生分解性ポリマーナノ粒子を用いた治療的血管形成のためのプログラミング幹細胞

この手順の全体的な目標は、海洋性後肢虚血モデルを使用して、幹細胞における治療遺伝子の過剰発現のための高分子ナノ粒子の使用を実証することです。これは、まず2段階のマイクエディション反応で生分解性ポリマーを合成し、続いて治療遺伝子をコードする高分子ナノ粒子を作製することで達成されます。第2のステップは、ヒト脂肪由来幹細胞をin vitroで過剰発現した血管内皮増殖因子にトランスフェクションすることです。

次に、プログラムされた幹細胞を虚血性後肢に筋肉内注射して、治療因子のNC2産生を行います。最後のステップは、生物発光イメージングとレーザードップラーイメージングを使用して、虚血性肢の細胞生存と血液再灌流を経時的に監視することです。最終的には、定量的な遺伝子発現と組織学を行うことで、治療因子の局在的な発現と組織再生の有効性を示すことができます。

この技術が従来の血管新生法よりも優れている点は、幹細胞を薬物送達のビヒクルとして利用できることです。この戦略により、幹細胞の自然なホーイング能力を利用して虚血に向かって移動することができ、また、微小環境の手がかりに対する動的な応答も可能になります。血漿DNA送達に使用されるナノ粒子は、非常に効率的で生分解性であり、細胞毒性が低く、細胞内に送達されるDNAコピーの数が多くなります。

この技術は、生分解性の非ウイルスベクターを利用して遺伝子を自家細胞に挿入するため、多くの臨床的に関連する細胞ベースの治療薬に適用することができます ヒュームフード内で作業し、ブタンダイヤルDLIを計量し、材料を攪拌棒を含むガラス吸入バイアルに移します。次に、予熱した5つのアミノ1ペントールを同じバイアルに加えます。すぐにバイアルを攪拌板に置き、速度を600RPMに設定します。

バイアルを摂氏90度に設定されたオーブンに移し、4時間後に攪拌速度を1000 RPMに上げ、速度を300 RPMに下げてさらに12〜16時間攪拌します。準備ができたら、攪拌子が入ったガラスバイアルに10ミリリットルの無水テトラハイドロウランを5グラムのC 32に加えます。攪拌棒を含む別のガラスバイアルに完全に溶解するまでホイルボルテックスで強火で包んだ後、10ミリモルのテトラエチレングリコールジアミンを加えます。

このバイアルに40ミリリットルのTHFを加え、両方のバイアルを攪拌板に5分間置いてから、それらを一緒に組み合わせます。得られたものをホイルで覆い、室温で24時間放置します。最終製品はC 32 1 22と呼ばれます。

次に、30ミリリットルの無水ダチルエーテルを5本の50ミリリットルのファルコンチューブのそれぞれに移します。C 32 1 22を無水ジルエーテルに添加した後、白い濁った溶液がチューブを渦巻き、次いでそれを遠心分離する。抽出されたポリマーはチューブの基部に集まり、上部の溶液を廃棄し、これらの手順をさらに2回繰り返します。

抽出したら、開いたチューブを乾燥剤に入れて一晩掃除機で掃除し、チューブが光から保護されていることを確認します。翌日、C 32 1 22を含むチューブを計量して、最終的な質量を決定します。最後に、抽出したポリマーを無水DMSOに100ミリグラム/ミリリットルの濃度で溶解します。

ナノ粒子の調製に。まず、血漿DNAを酢酸ナトリウムの最終濃度120マイクログラム/ミリリットルに希釈し、第2のチューブでC 32 1 22を最終濃度3.6ミリグラム/ミリリットルに希釈します。酢酸ナトリウムで、各チューブの内容物を1つの15ミリリットルのファルコンチューブに結合し、すぐに10秒間強でボルテックスします。

チューブを室温で10分間放置すると、ナノ粒子が形成されている間にナノ粒子が形成されます。以前に装着した組織培養フラスコの培地を7.8ミリリットルと交換します。DMEMを完全に補完。

ナノ粒子溶液を組織培養フラスコに移し、均等に広げてからインキュベーターに入れます。2時間後、ナノ粒子を含む媒体をDMEMと交換します。4時間後、細胞はin vivo注射の準備が整います。

トランスフェクションした細胞の準備ができたら、PBS中の6細胞/ミリリットルの10倍の密度で細胞をカウントスペンして、各マウスが等しい量を受け取るようにします。細胞懸濁液を110マイクロリットルの容量でアイノールチューブに分離します。次に、以前に後肢虚血を起こしたマウスに麻酔をかけます。

つま先をつまんで麻酔を確認した後、27ゲージのシリンジで注入部位を洗浄します。細胞を再懸濁し、懸濁液の100マイクロリットルを吸い上げます。細胞懸濁液の半分を内転筋領域に注入し、次に残りの半分をふくらはぎ筋領域に注入します。

注入後は、漏れを防ぐためにシリンジを少なくとも15〜30秒間そのままにしておきます。注射が完了したら、完全に回復するまで動物を暖かく保ちます。生物発光イメージングでは、つま先をつまんで麻酔を確認した後、先に示すように注入部位を清掃します。

インスリン注射器に100マイクロリットルのルシファーを入れ、腹腔内に注射します。動物をivus Luciferaseイメージングチャンバーに入れる前に、1分間の露光時間でマウスを画像化します。画像が取得されたら、関心領域をマークします。

この場合、細胞注入部位の虚血性肢は、シグナルがピークに達して減少し始めるまで、3〜5分ごとにルシフェラーゼシグナルを測定し続けます。これは、マウス間および時間経過での比較に使用される値であり、完了したら、マウスをチャンバーから取り出し、完全に回復するまで動物を暖かく保ちます。ティッシュは決まった時間に収穫されます。

安楽死後のトランスフェクション後のポイントで、遠位腹部と後肢の近位で後肢を囲む皮膚を円周方向に切り取ります。皮膚を引っ張った後、骨盤と大腿骨の関節の間の手足を切断します。最後に、内側内転筋と腓筋が分離されます。

さらなる分析のために、これらの画像はC 32 1 22の合成を示しています。ここで、ACR関連の終端C 32 ACは、DAL末端基を持つモノマーと一次am平均末端基を持つモノマーとの間のマイクエディション反応によって形成されました。この例では、トランスフェクション効率を高めるために平均末端モノマーを添加することにより、変性PBAEポリマーを形成できる。

トランスフェクションの成功は、ここで見られるように、緑色蛍光タンパク質の過剰発現によって明らかです。この生物発光イメージングデータは、0日目と14日目のマウスを示しています。GFPルシフェラーゼ陽性脂肪由来幹細胞を後肢に注入した後、代表的なドップラー画像は、0日目にミラーリング後肢の片側に虚血が誘発され、血液再灌流が成功したことを示しています。

脂肪由来幹細胞を過剰に発現するVEGFの注射から14日後。R-T-P-C-Rは、細胞注射の4日後に治療群でコード化された治療タンパク質であるvgfのアップレギュレーションが成功したことを確認しましたが、PBSコントロールでは発現は検出されませんでした。幹細胞と遺伝子を組み合わせた送達アプローチを適用する他の方法を実行して、組織再生を促進するための新しい治療標的を特定することができます。

このビデオを見た後、非ウイルス性遺伝子治療のための生分解性ポリマーを合成する方法と、これらのポリマーを使用して虚血および生体内の治療のための幹細胞をプログラムする方法をよく理解しているはずです