エレクトロポ生きた微生物で内在化および蛍光生体分子の観測

この手順の目標は、エレクトロポレーションに基づく方法を使用して、有機フッ素で標識されたDNAやタンパク質などの生体分子を生きた微生物内に内在化し、視覚化することです。これは、まずエレクトロコンピテントセルを蛍光標識生体分子とインキュベートしてから、エレクトロポレーションベテインに移すことで達成されます。vete全体に高電圧を印加することにより、細胞壁と細胞膜の両方に一時的な細孔が形成され、細胞への生体分子の拡散が可能になります。

次に、細胞を濃縮培地でインキュベートして、過剰な非内在化生体分子が除去される前に細胞を回復させます。最後に、細胞を低蛍光の最小限の栄養物発生パッドに移し、次にガラスカバースリップを上に重ねてガラスアグロサンドイッチを形成します。最終的に、本質顕微鏡法を使用して、生細胞内の標識生体分子の位置、拡散パターン、および動的特性を分析します。

この手法のアイデアを思いついたのは、生細胞イメージングの限界に気づいたときでした。GFPなどの光蛍光タンパク質は急速にグリッチが発生するため、有機フルオロフォースで標識された生体分子を生細胞にロードすることで、生きた微生物に移植できると考えました。この力の主な利点は、明るさ、写真の安定性、および小さいサイズです。

次に、DNAまたはタンパク質の天然環境での局在化と拡散をはるかに長い時間スケールで追跡することを望んでいますが、これは多くの重要な生物学的プロセスと一致します。これらの技術がマイクロインジェクションなどの既存の方法よりも優れている点は、一般的なマイクロインジェクション針の直径よりも小さい微生物にも適用できることです。エレクトロポレーションのさらなる利点は、多数の細胞に蛍光生体分子を同時にロードし、それらを並行して視覚化できることであり、エレクトロポレーションは特にアイスループット技術です。

この方法は、インビボで蛍光標識された生体分子の拡散および動態挙動に関する洞察を提供することができるが、標識されていない電極生体分子などの他の状況にも適用することができるが、例えば、細胞によって内在化されたときに生理学的応答を引き起こすことができる細菌または酵母蛍光顕微鏡用のアロスパッドを構築するために、いくつかの2つの低蛍光培地を準備することから始め、 次に、2%アロスの溶液を蒸留水ですぐにラボ用電子レンジで溶かします。ホットHAローズの1つの一致するボリュームをメディアに加え、混合物を静かに上下にピペットで動かします。気泡の形成を避けて、すぐに約200マイクロリットルの発生した混合物を標準サイズの顕微鏡カバースリップにピペットで移します。

カバースリップを室温で1分間ベンチに置いておくか、ゲルが固まるまで、または一時的に保管し、新しいパッドの上に2番目の洗浄したカバースリップを置き、エッグローズの上部からエッグローズのフラスに静かに圧力をかけます。最大5マイクロリットルの生体分子を、20マイクロリットルの適格な細菌のアリコート、または50マイクロリットルの適格な酵母細胞に移します。細胞とインキュベートされる蛍光生体分子の量は、細胞ごとに取り込まれる生体分子の量と直接相関します。

エレクトロポレーション後、混合物を氷上で最大10分間インキュベートします。同時に、適切な電極間隔のエレクトロポレーションベテを選択し、氷上で冷却します。細胞混合物を予め冷却した獣医に移します。

獣医を数回軽くたたいて、溶液から泡を取り除きます。ペーパータオルで獣医から水分を取り除き、獣医を電気装置に入れます。このプロセスの直後にセルに高電圧パルスを印加します。

エレクトロ エータに表示される時定数が 4 ミリ秒から 6 ミリ秒の間であることを確認します。時定数が低いのは、多くの場合、qve内に過剰な塩分または気泡が存在するためであり、細胞への生体分子の取り込みが減少するか、完全に阻害される可能性があります。高電圧パルスは細胞負荷を改善しますが、エレクトロポレーション直後の細胞生存率にも影響を与える可能性があります。

