Name: エレクトロポ生きた微生物で内在化および蛍光生体分子の観測 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 27 s
Description: 学ぶエレクトロポレーションを用いて蛍光標識したDNAやタンパク質などの生体分子を生きた微生物に導入し、蛍光顕微鏡で観察する方法です。細胞内での生体分子の動態と局在を長時間追跡できます。

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議論してくれたStephan Uphoffに感謝します。 
R.C. は、オックスフォード大学のリナカー・カレッジの支援を受けました。A.P. は、ドイツ学術交流会 (DAAD)、ドイツ国立学術財団、EPSRC の支援を受けました。MS は、ウェルカム・トラストの支援を受けました。A.N.K. は、英国の BBSRC 助成金 (BB/H01795X/1) と、欧州研究会議スターター助成金 (261227) の支援を受けました。

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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

多くのパラメータは、細胞のエレクトロポレーションおよび対象の生物学的システムと実験（細胞レベルまたは単一分子分析）の正確な性質に応じて、データ取得中に変化させることができる。細菌にDNAをエレクトロポレーションする際に、例えば、標識されたdsDNAフラグメントの0.25〜5ピコモル（事前に光退色を必要とすることなく、 すなわち 、）直接の単一分子の検出を可能にする、低い内在化効率をもたらす。 5 pmolのdsDNAの上方には、細胞は、単一細胞分析のための体制が適し、高負荷になる傾向がある。すべての標識されたDNAはまた、DNAのストック溶液から遊離染料（未反応のフルオロフォア）の痕跡を除去するために、先にゲル精製しなければならない。また、特にsmFRET実験のためのDNAの分解、潜在的な問題は、非天然の核酸、またはそのようなヘアピンループとしてエキソヌクレアーゼアクセス可能な末端を保護するモチーフがDNAを使用することによって対処することができる。 もうadjustablエレクトロポレーションの電子パラメータは、エレクトロポレーションの際に印加される電界強度である。低い電界強度（〜1kVの/ cm）は、単分子研究のための適切な低充填効率につながる。 （1.8 kVの/センチまで）より高い電界強度が積載効率を増加させる。しかしながら、エレクトロポレーション後の電界強度と細胞生存率との間に逆相関がある（ 図4参照）。参考のために、細菌および酵母エレクトロポレーションのために使用される通常の電界強度は〜1.5 kVの/ cmである。時定数は、すぐに任意のアーキング現象がキュベットで起こるように低下​​するので、この減衰の長さを表す時定数は、追従するための便利なパラメータである。通常の設定の下では、時定数は4ミリ秒以上でなければなりません。低い値は、低い積載効率あるいは非ロードされた損傷を受けた細胞につながる。ほとんどのエレ​​クトロポレーターは、両方の曲に変更することができる（例えば、「パルス切り捨て」または「パルス状」のような）他の自​​由度を提供セル·ローディングおよび生存。私たちは、その膜は（単一脂質二重層）は実際それほど複雑ではないので同じような手順では、また、適切なエレクトロの設定を用いて哺乳動物細胞への標識生体分子の内在化を可能にするはずである、細菌や酵母の両方にこの方法を適用し、エレクトロポレーションは、すでにこのような細胞で使用されているため21。 標識されたタンパク質を内在化すると、すべての遊離の色素は、標識されたタンパク質のストック溶液エレクトロポレーションの前に除去する必要がある。遊離色素分子は、それらの小さいサイズに、目的のタンパク質よりも優先的に内在化し、（それらの予想より速い拡散にもかかわらず）は、データ分析の間を区別するのが困難であることができる。有機的に標識されたタンパク質のサンプルのためのガイドは、エレクトロポレーションのために適切であるとして、遊離色素の残存量が2％未満であるべきである22（SDS-PAGEの蛍光スキャニングを用いて検出）。このプロセスは、特に重要であるいくつかの分子は、エレクトロポレーション、細菌や酵母の外膜に付着することがありますように。この点において、陰性対照試料は、（任意の蛍光標識された生体分子と共にインキュベートもエレクトロポレーションされていない細胞、 図2）は、空のセルの自己蛍光のレベルとして、理想的な低エレクトロポレーションした細胞よりも明らかに低い細胞当たりの蛍光強度を表示すべきである。 二本鎖DNAの場合と同様に、標識されたタンパク質の内在化効率は、エレクトロポレーションの前に細胞に加え、生体分子の量にリンクされる。しかしながら、そのような大きさおよび電荷などの他のパラメータは、内在化において役割を果たす。小さ ​​なタンパク質は、（kDaの98まで）より大きなタンパク質に対して、高い内部移行効率を示す成功し、より低い効率（ 図5）26と内部移行することができる。タンパク質の等電点、細胞膜との相互作用の可能性、また、他の物理化学的パラメータエレクトロポレーション時の影響セル·ローディング。その結果、ユーザーは標識タンパク質（&gt;50μM）の高い初期濃度が成功ロードするための最善の機会を与えることを知って、自分のシステムのための実験を​​最適化する必要があります。エレクトロポレーションも細胞（ラベルまたは非標識のいずれか）に、タンパク質および他の生体分子を導入することにより、細胞機能を撹乱し、分析するための新しいツールを提供しています。存在するT7 RNAポリメラーゼの実験（ 図5C）、我々は電気穿孔法を用いてインビボで遺伝子発現を変更することができる生体分子を導入することができ、実験のような例。 単一分子蛍光実験を行う際には、カバースリップの表面（〜100nm）を上記の薄切片内の励磁のみフルオロフォアで最高の信号対雑音比を提供するように、TIR照明は、通常、他の照明モードよりも好まれる。しかし生きた微生物の中に拡散イメージングラベル生体分子が再かもしれない（ 大腸菌用0.8ミクロンまで）帖より深い照明。高い信号対雑音比を維持しながら、より深い照明は、HILOモードで達成される。一方、広視野画像は、ユーザが高いレーザパワー全体ロードされたセルを光退色し、生産ユニタリ強度によって初期細胞の蛍光強度を割ることによって内在化される分子の数を推定された段階的な光退色の分析のために特に重要である単一分子（単一光漂白工程と、 図3）による。それらの軌道がセル全体の体積をカバーする場合でも、広視野イメージングは​​また、関心のある拡散分子を局在化するために、長期的な分子の追跡に必要とされる。 このプロトコルでは、エレクトロポレーション、細胞内で核酸を送達するための生物学者や生化学者のための標準的な技術は、種々の細胞型蛍光生体分子を送達するための簡単​​な方法を構成する方法を提示する。目小説、ハイスループット技術は、それらのネイティブ環境で標識された分子を観察するユニークなツールを提供しています。広い波長範囲をカバーするフルオロフォアで標識された生体分子の付加では、エレクトロポレーションは、非天然のヌクレオチドおよびアミノ酸、金属キレート剤、架橋剤、及びケージング基のような多くの化学基で修飾された分子を送達することができる。対象の生物学的システムは、細胞の発達に必須ではない場合には内在化後に観察されたタンパク質は、細胞内タンパク質プールのすべて（またはほとんど）を表すことを保証する、標的タンパク質をコードする遺伝子はまた、削除することができる（またはノックダウン） 。本質的には、エレクトロポレーションは、「移植」生きている細胞へのin vitroでのバイオコンジュゲートの柔軟性、したがって、合成生物学、システム生物学の取り組み、および生体内の単一分子検出に利益をもたらすことができます。

