Name: iPSC由来内皮前駆体の血管学的電位を定量化するインビトロ3Dモデルと計算パイプライン (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 36 s
Description: 学ぶiPSC由来内皮前駆細胞の血管新生能評価法。3Dコラーゲン封入と計算解析パイプラインにより、心血管疾患治療と疾患モデリングのための機能性血管構築に関する知見を得られます。

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この研究は、米国心臓協会(助成番号15SDG25740035、J.Z.に授与)、国立衛生研究所の生物医学イメージングとバイオエンジニアリング研究所(NIBIB)(助成番号EB007507、C.C.に授与)によって支援されました。再生リハビリテーション研究・訓練同盟(AR3T、助成番号1 P2C HD086843-01、J.Z.に授与)私たちは、ジャンヌ・スタッコワック教授(テキサス大学オースティン校)が共焦点顕微鏡に関する技術的助言を受け入れたいと思います。また、サミュエル・ミヘリック(テキサス大学オースティン校)、アリシア・アレン博士(オースティンのテキサス大学)、ジュリー・リトルフスキ博士(アダプティブ・バイオテクノロジー)、レオン・ベラン博士(ヴァンダービルト大学)とのディスカッションにも感謝しています。3Dネットワークの計算分析。最後に、iPSCをiPSC-EPに分化するためのアドバイスを、カリフォルニア大学バークレー校のXiaoping Bao博士に感謝します。

