</a> Clin. Infect. Dis. 43, 1398-1406 (2006).</li>
<li>Chow, O. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Statins+enhance+formation+of+phagocyte+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Statins enhance formation of phagocyte extracellular traps.</a> Cell Host Microbe. 8, 445-454 (2010).</li>
<li>Thulin, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viable+group+A+streptococci+in+macrophages+during+acute+soft+tissue+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Med%22%5BJournal%5D)">Viable group A streptococci in macrophages during acute soft tissue infection.</a> PLoS Med. 3, e53(2006).</li>
<li>Kubica, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+potential+new+pathway+for+Staphylococcus+aureus+dissemination%3A+the+silent+survival+of+S.+aureus+phagocytosed+by+human+monocyte-derived+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A potential new pathway for Staphylococcus aureus dissemination: the silent survival of S. aureus phagocytosed by human monocyte-derived macrophages.</a> PLoS One. 3, (2008).</li>
<li>Swords, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterium+xenopi+multiplies+within+human+macrophages+and+enhances+HIV+replication+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Microb.+Pathog%22%5BJournal%5D)">Mycobacterium xenopi multiplies within human macrophages and enhances HIV replication in vitro.</a> Microb. Pathog. 40, 41-47 (2006).</li>
<li>Tamilselvam, B., Almeida, R. A., Dunlap, J. R., Oliver, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streptococcus+uberis+internalizes+and+persists+in+bovine+mammary+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Microb.+Pathog%22%5BJournal%5D)">Streptococcus uberis internalizes and persists in bovine mammary epithelial cells.</a> Microb. Pathog. 40, 279-285 (2006).</li>
<li>Martinez, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+determination+of+Mycobacterium+leprae+viability+by+use+of+real-time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Molecular determination of Mycobacterium leprae viability by use of real-time PCR.</a> J. Clin. Microbiol. 47, 2124-2130 (2009).</li>
<li>Botha, M., Botes, M., Loos, B., Smith, C., Dicks, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lactobacillus+equigenerosi+strain+Le1+invades+equine+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Lactobacillus equigenerosi strain Le1 invades equine epithelial cells.</a> Appl. Environ. Microbiol. 78, 4248-4255 (2012).</li>
<li>Allen, L. A., Schlesinger, L. S., Kang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virulent+strains+of+Helicobacter+pylori+demonstrate+delayed+phagocytosis+and+stimulate+homotypic+phagosome+fusion+in+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Virulent strains of Helicobacter pylori demonstrate delayed phagocytosis and stimulate homotypic phagosome fusion in macrophages.</a> J. Exp. Med. 191, 115-128 (2000).</li>
<li>Smith, C. D., Berk, S. G., Brandl, M. T., Riley, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+characteristics+of+diarrheagenic+Escherichia+coli+pathotypes+and+Helicobacter+pylori+during+passage+through+the+free-living+ciliate%2C+Tetrahymena+sp%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Ecol%22%5BJournal%5D)">Survival characteristics of diarrheagenic Escherichia coli pathotypes and Helicobacter pylori during passage through the free-living ciliate, Tetrahymena sp.</a> FEMS Microbiol. Ecol. 82, 574-583 (2012).</li>
<li>Morse, S. A., Bartenstein, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purine+metabolism+in+Neisseria+gonorrhoeae%3A+the+requirement+for+hypoxanthine%5BTitle%5D)+AND+%22Can.+J.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Purine metabolism in Neisseria gonorrhoeae: the requirement for hypoxanthine.</a> Can. J. Microbiol. 26, 13-20 (1980).</li>
<li>Johnson, M. B., Criss, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neisseria+gonorrhoeae+phagosomes+delay+fusion+with+primary+granules+to+enhance+bacterial+survival+inside+human+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Neisseria gonorrhoeae phagosomes delay fusion with primary granules to enhance bacterial survival inside human neutrophils.</a> Cell Microbiol. , (2013).</li>
<li>Stocks, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+and+use+of+the+commercially+available+viability+stain%5BTitle%5D)+AND+%22BacLight.+Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Mechanism and use of the commercially available viability stain.</a> BacLight. Cytometry A. 61, 189-195 (2004).</li>
</ol>

