Name: 蛍光顕微鏡を用いて線虫の中の細菌の可視化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-19T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 2 s
Description: 学ぶ蛍光顕微鏡を用いた線虫内細菌の可視化手法。Xenorhabdus細菌とSteinernema線虫の共生関係を観察し、細菌の宿主内局在と分布頻度を解析する方法です。共生生物学研究に応用可能です。

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著者は、使用されるこのプロトコルとツールの開発への彼らの貢献についてエウジェニオVivas、クルトHeungens、エリック·マルテンス、チャールズコールズ、ダービー砂糖、エリックStabb、とトッドCicheに感謝したいと思います。 KEMおよびJMCは、国立衛生研究所（NIH）の国立研究サービス賞T32（AI55397 &quot;健康と疾患における微生物&quot;）によってサポートされていました。 JMCは、大学院研究フェローシップ国立科学財団（NSF）によってサポートされていました。この作品は、国立科学財団（IOS-0920631およびIOS-0950873）からの補助金によって支えられている。

<ol><li>Holterman, M., van der Wurff, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylum-wide+analysis+of+SSU+rDNA+reveals+deep+phylogenetic+relationships+among+nematodes+and+accelerated+evolution+toward+crown+clades%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Evol%22%5BJournal%5D)">Phylum-wide analysis of SSU rDNA reveals deep phylogenetic relationships among nematodes and accelerated evolution toward crown clades.</a> Mol. Biol. Evol. 23, 1792-1800 (2006).</li>
<li>Lambshead, P. J. D., Boucher, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marine+nematode+deep-sea+biodiversity+-+hyperdiverse+or+hype%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biogeogr%22%5BJournal%5D)">Marine nematode deep-sea biodiversity - hyperdiverse or hype.</a> J. Biogeogr. 30, 475-485 (2003).</li>
<li>Poinar, G. O. J., Thomas, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Significance+of+Achromobacter+nematophilus+Poinar+and+Thomas+%28Achromobacteraceae%3A+Eubacteriales%29+in+the+development+of+the+nematode%2C+DD-136+%28Neoaplectana+sp.+Steinernematidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitol%22%5BJournal%5D)">Significance of Achromobacter nematophilus Poinar and Thomas (Achromobacteraceae: Eubacteriales) in the development of the nematode, DD-136 (Neoaplectana sp. Steinernematidae).</a> Parasitol. 56, 385-390 (1966).</li>
<li>Herbert, E. E., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Friend+and+foe%3A+the+two+faces+of+Xenorhabdus+nematophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Friend and foe: the two faces of Xenorhabdus nematophila.</a> Nat. Rev. Microbiol. 5, 634-646 (2007).</li>
<li>Kaya, H. K., Gaugler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entomopathogenic+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Entomol%22%5BJournal%5D)">Entomopathogenic nematodes.</a> Annu. Rev. Entomol. 38, 181-206 (1993).</li>
<li>Bird, A. F., Akhurst, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nature+of+the+intestinal+vesicle+in+nematodes+of+the+family+Steinernematidae%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">The nature of the intestinal vesicle in nematodes of the family Steinernematidae.</a> Int. J. Parasitol. 13, 599-606 (1983).</li>
<li>Martens, E. C., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Steinernema+carpocapsae+intestinal+vesicle+contains+a+subcellular+structure+with+which+Xenorhabdus+nematophila+associates+during+colonization+initiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The Steinernema carpocapsae intestinal vesicle contains a subcellular structure with which Xenorhabdus nematophila associates during colonization initiation.</a> Cell. Microbiol. 7, 1723-1735 (2005).</li>
<li>Snyder, H. A., Stock, S. P., Kim, S. K., Flores-Lara, Y., Forst, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+the+colonization+and+release+process+of+Xenorhabdus+nematophila+and+the+morphology+and+ultrastructure+of+the+bacterial+receptacle+of+its+nematode+host%2C+Steinernema+carpocapsae%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">New insights into the colonization and release process of Xenorhabdus nematophila and the morphology and ultrastructure of the bacterial receptacle of its nematode host, Steinernema carpocapsae.</a> Appl. Environ. Microbiol. 73, 5338-5346 (2007).</li>
<li>Abebe, E., Abebe-Akele, F., Morrison, J., Cooper, V., Thomas, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+insect+pathogenic+symbiosis+between+a+Caenorhabditis+and+Serratia%5BTitle%5D)+AND+%22Virulence%22%5BJournal%5D)">An insect pathogenic symbiosis between a Caenorhabditis and Serratia.</a> Virulence. 2, 158-161 (2011).</li>
<li>Abebe, E., Jumba, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+entomopathogenic+Caenorhabditis+briggsae%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">An entomopathogenic Caenorhabditis briggsae.</a> J. Exp. Biol. 213, 3223-3229 (2010).</li>
<li>Torres-Barragan, A., Suazo, A., Buhler, W. G., Cardoza, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+the+entomopathogenicity+and+bacterial+associates+of+the+nematode+Oscheius+carolinensis%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Control%22%5BJournal%5D)">Studies on the entomopathogenicity and bacterial associates of the nematode Oscheius carolinensis.</a> Biol. Control. 59, 123-129 (2011).</li>