500マイクロリットルのリッチ培地を加え、細胞を新鮮な1.5ミリリットルのチューブに移します。摂氏37度の細菌または摂氏29度の酵母を2〜10分間インキュベートして、細胞膜を回復させます。生体分子の取り込みと増殖回復後、摂氏4度の予冷遠心分離機で細胞を1分間スピンダウンし、仰臥位薬剤リースを廃棄します。

ペレットを500マイクロリットルのバッファーに懸濁し、スピンダウンセートと除去、およびバッファーの懸濁液プロセスを繰り返します。さらに3回。これらの洗浄ステップにより、細胞懸濁液から非内在化生体分子の痕跡がすべて除去されます。

標識タンパク質の内在化および追加の精製ステップは、細胞懸濁液をピペッティングし、上部に0.22ミクロンのメンブレンフィルターを取り付けた1.5ミリリットルのチューブにピペッティングすることによって行われます。遠心分離によって細胞をバッファーから分離し、細胞が乾燥するのを防ぎ、フロースルーフラクションを廃棄するために、フィルターの上に十分な液体が残っていることを確認します。フィルターの下に、細胞上に500マイクロリットルの新鮮なPBSを加え、スピンダウンとそれに続く新鮮なPBSエディションの組み合わせを繰り返します。

さらに2回。3, 300 Gで1分間の最終スピンダウンを行います。前のPBS洗浄液を除去するには、150マイクロリットルのPBSで細胞を再懸濁します。

最後に、前に作成したアロスパッドから上部カバースリップを取り外します。細胞懸濁液10マイクロリットルを滴下して、細胞をパッドにロードします。新しいクリーニングしたカバースリップをローズパッドの上に置いた後、サンドイッチセルは蛍光顕微鏡検査の準備が整いました。

標識された生体分子や、電気評価もインキュベーションもされていない空の細胞とインキュベートされた非評価コントロールなどのネガティブコントロールも、ロードされたサンプルと並行して調製する必要があり、ロードされた細胞は適切な蛍光顕微鏡でイメージングできます。広視野イメージングモードは細胞レベルのイメージングと分析を可能にしますが、芝生または高低照度または単一分子の観察と追跡に最適です。生体分子の過剰な光退色を防ぐために、サンプルをロードする前に、ステージ上のすべてのレーザー照明がオフになっているか、不透明なフィルターでブロックされていることを確認してください。

さらに、カメラへの露出過多の損傷を防ぐために、E-M-C-C-Gカメラゲインをオフにしてください。倒立顕微鏡のセットアップでは、細胞で覆われた面を下に向けて、Aris パッドサンドイッチを顕微鏡ステージに置きます。次に、上面のハロゲンライトをオンにし、透過白色光顕微鏡モードで細胞に焦点を合わせてから、レーザーをオンにする前に、白色光透過モードで細胞を撮影します。

この写真は、生体分子蛍光の領域と細胞の実際の位置を同じ視野内で相関させる位置参照マップとして使用されます。生存率を測定するには、最適な温度に設定された対物レンズヒーターを使用し、ステージを動かさずに30分ごとに白色光照明の下で同じ視野の連続画像を記録し、上面の照明をオフにして、ラボ内の他のすべての周囲光源からサンプルを保護します。次に、CCDカメラの電源を入れ、データ取得を開始します。

レーザー照明をオンにする直前に蛍光イオンの記録を開始します。蛍光顕微鏡法を実施した後、Image Jなどの画像処理ソフトウェアですべての写真を開いてデータ解析を開始し、設定ボタンを押してすべての画像の明るさやコントラストなどの基本的な画像パラメータをすべて正規化し、他のすべての画像に伝播することを選択します。オプション1は、ロードされたセルが特定の画像のネガティブコントロールとして使用される非エレクトロポレーションセルよりも大幅に明るくなければならないため、セルローディングが成功したかどうかを定性的に確認することができます。