著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

DNAがヒト細胞にし、内部に取り付け生死菌を特定するための蛍光レクチンと一緒に結合し、実行可能性染料使用する2つのプロトコルがここに提示した。両方のプロトコルが有効に死菌からライブを区別するので、使用するプロトコルの選択は、実験の目的に依存します。第一のプロトコルはそのまま細菌を検出するために、生育不能細菌やSYTO9を検出するために、ヨウ化プロピジウムを使用しています。 図4Aに示されるプロトコル1の代表画像がNに感染したヒト好中球に適用される淋菌 。これらの色素は、細胞外Nを認識するために、レクチン、ダイズ凝集素と一緒にした淋菌が、結合された蛍光菌特異的抗体は、代替として使用することができる。ヨウ化プロピジウムによるSYTO9の除外は生育不能細菌が赤と生菌は緑の蛍光を発する蛍光を発しますので、プロトコル1は、容易に、個々の細菌の生存を明らかにしている。 HoweveR、このプロトコルは、従来の蛍光顕微鏡で使用可能な4チャンネルの2中のヨウ化プロピジウムの蛍光に、宿主タンパク質のための免疫蛍光と組み合わせることはできません。した...

細菌やそれらが存在するホスト間の動的相互作用と共進化があります。細菌が付着小器官、分泌系、および/または宿主食細胞および非貪食細胞のそれらの生産的な感染を可能にする毒素を産生する能力を進化させてきた。細菌は、宿主免疫系の認識と抗菌活性と競合しなければならない。宿主の免疫系は、物理的および化学的障壁、免疫細胞、補体系、及び体液性免疫の他の成分を含む、先天性および適応性の成分から構成されている。多くの細菌は、多層宿主免疫応答による殺傷およびクリアランスを受けやすいが、いくつかの病原性および日和見細菌は、種々の宿主細胞に感染し、宿主免疫応答1によるクリアランスを破壊するメカニズムを進化させてきた。 淋菌は、細菌病原体の一例であるそれは非常に、そのヒト宿主に固執するようになっている。N。淋菌は、容易に尿生殖路、咽頭、結膜、および直腸の粘膜上皮細胞の管の表面にコロニーを形成。植民地化は、粘膜部位に好中球の豊富な採用をトリガします。好中球は、微生物を殺す抗菌様々なプロセスを持っている専門的な食細胞であるが、N。淋菌は、好中球2-5の存在下で生存することが可能である。このようなNとしてどのように細菌性病原体の理解淋菌覆す、抑制し、最終的には、通常敵対ホスト環境で生き残るために免疫応答をハイジャックは、感染症と闘うための新たな治療法の開発に不可欠である。 多くの場合、宿主細胞内での細菌の生存を調査するために使用される実験プロトコルは、コロニーカウントアッセイ、ゲンタマイシン保護アッセイ、電子顕微鏡法が挙げられる。コロニー数のアッセイでは、感染した細胞の集団は、WHの洗剤で、例えば（溶解されているICH細菌は細菌を遊離させるために）抵抗性である。溶解物を希釈し、寒天ベースの培地上にプレートし、溶解物中のコロニー形成単位を、各時点および/または実験条件について列挙されている。このアプローチは、全体の細菌集団の生存を報告したが、細胞内と細胞外の生存を区別することはできない。コロニーカウントアッセイの変形、ゲンタマイシン保護アッセイは、具体的には真核生物の原形質膜6を通過する抗生物質ゲンタマイシンできないことに基づいて、細胞内の細菌の生存率を測定する。しかし、このアッセイは、ゲンタマイシン（または同様に、真核生物膜非透過性である別の抗生物質）と内部の細菌へのアクセス権を持っている抗生物質のことができないことによって殺傷に対して感受性である細菌に依存している。したがって、ゲンタマイシン保護アッセイは、すべての細菌種の検査のために有効であるか否よい高度における細菌の生存率を調べると好中球などのピノサイトーシス細胞。 （細菌が凝集体又は異なって、個々の細菌細胞から振る舞う微小コロニーを形成している場合など ）これらのアプローチのいずれも、細胞内局在や個々の細菌の他の動作を明らかにする。個々の外部および内部の細菌の生存率を調べるための別のアプローチは、頻繁に使用される薄切片を透過型電子顕微鏡（TEM）である。それはさらに、亜細胞マーカーに対する金結合抗体を用いて免疫電子顕微鏡によって調査することができる宿主細胞（ 例えばファゴソーム、細胞質、オートファゴソーム）、細菌の位置に関する情報を提供することができるという点で、このアプローチは有利で ​​ある。しかし、電子顕微鏡では、細菌の生存能力を評価することを特に区別されません。埋め込まれた切片は、酢酸ウラニル、クエン酸鉛、または他の電子密度試薬で染色し、電子顕微鏡によって画像化されると、電子密度の高い細菌が生存可能であり、電気考えられているTRONルーセント生育不能7,8。しかし、この仮定はひどく混乱膜や細胞質を欠いたとだけ死菌ので、電子·ルーセントが表示され、細菌の生存能力を過大評価。さらに、いくつかの細菌種は、それが困難な生存率を決定すること、それらの成長段階に応じて、電子密度の範囲を表示することができる。 代替として、またはこれらの広く使用されている方法に加えて、ここでは、宿主細胞によって内在化に取り付けられた細菌の生存を評価するための細菌の生存率を示す蛍光染料の使用のためのプロトコルおよび理論的根拠を提供する。細胞外の細菌を同定するために、感染細胞を、最初のそのようなレクチンまたは細菌特異的抗体などの蛍光試薬にさらされる。感染した細胞は、その後、透過処理し、細菌の生存のための代理として、劣化した膜対そのままで細菌に差動的にアクセス可能なDNA特異的染料にさらされている。最初のP INヨウ化プロピジウムは、膜を侵害しているため、生育不能と考えられているものの細菌のみがアクセスされている間rotocol、膜透過性色素SYTO9は、全細菌集団を同定する。ヨウ化とSYTO9は、バイオフィルム中の細菌の生存能力を評価する非病原性細菌から病原性差別、そして実行可能な水性菌9月12日を列挙するために使用されている。 SYTOXグリーン生育不能人口のみがアクセスされているときに2番目のプロトコルでは、4 &#39;、6&#39;-ジアミジノ-2 - フェニルインドール（DAPI）は、総菌数を識別します。これらの生存度色素対は、細菌の細胞内局在を定義する、例えば、目的のタンパク質に関連して各細菌の位置を決定するために、免疫蛍光法と組み合わせることができる。これらのアッセイの使用は、宿主細胞の感染時に細菌殺傷または生存につながる相互作用に重要な洞察を提供します。この資料に記載されているプロトコルは、生存率を評価した好中球ファゴソーム5,13,14の異なる集団に含めた初代ヒト好中球、および内部で接続されている淋菌 。しかしながら、これらのプロトコルは、プロ食細胞、非専門食細胞、および原生動物で15-24グラム陽性およびグラム陰性細菌の生存率を評価するために適用することができる。