<li>Ye, W. M., Torres-Barragan, A., Cardoza, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oscheius+carolinensis+n.+sp+%28Nematoda%3A+Rhabditidae%29%2C+a+potential+entomopathogenic+nematode+from+vermicompost%5BTitle%5D)+AND+%22Nematology%22%5BJournal%5D)">Oscheius carolinensis n. sp (Nematoda: Rhabditidae), a potential entomopathogenic nematode from vermicompost.</a> Nematology. 12, 121-135 (2010).</li>
<li>Zhang, C., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterorhabditidoides+chongmingensis+gen.+nov.%2C+sp.+nov.+%28Rhabditida%3A+Rhabditidae%29%2C+a+novel+member+of+the+entomopathogenic+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Invertebr.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Heterorhabditidoides chongmingensis gen. nov., sp. nov. (Rhabditida: Rhabditidae), a novel member of the entomopathogenic nematodes.</a> J. Invertebr. Pathol. 98, 153-168 (2008).</li>
<li>Martens, E. C., Heungens, K., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+colonization+events+in+the+mutualistic+association+between+Steinernema+carpocapsae+nematodes+and+Xenorhabdus+nematophila+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Early colonization events in the mutualistic association between Steinernema carpocapsae nematodes and Xenorhabdus nematophila bacteria.</a> J. Bacteriol. 185, 3147-3154 (2003).</li>
<li>Ciche, T. A., Ensign, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((For+the+insect+pathogen%2C+Photorhabdus+luminescens%2C+which+end+of+a+nematode+is+out%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">For the insect pathogen, Photorhabdus luminescens, which end of a nematode is out.</a> Appl. Environ. Microbiol. 69, 1890-1897 (2003).</li>
<li>Ciche, T. A., Kim, K. S., Kaufmann-Daszczuk, B., Nguyen, K. C., Hall, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+invasion+and+matricide+during+Photorhabdus+luminescens+transmission+by+Heterorhabditis+bacteriophora+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Cell invasion and matricide during Photorhabdus luminescens transmission by Heterorhabditis bacteriophora nematodes.</a> Appl. Environ. Microbiol. 74, 2275-2287 (2008).</li>
<li>Easom, C. A., Joyce, S. A., Clarke, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+genes+involved+in+the+mutualistic+colonization+of+the+nematode+Heterorhabditis+bacteriophora+by+the+bacterium+Photorhabdus+luminescens%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Identification of genes involved in the mutualistic colonization of the nematode Heterorhabditis bacteriophora by the bacterium Photorhabdus luminescens.</a> BMC Microbiol. 10, 45(2010).</li>
<li>Somvanshi, V. S., Kaufmann-Daszczuk, B., Kim, K. S., Mallon, S., Ciche, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photorhabdus+phase+variants+express+a+novel+fimbrial+locus%2C+mad%2C+essential+for+symbiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Photorhabdus phase variants express a novel fimbrial locus, mad, essential for symbiosis.</a> Mol. Microbiol. 77, 1021-1038 (2010).</li>
<li>Martens, E. C., Russell, F. M., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Xenorhabdus+nematophila+metabolic+mutants+yields+insight+into+stages+of+Steinernema+carpocapsae+nematode+intestinal+colonization%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Analysis of Xenorhabdus nematophila metabolic mutants yields insight into stages of Steinernema carpocapsae nematode intestinal colonization.</a> Mol. Microbiol. 51, 28-45 (2005).</li>
<li>Sugar, D. R., Murfin, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+variation+and+host+interactions+of+Xenorhabdus+bovienii+SS-2004%2C+the+entomopathogenic+symbiont+of+Steinernema+jollieti+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Env.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Phenotypic variation and host interactions of Xenorhabdus bovienii SS-2004, the entomopathogenic symbiont of Steinernema jollieti nematodes.</a> Env. Microbiol. 14, 924-939 (2012).</li>
<li>Cowles, C. E., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Xenorhabdus+nematophila+nilABC+genes+confer+the+ability+of+Xenorhabdus+spp.+to+colonize+Steinernema+carpocapsae+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The Xenorhabdus nematophila nilABC genes confer the ability of Xenorhabdus spp. to colonize Steinernema carpocapsae nematodes.</a> J. Bacteriol. 190, 4121-4128 (2008).</li>
<li>Heungens, K., Cowles, C. E., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Xenorhabdus+nematophila+genes+required+for+mutualistic+colonization+of+Steinernema+carpocapsae+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Identification of Xenorhabdus nematophila genes required for mutualistic colonization of Steinernema carpocapsae nematodes.</a> Mol. Microbiol. 45, 1337-1353 (2002).</li>
<li>Goetsch, M., Owen, H., Goldman, B., Forst, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+PixA+inclusion+body+protein+of+Xenorhabdus+nematophila%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Analysis of the PixA inclusion body protein of Xenorhabdus nematophila.</a> J. Bacteriol. 188, 2706-2710 (2006).</li>
