蛍光顕微鏡を用いて線虫の中の細菌の可視化

この手順の全体的な目標は、線虫宿主内の蛍光標識細菌の共生を観察することです。これは、まず結合によって蛍光タンパク質で細菌を標識することによって達成されます。第2のステップは、卵を採取してAIC線虫を単離することです。

次に、AIC線虫を、蛍光標識された細菌共生体と組み合わせて増殖させ、最終的に線虫宿主内の細菌共生体の局在を自然に関連させることを可能にする。そして、線虫集団内のこの関連性の頻度は、蛍光顕微鏡法によって決定することができる。この方法は、細菌が宿主内のどこに局在するのか、宿主集団全体での細菌の輸送の分布はどうなっているのかなど、共生分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。

細菌株を一晩で増殖させた後、継代培養、ドナーレシピエントおよびヘルパー株を抗生物質を欠く栄養豊富な増殖培地に培養液と培地の1対100の比率で作製し、その後、各菌株に適した温度で培養物を中対数成長に達するまで増殖させます。次に、菌株を1本のマイクロ遠心チューブに混合し、混合培養物を2分間遠心分離します 17,900Gsで、上清をデカントし、30マイクロリットルの新鮮な培地にペレットを散布します。次に、抗生物質を含まない栄養豊富な培地プレートに懸濁液を見つけ、懸濁液が乾いたらスポットを乾燥させます。

プレートを反転させて一晩、レシピエント細菌に最適で、ドナーとヘルパーが許容できる温度でインキュベートします。次に、選択的な抗生物質プレート上の単一のコロニーのスポットとストリークをこすり落とし、細菌ストリークの純粋な培養、つまり単離のための単一コロニーを取得します。最後に、結果として得られるコロニーがレシピエントの共生体であり、ドナー株ではないことを確認します。

レシピエント固有の表現型の存在をスクリーニングすることにより。例えば、cino abdi細菌は、蛍光プラスミドタンパク質に対応する波長下で蛍光を確認することにより、プラスミドの存在をスクリーニングした触媒試験を行うことにより、大腸菌と区別することができる。天然の細菌共生体を一晩で成長させた後、600マイクロリットルの細菌培養物を8〜10、10ミリメートルの脂質曝気液に広げ、次いで25°Cの湿気のない暗闇でプレートをインキュベートします。

2日後、500マイクロリットルの培地に5, 000匹の感染性幼若線虫を細菌の芝生に加えます。プレートを摂氏25度でさらに3日間インキュベートした後、20マイクロリットルの水を顕微鏡スライドに置きます。次に、滅菌スティックを使用して、バクテリアの芝生から少量の線虫をこすり落とします。

線虫が泳ぎ去るのを待つために、棒を水の中に置きます。このスライドを低倍率で見てください。卵と雌が見える場合は、雌が卵を含んでいるときに続け、プレートの表面に数ミリリットルの水を置き、プレートを静かに渦巻いてから、50ミリリットルの円錐形のチューブに水を注ぎます。

線虫はプレートから外れ、プレート表面に見えなくなるはずです。線虫がチューブの底に落ち着くのを待ってから、チューブの上部から余分な水をパイプでつなぎ、チューブにきれいな水を補充します。成虫の線虫が落ち着くのを待ってから、余分な水分をもう一度ピペッティングで取り除いた後、円錐形のチューブに卵液を入れます。

次に、チューブを穏やかに反転させて室温で正確に10分間混合します。振とうした後、すぐに円錐管を1,250Gsで正確に10分間遠心分離し、休憩を入れます。次に、上清をすばやくデカントし、ピペッティングでペレットを卵溶液に再懸濁し、円錐管に新鮮な卵溶液を入れます。

チューブを3〜5回反転させて卵懸濁液をよく混ぜ、次にすぐに卵をペレット化し、示したように上清をデカントします。ピペッティングにより、ペレットをミソジニー、ブロス、またはLBに再懸濁し、次に卵懸濁液を15ミリリットルの円錐管に移します。次に、15ミリリットルのチューブにlbを充填し、今示したのと同じラピッドステップ技術を使用して卵をブロスで3回洗浄し、次に再懸濁したP線虫の卵をマイクロリットルあたり少なくとも10個の卵に希釈します。