<table><tbody><tr><td>採血用21 G 3/4蝶針</td><td>ベクトン・ディキンソン</td><td>367251</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>ヘパリンナトリウム10ml</td>ベ<td>クトンディキンソン</td><td>366480</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>灌漑用滅菌水</td><td>バクスター</td><td>07-09-64-070</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>デキストラン 500</td><td>シグマ</td><td>31392</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td>フィ<td>ッシャーサイエンティフィック</td><td>S641</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>デキストロース</td><td>・リッカ・ケミカル・カンパニー</td><td>RDCD0200</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>ダルベッコのPBSはCa2+またはMg2+</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH3002802</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Ficollソリューション</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-03</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>酢酸</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP2401</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>12 mm円形ガラスカバースリップフィ</td><td>ッシャーサイエンティフィック</td><td>12-545-80 12CIR-1</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>24ウェルプレート</td><td>コーニングインコーポレイテッド</td><td>3524</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>プール型ヒト血清</td><td>Sigma</td><td>S7023</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>RPMI</td><td>メディアテック</td><td>15-040-CV&</td><td>nbsp;</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH3007103</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>ヒトインターロイキン-8</td><td>R&Dシステムズ</td><td>208-IL/CF&</td><td>nbsp;</td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma</td><td>M3183</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>MgCl<サブ >2</サブ></td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP214</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>ヨウ化プロピジウム</td><td>ライフテクノロジー</td>ズ<td>L7007またはL7012</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>SYTO9</td><td>Life Technologies</td><td>L7007 または L7012</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>サポニン</td><td>フルーカアナリティカル</td><td>47036</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647結合大豆レクチン</td><td>Life Technologies</td><td>L-32463</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>シグマ</td><td>D8417</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>SYTOX Green</td><td>Life Technologies</td><td>S7020</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>マウス抗CD63</td><td>発生研究ハイブリドーマバンク</td><td>H5C6</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555抗体ラベリングキット</td><td>Life Technologies</td><td>A20187</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>血球計算盤 Bright Line</td><td>Hausser Scientific</td><td>1492</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>鉗子</td><td>EMS</td><td>78320</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Sorvall Legend RT + 遠心分離機</td><td>Thermo Scientific</td><td>75004377</td><td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