<li>Bhasin, A., Chaston, J. M., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutational+Analyses+Reveal+Overall+Topology+and+Functional+Regions+of+NilB%2C+a+Bacterial+Outer+Membrane+Protein+Required+for+Host+Association+in+a+Model+of+Animal-Microbe+Mutualism%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Mutational Analyses Reveal Overall Topology and Functional Regions of NilB, a Bacterial Outer Membrane Protein Required for Host Association in a Model of Animal-Microbe Mutualism.</a> J. Bacteriol. 194, 1763-1776 (2012).</li>
<li>Ciche, T. A., Goffredi, S. K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCiche%2C+TA+%22Methods+in+General+and+Molecular+Microbiology%22">Methods in General and Molecular Microbiology</a>. Reddy, C. A. , ASM Press. 394-419 (2007).</li>
<li>Goodrich-Blair, H., Clarke, D., Grewal, P. S., Ciche, T. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGoodrich-Blair%2C+H+%22Insect+Pathogens%2C+Molecular+Approaches+and+Techniques%22">Insect Pathogens, Molecular Approaches and Techniques</a>. Stock, S. P., Boemare, N., Vandenberg, J., Glazar, I. , CABI Publishing. 239-269 (2009).</li>
<li>Stock, S. P., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStock%2C+SP+%22Manual+of+Techniques+in+Invertebrate+Pathology%22">Manual of Techniques in Invertebrate Pathology</a>. Lacey, L. A. , Elsevier Press. 375-425 (2012).</li>
<li>Martens, E. C., Gawronski-Salerno, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenorhabdus+nematophila+requires+an+intact+iscRSUA-hscBA-fdx+locus+to+colonize+Steinernema+carpocapsae+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Xenorhabdus nematophila requires an intact iscRSUA-hscBA-fdx locus to colonize Steinernema carpocapsae nematodes.</a> J. Bacteriol. 185, 3678-3682 (2003).</li>
<li>Vivas, E. I., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenorhabdus+nematophilus+as+a+model+for+host-bacterium+interactions%3A+rpoS+is+necessary+for+mutualism+with+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Xenorhabdus nematophilus as a model for host-bacterium interactions: rpoS is necessary for mutualism with nematodes.</a> J. Bacteriol. 183, 4687-4693 (2001).</li>
<li>White, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+obtaining+infective+nematode+larvae+from+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A method for obtaining infective nematode larvae from cultures.</a> Science. 66, 302-303 (1927).</li>
<li>Ciche, T. A., Ensign, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((For+the+insect+pathogen+Photorhabdus+luminescens%2C+which+end+of+a+nematode+is+out%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">For the insect pathogen Photorhabdus luminescens, which end of a nematode is out.</a> Appl. Environ. Microbiol. 69, 1890-1897 (2003).</li>
<li>Sicard, M., Brun, N. L. e <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+native+Xenorhabdus+on+the+fitness+of+their+Steinernema+hosts%3A+contrasting+types+of+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitol.+Res%22%5BJournal%5D)">Effect of native Xenorhabdus on the fitness of their Steinernema hosts: contrasting types of interaction.</a> Parasitol. Res. 91, 520-524 (2003).</li>
<li>Lambertsen, L., Sternberg, C., Molin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mini-Tn7+transposons+for+site-specific+tagging+of+bacteria+with+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Mini-Tn7 transposons for site-specific tagging of bacteria with fluorescent proteins.</a> Environ. Microbiol. 6, 726-732 (2004).</li>
<li>Miller, W. G., Leveau, J. H., Lindow, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+gfp+and+inaZ+broad-host-range+promoter-probe+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Plant+Microbe+Int%22%5BJournal%5D)">Improved gfp and inaZ broad-host-range promoter-probe vectors.</a> Mol. Plant Microbe Int. 13, 1243-1250 (2000).</li>
<li>Teal, T. K., Lies, D. P., Wold, B. J., Newman, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiometabolic+stratification+of+Shewanella+oneidensis+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Spatiometabolic stratification of Shewanella oneidensis biofilms.</a> Appl. Environ. Microbiol. 72, 7324-7330 (2006).</li>
<li>Bao, Y., Lies, D. P., Fu, H., Roberts, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+Tn7-based+system+for+the+single-copy+insertion+of+cloned+genes+into+chromosomes+of+Gram-negative+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">An improved Tn7-based system for the single-copy insertion of cloned genes into chromosomes of Gram-negative bacteria.</a> Gene. 109, 167-168 (1991).</li>
<li>Woodring, J. L., Kaya, H. K. Steinernematid and Heterorhabditid Nematodes: A Handbook of Biology and Techniques. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWoodring%2C+JL+%22Southern+Cooperative+Series+Bulletin+331%22">Southern Cooperative Series Bulletin 331</a>. , Arkansas Agricultural Experiment Station. (1988).</li>
</ol>