生きた細胞内部の大部分の蛍光の研究では、GFP 1などの蛍光タンパク質（FPS）、とのタンパク質融合に依存します。これらの蛍光タグは、遺伝子発現または膜輸送2-7のようなプロセスに関与するタンパク質のコピー数、拡散パターンまたは局在化の研究を可能にする。 FPSが高いラベリング特異性、容易な実装を提供し、様々な光物理的および化学的性質1を有する変異体の大規模な在庫でご利用いただけます。しかし、有機蛍光色素分子は、in vitroで彼らの大きな光安定性のための実験（最大のFPよりも安定100倍）8,9、小さいサイズ（最大のFPよりも小さなボリュームを100倍）と分子内ラベリングを容易にするために主要な選択肢のまま（主にシステイン残基の使用による）。これらの要因はすべて、単一分子蛍光のために特に重要であり、FRETが10を検討する 。 いくつかの内部移行方法のCOMBIN有機標識およびin vivo検出に有利で ​​るが過去10年間に導入されている。しかしながら、このような方法は、非天然アミノ酸15の使用を必要とするか、 例えば、（大きな単一膜の真核細胞に限定され、比較的大きなポリペプチドタグ（ 例えば 、TMP、HALO、または20kDaのSNAPタグ）11-14を使用するいずれか。 、ロード、注射器のロード、マイクロインジェクション）16-19をこすり。 このプロトコルは、新規な、 インビボでの観察と結合する有機蛍光体の長所を簡単かつ高スループットの内在化方法を記載している。この技術を開発するために、我々は、Eのように、一般に微生物をロードするために、プラスミドDNA 20,21を用いて細胞を形質転換するために使用されるエレクトロポレーションの手順を適合さcoliまたはS.有機的にラベル生体分子と出芽酵母 。プロトコルは4簡単な手順で構成されています。ラベルの生体分子と細胞のインキュベーション、エレクトロポレーション、細胞の回収、および細胞洗浄は、非内在化生体分子を除去する。ここで、我々は、細胞ベースの単一分子蛍光を研究するために、このエレクトロポレーションプロトコル、ならびに細胞イメージングおよびデータ分析プロセスを提示し、信号をFRET。 エレクトロポレーションは、生体分子（ 図1）20,21細胞に進入できるような一過性の膜孔を形成するために低イオン強度細胞懸濁液を横切って高電圧電場を放電に依存している。ただ、プラスミドDNAと細菌または酵母の形質転換と同様に、細胞は、それらのelectrocompetencyを確実にするために電気穿孔する前に用意しなければならない。この手順は、水で数回の洗浄工程からなる、膜透過性を増加させ、エレクトロポレーションキュベット中でのアーク放電を回避するために、細胞溶液のイオン強度を低下させる。このプロトコルでは、細胞は、（PROTOCOL参照：1.1）を下記のように調製することができるか、商業プロバイダから購入S。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52208/52208fig1.jpg"> 図1：内在化プロトコルの概略図左から右へ：エレクトロコンピテント細胞（二重に標識されたDNA断片と、この例では、細菌）のアリコートに標識された生体分子の数マイクロリットルを加える。氷上で1から10分間インキュベートし、予め冷却したエレクトロポレーションキュベットに移す。エレクトロポレーションし、すぐ後に、細胞に0.5〜1ミリリットル豊富な培地を追加します。細胞が回復させるために37℃（または生物によって必要な温度、 例えば、酵母のための29℃）でインキュベート。余分な非内部化標識分子を除去するための5回の洗浄工程を行う。 PBS緩衝液およびピペットアガロースパッド上に10μlの100〜200μlの最終ペレットを再懸濁。 （広視野モードまたはHILOモード）蛍光顕微鏡での清掃カバーガラスと画像とのパッドをカバーしています。 図1）を洗浄する前に、リカバリを可能にする富栄養培地中でインキュベートする。非内在化標識生体分子の過剰な第1の塩のかなり高い濃度といくつかの界面活性剤を含有する緩衝液中で洗浄することにより除去される（3.3 PROTOCOL参照 ）。塩の存在は、そうでなければ、外膜に付着も非内部化ラベル生体分子によって形成され、非特異的な静電相互作用を破壊。同様に、洗浄緩衝液中の界面活性剤の存在は、非特異的疎水性相互作用を破壊する。 DNAの内在化は、（ 図2）簡単ですがエレクトロポレーションを用いて標識されたタンパク質を内部移行する際、予防措置が取られる必要がある。まず、有機的に標識されたタンパク質のストック·サンプルは、まだ遊離色素の小さな割合が含まれる場合があります。遊離色素分子は、タンパク質よりもはるかに小さいので、優先的に内在化されるかもしれない。観察に内在蛍光分子の大部分は、目的のタンパク質に対応するように、初期のタンパク質試料は、〜2％遊離色素（ 図5）22未満含まれている必要があります。非内在化さ標識タンパク質の過剰もエレクトロポレーション後、外側細胞膜に固執することができます。この現象は、タンパク質特異的であり、それぞれの新しいタンパク質をチェックする必要がある。我々は（：3.3.3プロトコルを参照してください）ロードされた細胞試料からの非内部化タンパク質の除去を可能にするいくつかのオプションを提案する。 最後に、細胞をリン酸緩衝液を少量に再懸濁し、蛍光顕微鏡でその画像化を可能にする、アガロースのパッド上にピペット。アガロースパッド上固定化は、SIMPLですEとそれらの完全性を損​​なうことなく、カバースリップ上の細胞を画像化する効率的な方法。パッドは、低蛍光培地が含まれている必要があります。 細胞イメージングを行うことができるいずれかの広視野、全内部反射蛍光（TIRF）またはHILO（高傾斜及び積層光学シート）を使用して顕微鏡検査。 HILO構成では、レーザビームは、TIRFよりも試料に深く浸透し、まだ大きな信号対雑音比23を可能にする、広視野用として試料全体を点灯しない。使用されるレーザパワーと時間分解能に応じて、内在化生体分子は、（段階的に、光退色分析を用いて、 図3）をカウント局在化、または24-28を追跡することができる。フルオロフォアのFRET対で二重に標識された構築物の内在化は、単一細胞または単一分子レベル（ 図6）でのFRETの両方の定量化を可能にする。 異なるパラメータを変化させることができる所望の出力に応じて、及び生物学的システムを研究。まず、細胞当たりの内在化材料の量は、標識された生体分子の濃度を変えることによって調整することができるエレクトロポレーションの前（ 図2）を細胞に添加した。エレクトロポレーションの電界強度も荷重効率および細胞生存率の両方に影響する。予想されるように、増加する電界強度と積載効率が増加しながら、エレクトロポレーションした細胞の生存率は、（ 図4A）を減少させる。両方のパラメータは、エレクトロポレーションの後にロードされ、分裂細胞​​の割合を記録することによって定量することができる。蛍光イメージングと相まって、この生存率アッセイはまた、 生きた細胞内に内在化生体分子の観察を検証し、数世代（ 図4B）にわたって連続観測を可能にします。 要約すると、このプロトコルは、に蛍光標識DNAおよびタンパク質分子の内在化を可能にする大腸菌またはS. cerevisiaeの 26。有機フルオロフォアで標識された個々の分子は、一桁長い時間スケールのためのFPよりも高い時空間解像度で追跡することができる。最後に、この方法は、広視野、TIRFおよび共焦点検出、ならびにALEX（レーザー励起28,29を交互に）としてパルス励起スキームと互換性がある。

