マルチ深円形の断面内皮マイクロチャンネル·オン·ア·チップの開発のための手順

この手順の全体的な目標は、in vivo、微小血管の3D形状を模倣し、制御された連続増殖流下で動作する、チップ上に多深度の円形断面内皮生命マイクロチャネルを開発することです。これは、ポジリフロー可能なフォトレジストを使用して、半円形の断面マイクロチャネルネットワークを持つマスターモールドを最初にフォトリソグラフィーで作製することによって達成されます。2番目のステップは、マスターモールドを使用して2つのポリジメチルソーンマイクロチャネルを複製し、それらを整列させて結合し、円筒形のマイクロチャネルネットワークを作成することです。

次に、一次ヒト臍帯静脈内皮細胞をマイクロチャネルネットワーク内に座らせてから、制御された連続培地灌流条件下で4日間から2週間の期間、細胞を培養します。最終的に、顕微鏡下で立っている膜と立っている核によって示される合流細胞単層は、マイクロチャネルネットワークの内面に沿って開発されます 機能的な微小血管の計算 これは、複雑な血管現象の研究のためのプラットフォームを提供できます。しかし、従来のアンソ細胞遊走アッセイ、および2つの形成アッセイ、および右およびモスチックリングアッセイなどの個々のマイクロ血管アッセイは、3次元形状および連続的なフロー制御に関して個々のマイクロ血管を再現することに限定されています。

私たちの技術、つまり既存の微細加工法の主な利点は、丸みを帯びた断面を持つin vivoマイクロ血管の複雑な3D形状を模倣した多深度マイクロ流体チャネルネットワークを従来から製造できることです。また、微小血管生体磁気システムを設計することも可能にし、流体の流れを必要なレベルに維持することで、全体的なチャネル抵抗力が低くなり、失われた流れがネットワーク全体でより均一になることを示しています。この手順は、テキストプロトコルに詳述されているように、直径が30ミクロンから60ミクロンのマイクロチャネルからなるフォトレジストマスターモールドの作製から始まり、使用の24時間前にリフローフォトレジストを4°Cの冷蔵庫からクリーンルームに短時間移し、室温まで温めます。

まず、テキストプロトコルの手順に従って、ポジリフローフォトレジスト層をプレクリーニングシリコン基板上にスピンコーティングします。次に、パターン化されたマイクロチャネルを現像する前に、パターン化されたマスクを介してフォトレジストをUV光にさらします。最後に、リフロー後、半円形の断面マイクロチャネルネットワークを作成します。

マスターモールドの準備ができたら、ポリメチルソーンまたはPDMS溶液を硬化剤に対して10対1塩基の重量比で調製し、遊星遠心ミキサーを使用して十分に混合します。PDMS溶液をリフローしたフォトレジストマスターモールドにキャストします。キャストしたPDMSを乾燥剤に15分間置き、ドガします。

必要に応じて、窒素ガスを使用して残っている気泡を取り除きます。PDMSを60°Cのオーブンで3時間焼き、硬化させます。次に、硬化したPDMS層をマスターモールドから取り外します。

鋭利なパンチャーを使用して、チャネルネットワークに穴を開けて入口と出口の穴を作成します。窒素ガスを使用してPDMSの表面を清掃します。2つのPDMS層を酸素プラズマで30秒間、プラズマクリーナー内で45ミリトの動作圧力と毎分3.5立方フィートの酸素流量で処理します。

次に、光学顕微鏡でPDMSの表面を手動で位置合わせします。アライメントをより適切に制御するために、必要に応じて一滴の水を使用してください。最後に、デバイスを摂氏60度のオーブンで30分間焼き、永久的な接着培養を実現します。

初代ヒト臍帯静脈内皮細胞またはVEとL-グルタミンを10%ウシ胎児血清を添加した培養培地。装置を酸素プラズマで5分間処理し、動作圧力45ミリット、酸素流量3.5立方フィート/分で行います。次に、デバイスに脱イオン水を入れ、層流バイオセーフティフードでUV光で8時間処理して滅菌します。

