哺乳動物細胞に関連して細菌の生存を決定するための蛍光顕微鏡法

この蛍光顕微鏡実験では、ホスト細胞に関連する個々の細菌の生存能を評価し、異なる細胞内部位における細菌の生存能を判定します。まず、細胞外の細菌を特定するために、細菌のパーミアーゼに特異的な蛍光試薬を感染細胞に作用させ、さらに細菌の細胞膜の完全性に基づいて生存細菌と非生存細菌を区別する蛍光染料を用いて、感染したホストを処理します。次に、ホスト細胞内のどこに細菌が存在するかを示すため、目的のマーカーに対する蛍光標識抗体を用いて感染細胞をインキュベートします。

得られた免疫蛍光画像により、宿主細胞内外の生存細菌の割合や、細胞内における生存細菌と非生存細菌の細胞内局在を決定することができます。コロニーカウント法、ゲンタマイシン保護アッセイ、電子顕微鏡法とは異なり、本手法では個々の細菌の生存能を直接的に評価することが可能です。また、異なる細胞内コンパートメントに存在する細菌の間で、生存能に差があるかどうかも明らかにできます。

この手順の実演を行うのは、私の研究室の大学院生であるBrittany Johnsonです。24ウェルプレートの円形ガラスカバースリップ上で培養した細胞に、目的の細菌を添加し、所定の時間インキュベートします。感染させた細胞を一度優しく洗浄します。次に、外部の細菌を検出するために、Alexa Fluor 647結合抗体または細菌特異的レクチンを添加し、室温の暗所で10分間インキュベートします。

2回洗浄した後、培地を吸引し、Cyto 9およびプロピジウムヨードを含む生死染色溶液を0.5 milliliters添加します。細胞を室温の暗所で15分間インキュベートし、その後、MOPSマグネシウムクロリドで2回洗浄します。カバーガラスを反転させ、ガラススライドの上に伏せて置きます。

透明なマニキュアで封印します。細菌を標識するために、テキストプロトコルに詳述されているフィルターセットを備えた蛍光顕微鏡を用いて、30分以内に画像を撮影します。mors定義培地で10 µg/mLのDPIを加え、室温の暗所で20分間インキュベートします。

次に、DPIで標識した細菌を接着細胞に感染させます。細胞をアルデヒドや有機溶媒で固定しないでください。細胞を一度すすぎます。

次に、Alexa Fluor 647結合抗体またはレクチンを加え、室温・暗所にて10分間インキュベートします。MOPS緩衝液で2回洗浄した後、目的の細胞内マーカーに対するAlexa Fluor 555結合抗体を加え、20分間インキュベートします。MOPS緩衝液で2回洗浄した後、MOPS塩化マグネシウム溶液で細胞を1回洗浄します。その後、培地を吸引し、0.4 µMのCytGreenを加え、室温・暗所にて5分間インキュベートし、MOPS塩化マグネシウム溶液で細胞を2回洗浄します。

その後、細胞を洗浄します。MOPSマグネシウム塩溶液でさらに5分間洗浄してください。カバースリップをガラススライドの上に裏返して置き、透明なマニキュアで密封します。30分以内に蛍光顕微鏡でスライドの画像を撮影してください。

本実験では、ヒト好中球に淋菌（gonorrhea）を感染させました。Alexa Fluor 647結合大豆レクチンを用いて、細胞外の淋菌を検出します。次に、サポニン存在下で、緑色蛍光の生存判定用染料および赤色蛍光のプロピジウムヨード（propidium iodide）を添加しました。サポニンはコレステロールを捕捉することで宿主細胞の細胞質膜を選択的に透過させますが、感染細胞内の淋菌の膜は透過させません。真核細胞の核は、Cyto 9およびプロピジウムヨードの両方で染色されます。

これらの淋菌感染好中球の画像は、生存率染料のCytTalk ScreenおよびDPIを用いて作成されました。プロピジウムヨード染料は、蛍光顕微鏡の赤色および紫外線の両方のチャンネルで蛍光を発するため、使用しませんでした。すべての淋菌はDPIで染色されますが、膜が損傷した細菌のみがOx Greenで染色されます。

生存不能な細胞内細菌の周囲には、CD 63の染色リングが見られます。このリングは、このファゴソームに一次顆粒が集積していることを示しています。一方で、生存している細胞内細菌にはCD 63の染色が見られず、そのファゴソームには一次顆粒が集積していないことが示されています。

以上のデータは、淋菌の生存能と一次顆粒陰性ファゴソームへの滞在との間に相関があることを示しています。このビデオを視聴することで、宿主細胞内における細菌の生存能を評価する方法を十分に理解できるはずです。さらに、これらの細胞内コンパートメントに対する抗体を用いることで、宿主細胞内の異なるコンパートメントに局在する細菌の生存能を判定できるようになります。