<table><tbody><tr><td>ElectroMax DH5-α Comptent細胞</td>、<td>Invitrogen</td><td>11319-019</td><td>、またはその他の市販または実験室の電気能動菌、または酵母。</td></tr><tr><td>EZ Rich Defined Madia</td><td>Teknova</td><td>M2105</td><td>低蛍光リッチメディア</td></tr><tr><td>MicroPulser エレクトロポレーション装置&nbsp;</td><td>Biorad</td><td>165-2100</td><td>または微生物の形質転換のための任意の古典的なエレクトロポレーター</td></tr><tr><td>認定分子生物学アガロース</td> アガロースパッド用<td>Biorad</td><td>161-3100</td>低<td>蛍光アガロー</td></tr>ス <tr><td>顕微鏡カバースリップ No 1.5 厚さ</td><td>Menzel</td><td>BB024060SC</td> 炉<td>内のスライドを500°Cで加熱することにより、背景粒子を除去します。C for 1h</td></tr><tr><td>単一分子蛍光顕微鏡</td><td>REFsで説明された</td><td>自作</td><td></td></tr><tr><td>ローカリゼーションソフトウェア ローカリ</td>ゼーション解析に適合させる<td>ことができる、カスタムメイドのオンライン</td><td></td><td>MATLABおよびC++ソフトウェアパッケージ。&nbsp;</td></tr><tr><td>追跡ソフトウェア</td><td>:</td><td>BlairとDufresneによるオンラインMATLAB実装が利用可能。&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