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</ol>

著者は何も開示していない。

このプロトコルは、E8、LaSR基底、およびEGM-2の3種類の細胞培養培地における細胞の長期培養を含む。したがって、すべての材料を適切に殺菌するために細分注意する必要があります。さらに、ラボコートとエタノール洗浄手袋は、実験室の層流フードで作業する場合は常に着用する必要があります。マイコプラズマ汚染を頻繁にテストすることをお勧めします。iPSC培養中に大量の破片が観測されたり、分化効率が急激に低下したりすると、マイコプラズマ汚染が原因と考えられます。このプロトコルで生成されたiPSC-EPは、解離時間を長くし、単一細胞懸濁液を小さな塊に分離させるECMのかなりの量を堆積する傾向があります。溶液がiPSC-EP上のCD34エピトープを破壊する可能性があるため、トリプシン-EDTA(0.25%)を使用しないでください。しかし、コラゲナーゼ/ディスパーゼ溶液による治療は、沈着したECMを除去し、標準的な細胞剥離溶液で解離を容易にする。広範な解離後、細胞およびECMのいくつかの小さな塊が残る。彼らは細胞ストレーナーを詰まらせるか、FACSを妨害する可能性が高いので、P100ピペット先端でこれらの塊を削除します。
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ヒト臍静脈内皮細胞(HUVEC)および他の一次内皮細胞型は、インビトロ1における血管の発芽および発達をモデル化するために20年間利用されてきた。このような血管プラットフォームは、心血管疾患の分子および組織レベルのメカニズムを照らすことを約束し、原始的な血管ネットワーク2,3の発達に生理学的洞察を提示しうる。血管モデリングの分野は大きな進歩を遂げましたが、生理学的血管の発達を定量的にモデル化し評価できる「ゴールドスタンダード」アッセイは依然として解明されていません。ほとんどの公表されたプロトコルは、成熟した機能的な血管の形成を奨励するために血管ニッチを十分に要約しないか、評価された細胞型の血管球電位を3次元で定量的に比較する方法を持っていない(3D)。
多くの現在の血管モデルは、生理血管ニッチを模倣する能力に制限されています。インビトロプラットフォームで最も一般的に採用されているのは、ゼラチン性タンパク質混合物系チューブ形成アッセイです。簡単に言えば、HUVECは、マウス肉腫細胞外マトリックス(ECM)から採取されたタンパク質からなるゲルの薄い層上の単一細胞として播種される。1〜2日以内に、HUVECは原始的な管4に自己集合する。しかしながら、このプロセスは、このアッセイで利用される2次元(2D)および内皮細胞(IC)が密閉された中空の内包を形成せず、それによってこれらの研究の生理的意義を制限する。さらに最近では、ICおよび支持細胞(例えば、間葉系幹細胞(MSC)およびペリサイト)は、コラーゲンまたはフィブリンヒドロゲル5などの天然ECMの繊維構造をシミュレートする3D微小環境で共培養されている。この微小環境における血管発達をモデル化するために、ICでコーティングされたポリマービーズは、典型的には6を採用している。ヒドロゲルに間に埋め込まれた他の細胞によって分泌される外因性成長因子および/または成長因子の添加は、ICを誘導し、ポリマービーズをコーティングし、単一の内気を発芽させ、形成することができる。その後、芽や血管の数と直径を計算することができます。しかし、これらの芽は特異であり、生理学的条件で見られるように密閉された接続されたネットワークを形成しないため、腫瘍血管系モデルを連想させる。マイクロ流体デバイスはまた、血管ニッチを模倣し、ECを含むヒドロゲル7、8における血管系の形成を促進するために利用されている。典型的には、血管新生成長因子勾配は、EC移行および発芽を誘導するために循環細胞培養培地に適用される。発達した血管の内気を構成するICは、マイクロ流体装置を通る流体の流れの適用によって引き起こされるせん断応力に敏感である。したがって、これらのマイクロ流体デバイスは、静的モデルではアクセスできない主要な生理学的パラメータを捕捉します。しかし、これらのデバイスには高価な微細加工能力が必要です。
最も重要なことは、3つの血管モデル(2D、3D、マイクロ流体)すべてが、一次ICと一次支持細胞タイプを圧倒的に利用していることです。一次細胞は、移植時に免疫応答を生じるので、効果的な心血管療法に開発することはできません。さらに、HUVECおよび同様の一次細胞型は患者特異的ではなく、遺伝的性質または既存の健康状態(例えば糖尿病)を有する患者に生じる血管異常を捕捉しない。誘導多能性幹細胞(iPSC)は、患者特異的で増殖性の細胞源として過去10年間に出現しており、人体内のすべての体細胞に分化することができる9。特に、iPSC由来の内皮前駆子(iPSC-EPs)10,11の生成と単離を概説するプロトコルが公開されている。iPSC-EPは二重能であり、したがって、成熟した機能的血管系のビルディングブロックである内皮細胞および平滑筋細胞/ペリサイトにさらに分化することができる。3D微小環境12におけるiPSC-EPからの一次毛細叢の開発を説得力のある詳細に述べた研究は1つだけだ。本研究は、iPSC-EPアセンブリの理解と天然および合成ヒドロゲルの分化にとって重要であるが、得られた血管系のネットワークトポロジを定量的に比較しなかった。別の最近の研究では、ポリマービーズモデルを使用して、HUVECとiPSC由来のIC5の発芽を比較しました。したがって、3D微小環境におけるiPSC-EP血管形成を調節する物理的および化学的シグナル伝達機構をさらに解明し、これらの細胞が虚血療法および心血管疾患に適しているかどうかを判断する必要があることは明らかである。モデリング。
過去10年間で、血管ネットワークの長さと接続性を定量化し、比較するために、さまざまなオープンソースの計算パイプラインとスケルトン化アルゴリズムが開発されました。例えば、Charwatらは、フィブリンマトリックス13,14における脂肪由来幹細胞と成長するICの共培養に由来する血管ネットワークの濾過されたバイナリ化画像を抽出するPhotoshopベースのパイプラインを開発した。おそらく、最も広く使用されているトポロジ比較ツールは、AngioTool、国立がん研究所15によってオンラインで公開されたプログラムです。プログラムの広範な採用と十分に文書化された忠実さにもかかわらず、プログラムは2次元で血管のような構造を分析し、AngioSysとWimasisを含む他のプログラムは、同じ次元制限16を共有しています。イマリス、ルシス、メタモルフなどの強力なソフトウェアスイートは、設計された微小血管のネットワークトポロジを分析するために開発されました。ただし、これらのスイートは、ほとんどのアカデミック ラボにとってコストがかかり、ソース コードへのアクセスを制限する必要があるため、エンド ユーザーが特定のアプリケーションに合わせてアルゴリズムをカスタマイズする機能を妨げる可能性があります。オープンソースの磁気共鳴イメージング/コンピュータ断層撮影パッケージである3Dスライサーには、3D血管ネットワークのトポロジを効果的に分析できる血管モデリングツールキットが含まれています17;ただし、分析はユーザーがネットワークのエンドポイントを手動で配置することに依存します。この原稿では、3D血管ネットワークを定量することができる計算パイプラインについて詳しく説明する。上記の制限を克服するために、このオープンソースの計算パイプラインは、ImageJを使用して取得した共焦点イメージを事前に処理し、3D ボリュームをスケルトンアナライザにロードします。スケルトンアナライザは、並列中間軸間引きアルゴリズムを使用し、もともとKerschnitzkiらによって開発され、骨細胞ネットワーク18の長さと接続性を分析しました。このアルゴリズムは、設計された微小血管の長さと接続性を特徴付けるために効果的に適用することができる。
全体として、このプロトコルは、3Dマイクロ環境における微小血管ネットワークの作成の概要を説明し、オープンソースとユーザバイアスの自由な計算パイプラインを提供し、iPSC-EPの血管学的可能性を容易に比較します。