特別な利害関係は宣言されません。

ここで説明されたプロトコルは、線虫ホスト（ 図1）内の細菌を光学的に検出するための方法を提供する。この方法では、線虫のホスト（ 図3）内細菌の in vivo解析に有効に、線虫の光透過性と蛍光ラベル細菌に能力を活用しています。具体的には、このアプローチは、そのホスト内細菌の局在を識別します。細菌の存在のための線虫個体数およびスコアを数えることによって、線虫の人口全体の細菌コロニー形成の頻度は（ 表1）を求めることができる。この方法では、線虫の宿主と細菌の共生生物間の相互作用を研究するために利用できる多くの潜在的な技術の一つである。関連のメソッドは、共生細菌を分離無菌的に線虫を育て、両方のパートナー25から27を操作するために以前に記載されている。 hを記述されているプロトコルEREはXenorhabdus nematophila-Steinernema carpocapsaeモデル系14</su...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント（オプション） </td></tr><tr><td>脂質寒天 （滅菌） </td><td></td><td></td><td> 8グラム栄養ブロス、15グラム寒天、5グラムの酵母エキス、890ミリリットルの水、10ミリリットル0.2グラム/ミリリットルのMgCl 2。 6H 2 0、96ミリリットルコーンシロップソリューション*、4 mlのトウモロコシ油* プレートを注ぎながら、メディアをかき混ぜる *オートクレーブ滅菌した後に成分を追加</td></tr><tr><td>コー​​ンシロップソリューション （滅菌） </td><td></td><td></td><td> 7ミリリットルコーンシロップ、89ミリリットルの水 ミックスおよびオートクレーブ</td></tr><tr><td>卵液</td><td></td><td></td><td> 16.6ミリリットル12％次亜塩素酸ナトリウム、5ミリリットル5M KOH、水80ml </td></tr><tr><td>溶原性ブロス （滅菌） </td><td></td><td></td><td> 5グラムの酵母エキス、トリプトン10グラム、5グラムの塩、1Lの水 ミックスおよびオートクレーブ</td></tr><tr><td>フュージ</td><td>フィッシャー</td><td> 13-100-675 </td><td>マイクロチューブを保持する任意の微量が動作します</td></tr><tr><td>遠心</td><td>ベックマン</td><td> 366802 </td><td> 15 ml及び50 mlコニカルチューブを保持している大規模なテーブルトップ遠心機</td></tr><tr><td>無菌の60ミリメートルX 15ミリメートルペトリ皿</td><td>フィッシャー</td><td> 0875713 </td><td></td></tr><tr><td> 50mlの遠心管</td><td>フィッシャー</td><td> 05-539-6 </td><td></td></tr><tr><td> 15 ml遠心チューブ</td><td>フィッシャー</td><td> 05-531-6 </td><td></td></tr><tr><td>無菌の100ミリメートルX 20ミリメートルペトリ皿</td><td>フィッシャー</td><td> 0875711Z </td><td>標準のペトリ皿よりも深い</td></tr><tr><td> 24ウェルプレート</td><td>グライナーバイオワン&lt;/ TD&gt; <td> 662000から06 </td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡</td><td></td><td></td><td>顕微鏡はあなたのフルオロフォアと互換性蛍光機能を使用する必要があり</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>電子顕微鏡学</td><td> 15710 </td><td></td></tr><tr><td> PBS （滅菌） </td><td></td><td></td><td> 8gのNaCl 0.2gのKCl 1.44gのNa 2 HPO 4 0.24gのKH 2 PO 4 1Lの水 7.4と水に1LのオートクレーブのpHに調整する</td></tr><tr><td>マイクロチューブ</td><td>フィッシャー</td><td> 05-408-138 </td><td> 2ミリリットルまたは1.5 mlチューブ</td></tr><tr><td>シェーカー</td><td></td><td></td><td>液体はそっと移動させる任意のシェーカーは動作します</td></tr><tr><td>ジアミノピメリン酸</td><td>シグマ</td><td&gt; D-1377 </td><td>必要に応じて、濃度または1mMにメディアを補完</td></tr></tbody></table>