エレクトロポ生きた微生物で内在化および蛍光生体分子の観測

Internalization and Observation of Fluorescent Biomolecules in Living Microorganisms via Electroporation

生体内で生体分子を研究する能力は、生物学的な文脈でそれらの機能を理解するために非常に重要です。強力なアプローチの1つは、目的の分子をGFPなどの蛍光タンパク質に融合させて、その発現、局在、および機能を研究することです。しかし、GFPとその誘導体は、in vitro実験に一般的に使用される有機蛍光色素よりも大幅に大きく、光安定性が低いため、研究範囲が制限される可能性があります。
私たちは最近、エレクトロポレーションに基づく簡単で汎用性の高いハイスループットの方法を導入し、有機蛍光色素で標識された生体分子を生きた微生物に内部化することを可能にします。ここでは、エレクトロポレーションを使用して標識されたDNA断片またはタンパク質を大腸菌および出芽酵母に内在化する方法、蛍光顕微鏡を使用して内在化分子の数を定量する方法、およびエレクトロポレーション細胞の生存率を定量する方法について説明します。データは、蛍光またはFRETを使用して、単一細胞レベルまたは単一分子レベルで取得できます。また、生体内で生理学的に観察可能な応答を引き起こす非標識分子を内在化する可能性も提示されます。最後に、特定の生物学的システムに対するプロトコルの最適化の戦略について説明します。

生体内の生体分子の研究は、生物学的な文脈における分子機能を理解するために非常に重要です。ここでは、DNAやタンパク質などの蛍光生体分子を生きた微生物に取り込むことができる新しい方法について説明します。蛍光顕微鏡で記録されたin vivoデータの解析についても紹介し、議論します。

The ability to study biomolecules in vivo is crucial for understanding their function in a biological context. One powerful approach involves fusing ...