<table><tbody><tr><td>&micro;-スライド血管新生</td><td>同上</td><td>N/A</td><td>側壁を備えた平坦なガラス底組織培養プレートは、容易な共焦点イメージング</td></tr><tr><td>96、丸底、超低アタッチメントマイクロプレート、無菌</td><td>コーニング</td><td>7007</td> 細胞培養皿アキュターゼSTEMCELLテクノロジー7920<td>への細胞含んだコラーゲンハイドロゲルの結合を防ぎます</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>穏やかな細胞剥離ソリューション。FACSに不可欠な細胞外エピトープを分解しない</td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>Thermo Scientific</td><td>12634010</td><td>iPSC-EP分化のためのベース培地。&nbsp;</td></tr><tr><td>バーンステッド GenPure xCAD Plus&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>50136165</td><td>純水製造システム; その他は容易に置換できる</td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン溶液、7.5% DPBS、滅菌ろ過、BioXtra、細胞培養に適しています</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>A8412</td><td>FACs ソーティング</td></tr><tr><td>CD34-PE、ヒト (クローン: AC136)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-098-140</td><td>iPSC-EPs</td></tr> <tr><td>の FAC 単離に使用される抗体CHIR99021</td><td>LC Laboratories</td><td>C-6556</td><td>Induces the formation of mesoderm from pluripotent stem</td></tr><tr><td>cells コラーゲン I ラットテール 高タンパク質 100 mg</td><td>VWR</td><td>354249</td><td>3D 微小環境の主成分</td></tr><tr><td>円錐形遠心チューブ (15/50 mL)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-49D/A</td><td>比較的大量の試薬と細胞培養培地</td></tr><tr><td>の保存と混合に使用DAPI(4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール、二塩酸塩)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>D1306</td><td>細胞核の対比染色と可視化</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>11320-082</td><td>マトリゲルの希釈および多能性幹細胞の融</td></tr>解 <tr><td>ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)</td><td>サーモフィッシャー</td><td>14190-250</td><td>単層培養物EDTA</td></tr><tr><td></td><td>の洗浄Sigma-Aldrich</td><td>E8008</td><td>多能性幹細胞コロニーの継代およびFACが内皮細胞増殖培地を選別する際の細胞凝集防止用</td></tr><tr><td></td><td>PromoCell</td><td>C-22011</td><td>内皮細胞の生存率と増殖を促進する</td></tr><tr><td>エッセンシャル 8 培地</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>A1517001&nbsp;&nbsp;</td><td>多能性幹細胞のメンテナンスに</td></tr><tr><td>Glycine,BioUltra, for molecular biology, >=99.0% (NT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>50046</td><td>残留界面活性剤を中和</td></tr><tr><td>L-アスコルビン酸 2-リン酸 sesquiマグネシウム塩水和物,>=95%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8960</td><td>iPSC-EP 分化媒体の成分</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>1.8.0_152</td><td>マルチパラダイム数値計算環境 (ほとんどの学術機関で無料)</td></tr><tr><td>マトリゲルマトリックスGFRフェノールRFマウス10mL(ゼラチン状タンパク質混合物)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>356231</td><td>DMEM/F12で希釈してiPSC-EP分化用プレートをコーティングします</td></tr><tr><td>Medium-199 10X</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>1825015</td><td>最終的なヒドロゲル浸透圧とpHのバランスをとるために使用されます</td></tr><tr><td>微量遠心チューブ(1.7mL)</td><td>VWR</td><td>87003-294</td> 少量<td>の試薬を保存します</td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水(PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3813</td><td>免疫染色溶液の主成分</td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン(10,000 U/mL)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>15140122</td><td>FACS装置から汚染の可能性を除去するために選別後に使用される抗生物質</td></tr><tr><td>組換えヒトVEGF 165タンパク質</td><td>R&D Systems</td><td>293-VE</td><td>内皮細胞の増殖と尿細管形成を刺激するマイトジェン</td></tr><tr><td>ローダミンファロイジン</td><td>テモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>R415</td><td>F-アクチン沈着を特定し、血管ネットワークの境界を概説するために</td></tr><tr><td>Triton X-100 (非イオン性界面活性剤)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>X-100</td><td>細胞を穏やかに透過処理するために使用される洗剤</td></tr><tr><td>Tween-20 (乳化試薬)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP337</td>は、追加された抗体VE-カドヘリン(F-8)の<td>結合特異性を高めます</td></tr><tr><td>サンタ</td><td>クルス</td><td>バイオテクノロジーsc-9989&nbsp;</td><td>コラーゲンハイドロゲルの3D内皮内腔の同定</td></tr><tr><td>ビトロネクチン</td><td>サーモフィッシャー</td><td>A14700</td><td>多能性幹細胞の維持用</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>セレック ケミカルズ</td><td>S1049</td><td>解離および再播種時に多能性幹細胞と iPSC-EP の生存能力を維持</td></tr></tbody></table>