蛍光顕微鏡を用いて線虫の中の細菌の可視化

Visualizing Bacteria in Nematodes using Fluorescent Microscopy

共生、二つ以上の生物の一緒に生活は、人生のすべての王国全体に蔓延している。地球上で最も普遍的な生物の2のように、線虫や細菌は、その範囲の有益な1 から 3までに病原性共生協会の広い配列を形成する。そのような関連付けはXenorhabdus細菌と共生4のモデルシステムとして浮上している線虫Steinernema間の相互に有益な関係である。Steinernema線虫、昆虫5を殺すために彼らの共生細菌を用いて、昆虫である。昆虫のホスト間で伝送するために、細菌が線虫の感染幼若期6-8の腸にコロニーを形成する。最近、いくつかの他の線虫種は昆虫の9-13を殺すためにバクテリアを利用することが示されている、との調査は、これらのシステムにおける線虫や細菌間の相互作用を検討し始めている&lt;&gt; 9（商標）。 私たちは、顕微鏡で観察したときに線虫の光透過性を生かし、線虫ホスト内または上に共生細菌を視覚化するための方法を説明します。細菌は蛍光顕微鏡によりその可視化を可能にする、蛍光タンパク質を発現するように遺伝子操作されています。多くのプラスミドは、異なる波長（ すなわち、緑色または赤色）、および受信者共生細菌へのドナー大腸菌株からのプラスミドの接合で蛍光を発するタンパク質をコードする遺伝子は、細菌の広い範囲のために成功して運ぶことが可能です。記載された方法は、Steinernema carpocapsaeとXenorhabdus nematophila 14との間の関連性を調べるために開発されました。同様のメソッドは他の線虫細菌団体9、15-18とアプローチを調査するために使用されているため、一般的に適用されます。 会ったHODは、協会と植民地化14、16、19のプロセスの本質への洞察を提供し、開発のさまざまな段階で線虫内細菌の存在および局在化の特性評価を可能にします。顕微鏡分析は、組織14、16、19から21をホストするために細菌の人口とローカライゼーション内で両方の植民地化の頻度を明らかにする。これは、植民地化の平均的なレベルを提供することができる超音波処理22または23を研削などの線虫個体群内の監視、細菌の他の方法よりも優れていますが、例えば、との集団から低いシンビオント負荷頻度の高い集団を差別しないことがあります高シンビオント負荷の低周波。植民地化の表現型21のための細菌変異株をスクリーニングまたは特性評価する場合、周波数と植民地化細菌の負荷を判別することは、特に重要になることがあります、24。確かに、蛍光顕微鏡を植民地化17、18の欠陥のための細菌の変異体のハイスループットスクリーニングに使用され、超音波処理22、25から27と個々の線虫郭28、29を含む他の方法よりも少ない労力であるされています。