哺乳動物細胞に関連して細菌の生存を決定するための蛍光顕微鏡法

Fluorescence Microscopy Methods for Determining the Viability of Bacteria in Association with Mammalian Cells

微生物は、真核細胞への曝露後に存続した場合、どのように細菌の病原性の分野の中心となるのは、定義する機能です。これらの疑問を解決するために、現在のプロトコルは、コロニー数アッセイ、ゲンタマイシン保護アッセイ、および電子顕微鏡が含まれています。コロニー数およびゲンタマイシン保護アッセイは、全体細菌集団の生存能力を評価し、個々の細菌生存率を測定することができない。電子顕微鏡法は、個々の細菌の生存度を決定し、宿主細胞におけるそれらの局在化に関する情報を提供するために使用することができる。しかし、細菌はしばしば生存率の評価を困難に、電子密度の範囲を示す。この記事では、内部および宿主細胞に関連する個々の細菌の生存を明らかに蛍光色素を使用するためのプロトコルの概要を説明します。これらのアッセイは、初代ヒト好中球淋菌の生存を評価するために独自に開発されましたが、あるべき任意の細菌宿主細胞の相互作用にpplicable。これらのプロトコルは、アクセス可能であり、膜不透過性蛍光色素（ヨウ化プロピジウムおよびSYTOXグリーン）のすべての細菌を、染色膜透過性蛍光色素（SYTO9及び4 &#39;、6 - ジアミジノ-2 - フェニル[DAPI]）を、コンバイン生育不能細菌。真核細胞の透過処理の前に、抗体または蛍光試薬は、細胞外細菌を同定するために添加される。したがって、これらのアッセイは、真核細胞への内部付着細菌の生存を判別する。プロトコルは、個々の細菌の細胞内局在を決定するために、真核細胞マーカーに対する蛍光抗体と組み合わせて生存色素を使用するために設けられている。この資料に記載された細菌の生存率染料は、個々の細菌の生存率を評価し、細菌が宿主細胞内で生存する場所に関する情報を提供するために、伝統的な微生物学技術に対して敏感で補体および/または代替物であるS。

概説したプロトコルは、N.の生存を調べた初代ヒト好中球5,26にさらされた後淋菌 。好中球は、感染させたN.淋菌および緑色蛍光生存色素SYTO9及び赤色蛍光ヨウ化プロピジウム（ 図4A）を使用して、プロトコル1で処理した。染料は、優先的に、宿主細胞原形質膜を透過性にするために、コレステロールを隔離サポニンの存在下ではなく、N.添加した淋菌の膜。関心対象の細菌の膜は、コレステロールを多量に含有する場合に他の界面活性剤を試験する必要があるかもしれない。すべてのN. SYTO9と淋菌の染みが、妥協膜を有する唯一の細菌はヨウ化プロピジウムで染色する。ヨウ化プロピジウムはSYTO9蛍光を克服し、その生菌は緑と死菌は27赤く表示され表示されます。いくつかの細菌種では、ヨウ化プロピジウムは完全SYTO9 staininを克服しない場合がありますGは、死菌で得られた黄色やオレンジ登場。 SYTO 9のヨウ化プロピジウムの比が異なる細菌種のために最適化さ...

微生物は、真核細胞への曝露後に存続した場合、どのように細菌の病原性の分野の中心となるのは、定義する機能です。この記事では、内部および宿主細胞に関連する個々の細菌の生存を明らかに蛍光色素を使用するためのプロトコルの概要を説明します。

Central to the field of bacterial pathogenesis is the ability to define if and how microbes survive after exposure to eukaryotic cells. Current protocols ...