ipsc由来内皮前駆体の血管学的電位を定量化するインビトロ3dモデルと計算パイプライン

An In Vitro 3D Model and Computational Pipeline to Quantify the Vasculogenic Potential of iPSC-Derived Endothelial Progenitors

誘導多能性幹細胞(iPSC)は、任意の体細胞型に分化することができる患者特異的、増殖性細胞源である。二能性内皮前駆体(EP)は、成熟した機能的血管系を組み立てるのに必要な細胞タイプに分化することができ、胚性および誘導多能性幹細胞の両方から得られている。しかし、これらの細胞は3次元環境では厳密に評価されておらず、血管球電位の定量的尺度は依然として解明されていない。ここでは、蛍光活性化細胞選別によるiPSC-EPの生成と単離について最初に概説し、続いてコラーゲンヒドロゲル中のiPSC-EPのカプセル化および培養の説明を行う。この細胞外マトリックス(ECM)模倣微小環境は、堅牢な血管学的応答を奨励する。血管ネットワークは、培養の1週間後に形成されます。オープンソースソフトウェアを利用してこの血管学的応答を定量化する計算パイプラインの作成を示す。このパイプラインは、キャピラリープレクサスの 3D アーキテクチャを維持し、ブランチの数、分岐ポイント、およびユーザー入力を最小限に抑えてネットワークの総長を堅牢に識別するように特別に設計されています。

分化(図1)、FACSおよびコラーゲンヒドロゲル中のiPSC-EPのカプセル化後、細胞は通常、移行し、初期ルーメンを形成し始める前に24時間丸みを帯びたままになります。約6日間の培養後、ブライトフィールド顕微鏡で見ると、原始毛細叢がヒドロゲルに見える(図2)。共焦点顕微鏡(ムービー1、補足ムービー1)で固定された染色された細胞を含むヒドロゲルをイメージングした後、前処理された画像は、ネットワークの全体的な長さと接続性の分析を可能にする骨格に変換されます。これらの定量的測定を使用して、堅牢な血管ネットワークを生成するために最適な条件セットを決定できます。
このプロトコルは、局所的な物理的および化学的手がかりに応答する堅牢な3次元毛細叢の開発を可能にする。前の研究では、このネットワーク形成は、マトリックス...

誘導多能性幹細胞(iPSC-EPs)に由来する内皮前駆体は、心血管疾患治療に革命を起こさせ、より忠実な心血管疾患モデルの作成を可能にする可能性を秘めています。本明細書において、三次元(3D)コラーゲン微小環境におけるiPSC-EPの封入およびこれらの細胞の血管球電位の定量分析について説明する。

iPSC由来内皮前駆体の血管学的電位を定量化するインビトロ3Dモデルと計算パイプライン

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are a patient-specific, proliferative cell source that can differentiate into any somatic cell type. Bipotent ...