間の共生を研究するために、<em&gt; Xenorhabdus</em&gt;細菌や<em&gt; Steine​​rnema</em&gt;線虫、これらの方法は、線虫内細菌の存在と位置を監視するために開発されました。他のシステムに適用することができる実験的なアプローチは、エンジニアリング細菌が透明な線虫の中に蛍光顕微鏡細菌を用いて、緑色蛍光タンパク質と可視化を表現するために必然的に伴う。

共生（2種類以上の生物が共に生活すること）は、生命のあらゆる界に広く浸透しています。地球上で最も普遍的な生物の2つである……

この手順の全体的な目的は、線虫宿主内における蛍光標識された細菌の共生状態を観察することです。まず、コンジュゲーションを通じて細菌を蛍光タンパク質で標識します。次に、卵を回収してAIC線虫を単離します。次に、AIC線虫を蛍光標識した共生細菌とともに培養し、自然な共生関係を形成させ、最終的に線虫宿主内での共生細菌の局在を可能にします。そして、線虫集団におけるこの共生関係の頻度を蛍光顕微鏡によって決定できます。この手法は、細菌が宿主内のどこに局在するのか、また宿主集団における細菌保有の分布はどうなっているのかなど、共生分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。細菌株を一夜培養した後、ドナー株、レシピエント株、およびヘルパー株を、抗生物質を含まない栄養豊富な増殖培地に、菌液と培地の比率が1:100となるように継代し、各菌株に適した温度で対数増殖期の中期に達するまで培養します。次に、これらの菌株を1本のマイクロ遠心チューブにまとめ、17,900 Gで2分間遠心分離します。上清をデカンテーションで除き、沈殿物を30 µLの新鮮な培地で再懸濁します。その後、この懸濁液を抗生物質を含まない栄養豊富な培地プレート上にスポットし、懸濁液を乾燥させます。プレートを逆さまにし、受容菌にとって最適であり、かつ（該当する場合は）供与菌およびヘルパー菌にとっても許容可能な温度で一晩インキュベートします。次に、スポット部分を掻き取り、選択的抗生物質プレート上で単一コロニーが得られるようにストリークし、細菌の純粋培養株を回収するための単一コロニーを分離します。最後に、得られたコロニーが供与株ではなく、受容共生菌であることを確認してください。受容体特異的な表現型の有無をスクリーニングすることで判定します。例えば、触媒試験を行うことでcino abdi細菌とe coliを区別でき、また、蛍光プラスミドタンパク質に対応する波長で蛍光を確認することで、プラスミドの存在をスクリーニングできます。天然の細菌共生体を一晩培養した後、細菌培養液600 µLを8〜10枚の10 mm脂質アガープレートに塗布し、プレートを暗所で湿気を避けて25 °Cでインキュベートします。2日後、500 µLの培地に懸濁した5,000匹の感染期幼虫線虫を細菌ローンに加えます。プレートを25 °Cでさらに3日間インキュベートした後、顕微鏡スライドガラス上に20 µLの水を滴下します。次に、滅菌スティックを用いて細菌ローンから少量の線虫を掻き取ります。スティックを水に入れ、線虫を泳ぎ出させます。このスライドを低倍率で観察してください。卵と雌が確認でき、かつ雌が卵を保持している場合は、プレートの表面に数mLの水を加え、プレートを静かに回した後、その水を50mLコニカルチューブに注いでください。線虫がプレートから剥離し、プレート表面に見えなくなっていることを確認してください。線虫をチューブの底に沈殿させた後、チューブ上部の余分な水をピペットで除き、きれいな水で満たします。成虫の線虫を再び沈殿させ、もう一度余分な水をピペットで除いた後、コニカルチューブに卵溶液を満たします。次に、チューブを室温で正確に10分間、緩やかに転倒混和します。混和後、直ちに遠心管を室温、1, 250 Gsで正確に10分間、ブレーキをかけた状態で遠心分離します。その後、速やかに上清をデカントし、ピペッティングによりペレットを卵溶液で再懸濁させ、遠心管に新鮮な卵溶液を満たします。チューブを3〜5回反転させて卵懸濁液を十分に混合し、直ちに卵をペレット化して、示した通りに上澄みをデカントします。ピペッティングによってペレットをmisogynyブロスまたはLBで再懸濁し、卵懸濁液を15 mLコニカルチューブに移します。次に、15 mLチューブにLBを満たし、先ほど実演した迅速な手順と同様の手法で、ブロス中で卵を3回洗浄します。その後、再懸濁したP nematode卵を、少なくとも10 eggs/µLになるよう希釈します。