卵を5ミリリットルのLBとコロニー形成細菌に対する抗生物質が入った6センチメートルのシャーレに移します。プレートは、蛍光菌の一晩の成長と選択後、最大4日間パーフィルに包まれて保存できます。滅菌スティックを使用して、600マイクロリットルの細菌培養物を10ミリメートルの脂質曝気液に広げ、培養物を摂氏25度でインキュベートします。

2日後、各脂質プレートに500〜5, 000の線虫卵を分配します。プレートが保管されている場合は、以前に準備した細菌の芝生に卵を接種する前に、少なくとも1回示したように、15ミリリットルのLBで卵を洗います。次に、線虫菌を暗所で水分なしで摂氏25度でインキュベートし、感染性の幼体がプレートの端にぼやけた白いリングとして現れるまで

感染性の幼若体が観察された場合。脂質寒天プレートの蓋を取り外し、プレートの底を空の100mm×20mmのシャーレの底に置きます。次に、ペトリ皿に小さな皿の約半分の高さまで十分な水を入れ、子孫の感染性の幼体が水に現れるまでウォータートラップをインキュベー

水から線虫を採取した後、または適切な細菌の芝生から所望のライフステージで、数粒のoleを30マイクロリットルの水に溶解し、線虫サンプルの50マイクロリットルごとにこの麻痺剤の1〜2マイクロリットルで溶解します。次に、麻痺した線虫サンプルの約20〜30マイクロリットルを顕微鏡スライドに移し、サンプルの上にカバースリップを置きます。光学顕微鏡を使用して線虫を観察し、線虫が視野内にあることを確認します。

細菌の局在を特定するため。光顕微鏡の設定に加えて、蛍光顕微鏡下で線虫を撮影し、画像を重ね合わせます。バクテリアを見つけるために、線虫のいくつかの倍率とビューを試す必要があるかもしれません。

2つの培地からの線虫の集団をカウントし、細菌共生体によるコロニー形成についてスコアリングしました。堅牢な統計のためには、サンプルごとに少なくとも100個の線虫を数え、表に示されているように少なくとも30個が各カテゴリに分類されるのが最善です。これらの線虫は、脂質寒天培地で増殖させると約14.6%、肝臓、腎臓寒天培地で増殖させると約68.6%のレベルでコロニーを形成します。

他の線虫および細菌種は、コロニー形成のレベルが異なることが示されています。この概略図は、Steiner NEMAの女性の一般的な外観を示しています。挿入図は、S fot グラフィック メスの 20 倍倍の拡大率での微分干渉コントラスト画像を示しています。

挿入図の黒い矢印は外陰部を示し、白い矢印は目に見える卵子を示しています。この画像は、40倍の拡大で発達したが孵化していないボルトセンチュウの卵を示しており、ボルタ線虫から単離されたこれらの卵を10倍の倍率で画像化した。ここでは、Xeno aptus細菌に関連するSteiner Nima線虫の代表的な顕微鏡画像をこの最初の画像に示します。

アルビンの線虫は、この合成画像を作成するためにGFPを発現する細菌共生剤の博覧会に関連付けられていました。位相差画像に蛍光画像を重ね合わせました。矢印は、感染性の幼若性線虫内に存在する細菌を示しています。

この画像は、X nlaを発現するGFPを持つSカルパカプシの幼体線虫を示しています。この画像は、前の画像と同様の方法で構築され、緑色の蛍光タンパク質標識細菌が線虫の腸管腔全体に局在する緑色の桿体として視覚化された緑色の蛍光タンパク質を有する幼若線虫を描いています。記載された手順に加えて、線虫宿主との会合に先立つ細菌共生体の遺伝子操作のような他の方法を組み込んで、宿主微生物の会合に必要な分子メカニズムは何かなどの追加の質問に答えることができる。