当社のプロトコルは、血管系疾患治療の機能的な血管系の工学的な機能性をモデリングに役立つ血管新生の分子およびバルク組織レベルのメカニズムに対するユニークな洞察を可能にします。このプロトコルは、様々なプラットフォームの脈管原性ポテンシャルを評価するための堅牢な3次元血管ネットワークの作成を可能にし、また、最終的なネットワークトポロジを分析するための無料のオープンソース計算パイプラインを提供する。まず、摂氏37度で10分間、D5D6分化細胞培養の井戸当たり250マイクロリットルの細胞剥離液を添加します。インキュベーションの終了時に、P1000ピペットチップを使用して細胞を単一細胞懸濁液に解約する。遠心分離のための単一の15ミリリットルの円錐管の細胞の解決をプールする。ペレットを氷冷選別バッファーの200マイクロリットルに吊り下げ、5マイクロリットルの濃縮蛍光結合CD34抗体を摂氏4度で10分間標識します。インキュベーションの終わりに、5ミリリットルの氷冷選別バッファーで細胞を洗浄する。40マイクロメートルを通して懸濁液をフィルターし、5ミリリットルの蛍光活性化細胞選別、またはFACSチューブにストレーナーを注ぎます。サンプルを実行する前に、フルオシトメーター上の4番目の非標識細胞の10分の1を並べ替え、負のコントロールとして機能する非標識細胞のいずれも含まない高い蛍光強度で領域を測定する。次に、標識されたサンプルを並べ替え、それらの高いCD34発現に基づいて誘導多能性幹細胞に由来する内皮前駆体を含む。種類の終わりに、遠心分離のために内皮前駆細胞をマイクロ遠心分離管に移す。前駆細胞のコラーゲンヒドロゲルカプセル化については、細胞ペレットを200マイクロリットルの内皮成長培地2に懸濁し、ROCK阻害剤Y-27632の10ミクロリットルを添加した。氷の上の1.8ミリリットルのマイクロ遠心分離チューブに播種培地の400マイクロリットルに細胞を追加します。350マイクロリットルのコラーゲンを細胞懸濁液に混ぜます。溶液は淡い黄色になります。次に、1-ミュラー水酸化ナトリウムの10マイクロリットルをコラーゲンと細胞溶液に混ぜます。ソリューションは今明るいピンクになります。この中和コラーゲン細胞溶液のピペット56マイクロリットルは、摂氏37度で30分間のインキュベーションのための96ウェル超低付着U-底細胞培養プレートの個々の井戸に。インキュベーションの終わりに、明視野顕微鏡の下でウェルを調べて、細胞が均等に分布していることを確認します。その後、調製した新しい内皮成長培地2の100マイクロリットルを追加し、ROCK阻害剤と血管内皮成長因子を各ウェルに添加し、プレートを37°Cインキュベーターに戻します。培養の1週間後、ヒドロゲルあたり48ウェルプレートの1ウェルに4%パラホルムアルデヒドの250マイクロリットルを加え、ヒドロゲルから培地を取り除きます。次に、細かいピンセットを使用して、ウェルを含むパラホルムアルデヒドにヒドロゲルを移します。室温で10分後、迅速にPBSでヒドロゲルを洗浄し、室温で5分間0.5%非イオン界面活性剤の250マイクロリットルで3D培養物を透過させます。室温で250マイクロリットルのPBSで2回の5分間の洗浄でヒドロゲルを洗浄し、1洗浄あたり300ミリリットルのグリシンを加え、続いて各ヒドロゲルを250マイクロリットルのブロッキングバッファーに浸漬して室温で30分間洗浄します。適切な一次抗体を適切な一次抗体で希釈し、摂氏4度で一晩ブロッキングバッファーに希釈し、続いて0.5%乳化試薬とDulbeccoのPBSで2回のスケを行います。2回目の洗浄後、適切な種特異的二次抗体を用いて細胞に光から保護された室温で2時間標識し、3D培養物を0.5%乳化試薬およびダルベッコPBSで2回洗浄する前に、実例通り。細胞核を可視化するには、PBS中の1~10000濃度で希釈して室温で2分間培養し、続いて0.5%乳化試薬とダルベッッコPBSで2回の洗剤を加える。次に、細かいピンセットを使用して、各サンプルを適切な観察容器に移します。コラーゲンヒドロゲルの分化、並べ替え、カプセル化の後、細胞は通常、移行し始めて初期の内腔を形成する前に、24時間丸められたままになります。約6日間の培養後、明るいフィールド顕微鏡で観察すると、原始的な毛細血管叢がヒドロゲルに見えるようになります。コンフォーカル顕微鏡上で固定、染色、細胞を含んだヒドロゲルをイメージングした後、事前処理された画像は、ネットワークの全長および接続性の分析を可能にする骨格に変換される。FACSの後に抗生物質を添加することは、この器具の内部を殺菌することは困難であり、細胞カプセル化の24時間後に抗生物質を除去することが不可欠である。この技術を用いて、生体材料を模倣する細胞外マトリックスがiPSC由来の内皮前駆物質の血管原性ポテンシャルを支配する物理的および化学的特性を決定することができた。

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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胸腺の特性を用いてマウス胚における前駆細胞をセトリング<em&gt;インビボ</em&gt;と<em&gt;インビトロ</em&gt;アッセイ

学ぶiPSC由来内皮前駆細胞の血管新生能評価法。3Dコラーゲン封入と計算解析パイプラインにより、心血管疾患治療と疾患モデリングのための機能性血管構築に関する知見を得られます。

iPSC由来内皮前駆体の血管学的電位を定量化するインビトロ3Dモデルと計算パイプライン

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