卵を、5 mLのLBおよび定着細菌に対する抗生物質を含む6 cmのペトリ皿に移します。プレートは、一晩の培養と蛍光細菌の選別後、パラフィルムで包んで最大4日間保存することが可能です。滅菌したスティックを用いて、600 µLの細菌培養液を10 mmの脂質アガーに塗布し、25 °Cで培養します。2日後、各脂質プレートに500から5,000個の線虫卵を分注します。プレートを保存していた場合は、あらかじめ準備した細菌ローンに卵を接種する前に、先ほど示した方法で15 millilitersのLBで卵を少なくとも1回洗浄してください。その後、線虫と細菌の共培養物を、プレートの縁に感染幼虫が白い綿状のリングとして現れるまで、25 degrees Celsiusの暗所かつ低湿度条件下でインキュベートします。感染期幼虫が観察されたら、脂質アガープレートの蓋を取り外し、プレートの底面を空の100 mm × 20 mmペトリ皿の底に置きます。次に、ペトリ皿に、小さい方のプレートの高さの約半分まで届く量の水を満たし、次世代の感染期幼虫が水中に現れるまでウォータートラップで培養します。水中から、あるいは適切な細菌ローンから目的のライフステージの線虫を回収した後、少量のoleを30 µLの水に溶解し、線虫サンプル50 µLあたり1～2 µLのこの麻酔剤を加えます。次に、麻酔状態の線虫サンプルを約20～30 µL顕微鏡スライドに転移させ、サンプルの上にカバーガラスを載せます。光学顕微鏡を用いて線虫を観察し、視野内に線虫が存在することを確認してください。細菌の局在を確認するため、明視野顕微鏡設定に加えて蛍光顕微鏡で線虫を撮影し、その後、画像を重ね合わせます。細菌を特定するために、線虫の倍率や視野を数回変更して試みる必要がある場合があります。2種類の培地で飼育した線虫の個体数をカウントし、細菌共生体の定着状況をスコアリングしました。統計的な信頼性を確保するためには、表に示すように、1サンプルあたり少なくとも100匹の線虫をカウントし、各カテゴリーに少なくとも30匹が該当することが望ましいです。これらの線虫の定着率は、脂質アガーで飼育した場合は約14.6％、肝臓・腎臓アガーで飼育した場合は68.6％でした。他の線虫および細菌種では、定着レベルが異なることが示されています。この図式は、Steiner NEMA雌の一般的な外見を示しています。挿入図は、20倍の倍率で撮影したS fot graphic雌の微分干渉像です。挿入図の黒い矢印は陰門を、白い矢印は視認できる卵を示しています。この画像は、発生しているがまだ孵化していない 40倍 拡大の線虫の卵を示しており、これらの Volta 線虫から単離された卵は 10倍 拡大で撮影されました。ここでは、Xeno aptus 細菌に関連する Steiner Nima 線虫の代表的な顕微鏡画像が、この最初の画像に示されています。この合成画像を作成するために、Alvinの線虫とその共生細菌（GFPを発現）を組み合わせました。位相差像に蛍光像を重ね合わせています。矢印は、感染幼若線虫内に存在する細菌を示しています。この画像は、X nlaを発現するGFP標識されたS carpa capsiの幼若線虫を示しています。この画像は前述の画像と同様の手法で作成されており、線虫の腸管腔全体に局在する緑色の桿状の構造として可視化された、緑色蛍光タンパク質で標識された細菌を伴う幼若線虫を描写しています。上述の手順に加えて、ホストと微生物の共生に必要な分子メカニズムは何かといった追加の疑問を解決するために、線虫ホストとの共生前に細菌共生体を遺伝的に操作するなどの他の手法を取り入れることも可能です。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

我々は、ライブでキューティクルを可視化する手法を提案...

の可視化線虫（Caenorhabditis elegans）</em親油性生体染色色素、DIIを使用する>キューティクルの構造

出典: Chetrit, D., 他レジ オネラ肺炎菌 のDOT/ICM分泌系の時空間的特徴を解明するために、ライブセルイメージングおよびクライオ電子断層撮影を応用すること。 J. Vis.

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蛍光顕微鏡を用いて線虫の中の細菌の可視化

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