この手順の目標は、エレクトロポレーションに基づく方法を使用して、有機フッ素で標識されたDNAやタンパク質などの生体分子を生きた微生物内に内在化し、視覚化することです。これは、まずエレクトロコンピテントセルを蛍光標識生体分子とインキュベートしてから、エレクトロポレーションベテインに移すことで達成されます。vete全体に高電圧を印加することにより、細胞壁と細胞膜の両方に一時的な細孔が形成され、細胞への生体分子の拡散が可能になります。次に、細胞を濃縮培地でインキュベートして、過剰な非内在化生体分子が除去される前に細胞を回復させます。最後に、細胞を低蛍光の最小限の栄養物発生パッドに移し、次にガラスカバースリップを上に重ねてガラスアグロサンドイッチを形成します。最終的に、本質顕微鏡法を使用して、生細胞内の標識生体分子の位置、拡散パターン、および動的特性を分析します。この手法のアイデアを思いついたのは、生細胞イメージングの限界に気づいたときでした。GFPなどの光蛍光タンパク質は急速にグリッチが発生するため、有機フルオロフォースで標識された生体分子を生細胞にロードすることで、生きた微生物に移植できると考えました。この力の主な利点は、明るさ、写真の安定性、および小さいサイズです。次に、DNAまたはタンパク質の天然環境での局在化と拡散をはるかに長い時間スケールで追跡することを望んでいますが、これは多くの重要な生物学的プロセスと一致します。これらの技術がマイクロインジェクションなどの既存の方法よりも優れている点は、一般的なマイクロインジェクション針の直径よりも小さい微生物にも適用できることです。エレクトロポレーションのさらなる利点は、多数の細胞に蛍光生体分子を同時にロードし、それらを並行して視覚化できることであり、エレクトロポレーションは特にアイスループット技術です。この方法は、インビボで蛍光標識された生体分子の拡散および動態挙動に関する洞察を提供することができるが、標識されていない電極生体分子などの他の状況にも適用することができるが、例えば、細胞によって内在化されたときに生理学的応答を引き起こすことができる細菌または酵母蛍光顕微鏡用のアロスパッドを構築するために、いくつかの2つの低蛍光培地を準備することから始め、 次に、2%アロスの溶液を蒸留水ですぐにラボ用電子レンジで溶かします。ホットHAローズの1つの一致するボリュームをメディアに加え、混合物を静かに上下にピペットで動かします。気泡の形成を避けて、すぐに約200マイクロリットルの発生した混合物を標準サイズの顕微鏡カバースリップにピペットで移します。カバースリップを室温で1分間ベンチに置いておくか、ゲルが固まるまで、または一時的に保管し、新しいパッドの上に2番目の洗浄したカバースリップを置き、エッグローズの上部からエッグローズのフラスに静かに圧力をかけます。最大5マイクロリットルの生体分子を、20マイクロリットルの適格な細菌のアリコート、または50マイクロリットルの適格な酵母細胞に移します。細胞とインキュベートされる蛍光生体分子の量は、細胞ごとに取り込まれる生体分子の量と直接相関します。エレクトロポレーション後、混合物を氷上で最大10分間インキュベートします。同時に、適切な電極間隔のエレクトロポレーションベテを選択し、氷上で冷却します。細胞混合物を予め冷却した獣医に移します。獣医を数回軽くたたいて、溶液から泡を取り除きます。ペーパータオルで獣医から水分を取り除き、獣医を電気装置に入れます。このプロセスの直後にセルに高電圧パルスを印加します。エレクトロ エータに表示される時定数が 4 ミリ秒から 6 ミリ秒の間であることを確認します。時定数が低いのは、多くの場合、qve内に過剰な塩分または気泡が存在するためであり、細胞への生体分子の取り込みが減少するか、完全に阻害される可能性があります。高電圧パルスは細胞負荷を改善しますが、エレクトロポレーション直後の細胞生存率にも影響を与える可能性があります。500マイクロリットルのリッチ培地を加え、細胞を新鮮な1.5ミリリットルのチューブに移します。