この蛍光顕微鏡実験では、ホスト細胞に関連する個々の細菌の生存能を評価し、異なる細胞内部位における細菌の生存能を判定します。まず、細胞外の細菌を特定するために、細菌のパーミアーゼに特異的な蛍光試薬を感染細胞に作用させ、さらに細菌の細胞膜の完全性に基づいて生存細菌と非生存細菌を区別する蛍光染料を用いて、感染したホストを処理します。次に、ホスト細胞内のどこに細菌が存在するかを示すため、目的のマーカーに対する蛍光標識抗体を用いて感染細胞をインキュベートします。得られた免疫蛍光画像により、宿主細胞内外の生存細菌の割合や、細胞内における生存細菌と非生存細菌の細胞内局在を決定することができます。コロニーカウント法、ゲンタマイシン保護アッセイ、電子顕微鏡法とは異なり、本手法では個々の細菌の生存能を直接的に評価することが可能です。また、異なる細胞内コンパートメントに存在する細菌の間で、生存能に差があるかどうかも明らかにできます。この手順の実演を行うのは、私の研究室の大学院生であるBrittany Johnsonです。24ウェルプレートの円形ガラスカバースリップ上で培養した細胞に、目的の細菌を添加し、所定の時間インキュベートします。感染させた細胞を一度優しく洗浄します。次に、外部の細菌を検出するために、Alexa Fluor 647結合抗体または細菌特異的レクチンを添加し、室温の暗所で10分間インキュベートします。2回洗浄した後、培地を吸引し、Cyto 9およびプロピジウムヨードを含む生死染色溶液を0.5 milliliters添加します。細胞を室温の暗所で15分間インキュベートし、その後、MOPSマグネシウムクロリドで2回洗浄します。カバーガラスを反転させ、ガラススライドの上に伏せて置きます。透明なマニキュアで封印します。細菌を標識するために、テキストプロトコルに詳述されているフィルターセットを備えた蛍光顕微鏡を用いて、30分以内に画像を撮影します。mors定義培地で10 µg/mLのDPIを加え、室温の暗所で20分間インキュベートします。次に、DPIで標識した細菌を接着細胞に感染させます。細胞をアルデヒドや有機溶媒で固定しないでください。細胞を一度すすぎます。次に、Alexa Fluor 647結合抗体またはレクチンを加え、室温・暗所にて10分間インキュベートします。MOPS緩衝液で2回洗浄した後、目的の細胞内マーカーに対するAlexa Fluor 555結合抗体を加え、20分間インキュベートします。MOPS緩衝液で2回洗浄した後、MOPS塩化マグネシウム溶液で細胞を1回洗浄します。その後、培地を吸引し、0.4 µMのCytGreenを加え、室温・暗所にて5分間インキュベートし、MOPS塩化マグネシウム溶液で細胞を2回洗浄します。その後、細胞を洗浄します。MOPSマグネシウム塩溶液でさらに5分間洗浄してください。カバースリップをガラススライドの上に裏返して置き、透明なマニキュアで密封します。30分以内に蛍光顕微鏡でスライドの画像を撮影してください。本実験では、ヒト好中球に淋菌（gonorrhea）を感染させました。Alexa Fluor 647結合大豆レクチンを用いて、細胞外の淋菌を検出します。次に、サポニン存在下で、緑色蛍光の生存判定用染料および赤色蛍光のプロピジウムヨード（propidium iodide）を添加しました。サポニンはコレステロールを捕捉することで宿主細胞の細胞質膜を選択的に透過させますが、感染細胞内の淋菌の膜は透過させません。真核細胞の核は、Cyto 9およびプロピジウムヨードの両方で染色されます。これらの淋菌感染好中球の画像は、生存率染料のCytTalk ScreenおよびDPIを用いて作成されました。プロピジウムヨード染料は、蛍光顕微鏡の赤色および紫外線の両方のチャンネルで蛍光を発するため、使用しませんでした。すべての淋菌はDPIで染色されますが、膜が損傷した細菌のみがOx Greenで染色されます。生存不能な細胞内細菌の周囲には、CD 63の染色リングが見られます。このリングは、このファゴソームに一次顆粒が集積していることを示しています。一方で、生存している細胞内細菌にはCD 63の染色が見られず、そのファゴソームには一次顆粒が集積していないことが示されています。以上のデータは、淋菌の生存能と一次顆粒陰性ファゴソームへの滞在との間に相関があることを示しています。このビデオを視聴することで、宿主細胞内における細菌の生存能を評価する方法を十分に理解できるはずです。さらに、これらの細胞内コンパートメントに対する抗体を用いることで、宿主細胞内の異なるコンパートメントに局在する細菌の生存能を判定できるようになります。

fluorescence-microscopy-methods-for-determining-viability-bacteria

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

我々は、マイコバクテリアの列挙に​​別のアプローチを説明します...