フリーハンド選択ツールを使用して、手描きのポリゴンで蛍光のさまざまな領域を囲みます。関連するすべてのポリゴン間の蛍光強度を比較するには、解析メニューから測定オプションを選択します。このプロセスを手動で、または自動スクリプトを使用して、各サンプルとネガティブコントロールのすべてのセルのピクセルあたりの強度を抽出します。

電気定格セルに1つまたは複数の蛍光生体分子をロードすると、その平均発光強度はネガティブコントロールサンプルの平均強度よりも大きくなります。細胞の生存率を手動で評価するには、無傷で分裂している細胞と損傷していない細胞による分裂の割合を数えます。データが30分ごとに数回の分割にわたって記録されたのと同じ視野では、特に生体分子が急速に拡散する場合や、細胞に5つ以上の標識生体分子がロードされている場合、細胞ごとに取り込まれる生体分子の数を直接カウントできるとは限りません。

細胞ベースの光退色分析により、このような条件下で細胞あたりの標識生体分子の数を評価できます。フリーハンド選択ボタンを使用して、特定の蛍光細胞の輪郭をトレースし、光退色効果による時間の関数として生細胞の蛍光を抽出してプロットします。強度対時間グラフは指数関数的に減少する曲線、つまり負荷の大きい細胞になりますが、生体分子が10個未満の細胞の場合、明確なステップを区別できる必要があります。

実験のフラットテールエンド部分付近の生の蛍光強度値を平均化することにより、光退色後の平均自家蛍光を計算します。たとえば、タイムラプスシリーズの最後の50〜100の画像フレームです。ベースラインの強度も決定した後、生の蛍光データからベースラインの自家蛍光を差し引くことにより、時間依存の光退色強度を計算し、結果として得られる光退色強度データをブロックし、手動またはアルゴリズムを使用して各ステップの高さを量子化します。このプロセスは、平均ステップ高さの正確な推定を得るために、全体で100ステップを超えるいくつかの細胞に対して繰り返すべきであり、この値は、単一のフルオロ4の漂白による単一フルオロ4強度に対応する。

最後に、細胞あたりの内在化分子の数は、ゼロに等しい時間におけるベースラインから差し引かれた細胞強度をユニタリーフルオロで割ることによって計算できます。このエレクトロポレーションプロトコルでは4つの強度。蛍光標識されたDNAまたはタンパク質の量を細菌または酵母に取り込むことができるのは、エレクトロポレーションバッファー内に存在するDNAプローブの量を調整することで制御できます。

生体分子のインターナリゼーション率が高い場合、標識された生体分子の光退色寿命は、最初に蛍光強度を時間の関数としてプロットし、次にその指数関数的な時定数を抽出することで見つけることができます。取り込み率が低い場合、蛍光強度の量子化は、特定の細胞内の生体分子の総数を近似する手段を提供します。エレクトロポレーションは、タンパク質を細菌や酵母に組み込むためにも使用できます。

蛍光標識タンパク質の場合。遊離蛍光色素自体は非常に効率的に取り込まれるため、タンパク質ストックから余分な遊離蛍光色素と共有結合していない蛍光色素をすべて除去することが重要です。最後に、私たちの分子によって二重に標識されたものは、私たちの方法を使用して内部化することもでき、生細胞で数秒間にわたって単一分子のフレット観察を可能にします。

この手順を試行する際には、標識された生体分子とインキュベートされた非エレクトロセルや、エレクトロポレーションも標識分子とインキュベートもされていない空の細胞などのコントロールサンプルも調製および分析することを覚えておくことが重要です。これらのコントロールにより、細胞の自家蛍光のレベルと洗浄ステップの不足を評価することができ、そのため、エレクトロポレーション実験が成功したかどうかを評価するために必要です。この技術は、生物物理学および第3生物学の分野の研究者が、生きている微生物における標識生体分子の拡散と動的挙動を探求するための新たな道を開きました。

そして、これは時間スケールで、GFPなどの自己蛍光タンパク質よりも1桁から2桁長くなります。これにより、in vivoでの有機d標識の柔軟性が移り、生細胞の分子内および分子間ダイナミクスの研究において、単一分子の脅威実験がはるかに実現可能になりました。