摂氏37度の細菌または摂氏29度の酵母を2〜10分間インキュベートして、細胞膜を回復させます。生体分子の取り込みと増殖回復後、摂氏4度の予冷遠心分離機で細胞を1分間スピンダウンし、仰臥位薬剤リースを廃棄します。ペレットを500マイクロリットルのバッファーに懸濁し、スピンダウンセートと除去、およびバッファーの懸濁液プロセスを繰り返します。さらに3回。これらの洗浄ステップにより、細胞懸濁液から非内在化生体分子の痕跡がすべて除去されます。標識タンパク質の内在化および追加の精製ステップは、細胞懸濁液をピペッティングし、上部に0.22ミクロンのメンブレンフィルターを取り付けた1.5ミリリットルのチューブにピペッティングすることによって行われます。遠心分離によって細胞をバッファーから分離し、細胞が乾燥するのを防ぎ、フロースルーフラクションを廃棄するために、フィルターの上に十分な液体が残っていることを確認します。フィルターの下に、細胞上に500マイクロリットルの新鮮なPBSを加え、スピンダウンとそれに続く新鮮なPBSエディションの組み合わせを繰り返します。さらに2回。3, 300 Gで1分間の最終スピンダウンを行います。前のPBS洗浄液を除去するには、150マイクロリットルのPBSで細胞を再懸濁します。最後に、前に作成したアロスパッドから上部カバースリップを取り外します。細胞懸濁液10マイクロリットルを滴下して、細胞をパッドにロードします。新しいクリーニングしたカバースリップをローズパッドの上に置いた後、サンドイッチセルは蛍光顕微鏡検査の準備が整いました。標識された生体分子や、電気評価もインキュベーションもされていない空の細胞とインキュベートされた非評価コントロールなどのネガティブコントロールも、ロードされたサンプルと並行して調製する必要があり、ロードされた細胞は適切な蛍光顕微鏡でイメージングできます。広視野イメージングモードは細胞レベルのイメージングと分析を可能にしますが、芝生または高低照度または単一分子の観察と追跡に最適です。生体分子の過剰な光退色を防ぐために、サンプルをロードする前に、ステージ上のすべてのレーザー照明がオフになっているか、不透明なフィルターでブロックされていることを確認してください。さらに、カメラへの露出過多の損傷を防ぐために、E-M-C-C-Gカメラゲインをオフにしてください。倒立顕微鏡のセットアップでは、細胞で覆われた面を下に向けて、Aris パッドサンドイッチを顕微鏡ステージに置きます。次に、上面のハロゲンライトをオンにし、透過白色光顕微鏡モードで細胞に焦点を合わせてから、レーザーをオンにする前に、白色光透過モードで細胞を撮影します。この写真は、生体分子蛍光の領域と細胞の実際の位置を同じ視野内で相関させる位置参照マップとして使用されます。生存率を測定するには、最適な温度に設定された対物レンズヒーターを使用し、ステージを動かさずに30分ごとに白色光照明の下で同じ視野の連続画像を記録し、上面の照明をオフにして、ラボ内の他のすべての周囲光源からサンプルを保護します。次に、CCDカメラの電源を入れ、データ取得を開始します。レーザー照明をオンにする直前に蛍光イオンの記録を開始します。蛍光顕微鏡法を実施した後、Image Jなどの画像処理ソフトウェアですべての写真を開いてデータ解析を開始し、設定ボタンを押してすべての画像の明るさやコントラストなどの基本的な画像パラメータをすべて正規化し、他のすべての画像に伝播することを選択します。オプション1は、ロードされたセルが特定の画像のネガティブコントロールとして使用される非エレクトロポレーションセルよりも大幅に明るくなければならないため、セルローディングが成功したかどうかを定性的に確認することができます。フリーハンド選択ツールを使用して、手描きのポリゴンで蛍光のさまざまな領域を囲みます。関連するすべてのポリゴン間の蛍光強度を比較するには、解析メニューから測定オプションを選択します。