BCGまたはM. TB（BCGタグレポーター遺伝子を用いて、抗酸菌の生存率を測定するための機能全血アッセイルクス / M. Tbをルクス）

間の共生を研究するために、...

蛍光顕微鏡を用いて線虫の中の細菌の可視化

Source: Calatayud Arroyo, M., et al. Assessing the Viability of a Synthetic Bacterial Consortium on the In Vitro Gut Host-microbe Interface. J. Vis. Exp. (2018)The video demonstrates a method to evaluate the viability of anaerobic oral bacteria using fluorescent dyes and flow cytometry. It begins with culturing bacteria in oxygen-free broth, followed by resuspending a single colony from a blood agar plate. After incubation and dilution, the culture is stained with membrane-permeable and...

Fluorescence-Based Viability Assessment of Oral Anaerobic Bacteria

クラミジアを含む細胞液胞(封入体)を照らすための生細胞蛍光タンパク質ベースの方法が説明されています。この戦略により、サンプル中のクラミジア感染性を迅速かつ自動的に測定でき、インクルージョン増殖ダイナミクスを定量的に調査するために使用できます。...

視覚化し、定量化するために蛍光タンパク質を使用しました<em&gt;クラミジア</em生細胞内&gt;液胞の成長ダイナミクス

生体内の生体分子の研究は、生物学的な文脈における分子機能を理解するために非常に重要です。ここでは、DNAやタンパク質などの蛍光生体分子を生きた微生物に取り込むことができる新しい方法について説明します。蛍光顕微鏡で記録されたin...

エレクトロポ生きた微生物で内在化および蛍光生体分子の観測

この記事では、宿主内に侵入して生存できる嫌気性細菌を測定するためのプロトコルと、宿主細胞と相互作用する嫌気性細菌を視覚化するためのプロトコルの2つを紹介します。この研究は、培養可能な嫌気性菌および真核細胞の種類に応用できます。...

宿主細胞と嫌気性菌の相互作用を評価するためのモデル生物としてポルフィロモナス・ジンジバリス

ウイルス感染HeLa細胞単層への付着に対する王国間の関連性と競争(細菌および真菌)を決定するための方法がここに記載されています。このプロトコルは、原核生物、真核生物、およびウイルスの複数の組み合わせに拡張できます。...

細菌や真菌によってウイルス感染細胞上のバイオフィルムの開始の決意

細菌の本質的なプロセスの機能を理解することは困難です。ターゲット固有の染料を蛍光顕微鏡は、微生物細胞の成長そして細胞周期の進行に重要な洞察を提供できます。ここでは、アグロバクテリウムは不可欠なプロセスの特性評価のための生きているセルイメージ投射のための方法を強調するモデル菌として使用されます。...

微生物細胞の成長に不可欠なプロセスを遵守する細胞蛍光顕微鏡をライブします。

この記事では、タンパク質の細胞内局在ダイナミクスを調査し、バチルス・サチリスおよび黄色ブドウ球菌における高分解能蛍光顕微鏡を用いて形態学的変化を監視するためのステップバイステップガイドを提供します。...

細菌における細胞内タンパク質の局在化と細胞形態の変化を調べる生細胞蛍光顕微鏡

この生菌細胞イメージングプロトコルは、時間の経過とともに単一細胞レベルで複数の細菌種間の相互作用を可視化することを可能にする。タイムラプスイメージングは、個々の細胞の運動性および生存率を含む多種細菌群集における種間相互作用を尋問するために、単一培養または共培養における各細菌種の観察を可能にする。...

単細胞間細菌相互作用の運動的可視化

この原稿は、単細胞蛍光顕微鏡を用いて、コカルチャーにおける細菌の競合を可視化し定量する方法を説明する。...

単細胞蛍光イメージングによる細菌間競争の定量化

学ぶ蛍光顕微鏡法で哺乳動物細胞に関連する細菌の生存を評価する方法です。蛍光色素を用いて細菌膜の透過性に基づき生存細菌と死滅細菌を区別し、宿主細胞内の細菌の局在と生存率を可視化します。

哺乳動物細胞に関連して細菌の生存を決定するための蛍光顕微鏡法

さらに動画を探す