このプロセスを手動で、または自動スクリプトを使用して、各サンプルとネガティブコントロールのすべてのセルのピクセルあたりの強度を抽出します。電気定格セルに1つまたは複数の蛍光生体分子をロードすると、その平均発光強度はネガティブコントロールサンプルの平均強度よりも大きくなります。細胞の生存率を手動で評価するには、無傷で分裂している細胞と損傷していない細胞による分裂の割合を数えます。データが30分ごとに数回の分割にわたって記録されたのと同じ視野では、特に生体分子が急速に拡散する場合や、細胞に5つ以上の標識生体分子がロードされている場合、細胞ごとに取り込まれる生体分子の数を直接カウントできるとは限りません。細胞ベースの光退色分析により、このような条件下で細胞あたりの標識生体分子の数を評価できます。フリーハンド選択ボタンを使用して、特定の蛍光細胞の輪郭をトレースし、光退色効果による時間の関数として生細胞の蛍光を抽出してプロットします。強度対時間グラフは指数関数的に減少する曲線、つまり負荷の大きい細胞になりますが、生体分子が10個未満の細胞の場合、明確なステップを区別できる必要があります。実験のフラットテールエンド部分付近の生の蛍光強度値を平均化することにより、光退色後の平均自家蛍光を計算します。たとえば、タイムラプスシリーズの最後の50〜100の画像フレームです。ベースラインの強度も決定した後、生の蛍光データからベースラインの自家蛍光を差し引くことにより、時間依存の光退色強度を計算し、結果として得られる光退色強度データをブロックし、手動またはアルゴリズムを使用して各ステップの高さを量子化します。このプロセスは、平均ステップ高さの正確な推定を得るために、全体で100ステップを超えるいくつかの細胞に対して繰り返すべきであり、この値は、単一のフルオロ4の漂白による単一フルオロ4強度に対応する。最後に、細胞あたりの内在化分子の数は、ゼロに等しい時間におけるベースラインから差し引かれた細胞強度をユニタリーフルオロで割ることによって計算できます。このエレクトロポレーションプロトコルでは4つの強度。蛍光標識されたDNAまたはタンパク質の量を細菌または酵母に取り込むことができるのは、エレクトロポレーションバッファー内に存在するDNAプローブの量を調整することで制御できます。生体分子のインターナリゼーション率が高い場合、標識された生体分子の光退色寿命は、最初に蛍光強度を時間の関数としてプロットし、次にその指数関数的な時定数を抽出することで見つけることができます。取り込み率が低い場合、蛍光強度の量子化は、特定の細胞内の生体分子の総数を近似する手段を提供します。エレクトロポレーションは、タンパク質を細菌や酵母に組み込むためにも使用できます。蛍光標識タンパク質の場合。遊離蛍光色素自体は非常に効率的に取り込まれるため、タンパク質ストックから余分な遊離蛍光色素と共有結合していない蛍光色素をすべて除去することが重要です。最後に、私たちの分子によって二重に標識されたものは、私たちの方法を使用して内部化することもでき、生細胞で数秒間にわたって単一分子のフレット観察を可能にします。この手順を試行する際には、標識された生体分子とインキュベートされた非エレクトロセルや、エレクトロポレーションも標識分子とインキュベートもされていない空の細胞などのコントロールサンプルも調製および分析することを覚えておくことが重要です。これらのコントロールにより、細胞の自家蛍光のレベルと洗浄ステップの不足を評価することができ、そのため、エレクトロポレーション実験が成功したかどうかを評価するために必要です。この技術は、生物物理学および第3生物学の分野の研究者が、生きている微生物における標識生体分子の拡散と動的挙動を探求するための新たな道を開きました。そして、これは時間スケールで、GFPなどの自己蛍光タンパク質よりも1桁から2桁長くなります。これにより、in vivoでの有機d標識の柔軟性が移り、生細胞の分子内および分子間ダイナミクスの研究において、単一分子の脅威実験がはるかに実現可能になりました。

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Biology

生物学

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単一分子複合体の可視化インビボでの高度な蛍光顕微鏡を用いて

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細胞の電気融合を蛍光顕微鏡で可視化

出典: Aigrain, L. ほか。 エレクトロポレーションによる生体微生物における蛍光生体分子の内部化および観察。 J. Vis. Exp.

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エレクトロポレーションを介したIn vitro遺伝子導入:蛍光レポータータンパク質をコードするプラスミドを培養細胞に導入するための電気パルス技術

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pH感受性蛍光体で膜タンパク質の細胞外ドメインをラベリング、superecliptic pHluorin（SEP）は、細胞内局在、発現、および人身売買を決定することができます。全反射蛍光顕微鏡（TIRFM）の撮像SEP-標識されたタンパク質は、末梢ERおよび原形質膜中のタンパク質レベルの定量化を可能にします。...

細胞内局在や人身売買を監視するpHluorinタグ付き受容体を利用します

細菌の本質的なプロセスの機能を理解することは困難です。ターゲット固有の染料を蛍光顕微鏡は、微生物細胞の成長そして細胞周期の進行に重要な洞察を提供できます。ここでは、アグロバクテリウムは不可欠なプロセスの特性評価のための生きているセルイメージ投射のための方法を強調するモデル菌として使用されます。...

微生物細胞の成長に不可欠なプロセスを遵守する細胞蛍光顕微鏡をライブします。

細菌細胞のイメージングは、大きな高分子機械の機能を決定する静的および動的プロセスの定義に焦点を当てた新しいシステム生物学アプローチです。ここでは、定量的ライブ細胞イメージングとクライオ電子断層撮影の統合により、レジオネラ菌型肺炎球体系IV型分泌系のアーキテクチャと機能を研究しています。...

レジオネラ肺球菌ドット/Icm分泌系の空間的特徴を解決するためのライブ細胞イメージングとクライオ電子断層撮影の適用

エレクトロポレーションとは、パルス電界(PEF)を使用して細胞培養に一過性の細孔を作り、分子カーゴを導入することです。この技術は、最近、研究や臨床現場で広く使用されるようになりました。ここでは、最近開発された「エレクトロポレーションサイトメトリーシステム」を用いた、生細胞の蛍光顕微鏡法を用いたエレクトロポレーション技術について述べます。...

U2 OS細胞培養を用いた生細胞、蛍光顕微鏡法のためのエレクトロポレーションサイトメトリープロトリー

学ぶエレクトロポレーションを用いて蛍光標識したDNAやタンパク質などの生体分子を生きた微生物に導入し、蛍光顕微鏡で観察する方法です。細胞内での生体分子の動態と局在を長時間追跡できます。

エレクトロポ生きた微生物で内在化および蛍光生体分子の観測

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