細胞の準備が整う1日前に、1 x リン酸緩衝生理食塩水またはPBSでデバイスを洗浄し、フィブロネクチンでコーティングします。4°Cの冷蔵庫で一晩インキュベートします。細胞がコンフルエントになったら、まずヒープ緩衝生理食塩水で細胞をすすぎ、次にトリプシンの添加後にトリプシンEDTAで細胞を処理し

細胞を摂氏37度で2〜6分間インキュベートします。トリプシンの投与が完了したら、トリプシンEDTAをトリプシン中和液で中和します。細胞を数え、その後、蘇生する前に遠心分離します。

8%デキストリンデキストリンを含む培養培地での懸濁は、培地の粘度を上げるために使用され、FI enc ENCコーティングに続く細胞の着座と付着を改善します。デバイスを1つのXPBSで洗浄し、培地をデバイスにロードしてから、摂氏37度の温度で15分間インキュベートします。次に、8%デキストリン培地中の細胞を1ミリリットルあたり300万から400万個の濃度で装置にロードします。

デバイスの1つの入口に20マイクロリットルの細胞滴を置き、それを傾けて細胞をマイクロ流体チャネルに導入します。15〜20分後、セルはチャネルの側壁に付着し始めます。デバイスを15分ごとに回転させて、セルの分布をより均一にします。

必要に応じて、追加のロードを実行できます。5〜6時間の静止培養後、付着した細胞は完全に広がり始めます。1時間あたり10マイクロリットルの安定した流量のリモートコントロールシリンジポンプシステムを使用して長期灌流を設定すると、灌流はより高い流量に調整でき、4日間から2週間の期間続くことができます。

細胞がデバイス内で合流点に達したら、まず、デバイスを1つのXPBSで洗浄して、培地を完全に除去します。次に、室温で5分間暗所でデバイスをインキュベートした後、希釈した赤色の染料をデバイスにロードします。培地で洗って汚れを止めます。

色素のインキュベーションが長いと、細胞毒性や接着不良を引き起こす可能性があります。次に、1つのXPBSで希釈した青色の染料をデバイスにロードし、室温で5分間暗所でインキュベートしてから、1つのXPBSでデバイスを十分に洗浄します。倒立型光学顕微鏡で細胞の染色を観察します。

染色が良好な場合は、マイクロチャネルに固定媒体をロードし、デバイスを固定媒体に浸し、アルミホイルで完全に覆います。デバイスが乾燥して漂白するのを防ぐために、デバイスを摂氏4度の温度で冷蔵庫に保管すると、固定デバイスは、レーザー走査型共焦点顕微鏡、走査型電子顕微鏡、光学顕微鏡で行うことができる共焦点イメージングの準備が整いました。リフローフォトレジストと、リフロー進行前後の複製されたPDMSチャネルの特性評価に使用しました。

ここでは、PDMSマイクロチャネルネットワークの幾何学的特徴を特徴付け、示しました。PDMS金型の円形断面は、各分岐レベルでのチャネル寸法を示しています。その結果、フォトレジストリフロー法は、フォトレジストリフロー法により、より簡便なアプローチで多深度分岐チャネルネットワークを作製でき、微小血管の生体模倣システムの設計が可能になることが示されました。これは、赤色の蛍光細胞膜色素と青色の細胞核色素を用いた顕微鏡画像で示されているマレーの法則にほぼ従っています。

円形の断面図から、VEは円筒形のマイクロチャネルネットワークの内面を異なる分岐領域で裏打ちしていることが明らかになりました。in vivoの微小血管系は複雑な形状であるため、これらの小さな血管のリアルタイムモニタリングは困難です。開発されたP DM Sベースのチップは、良好な光学特性を提供し、この円形チャネルネットワークに沿った細胞ライニングの共焦点動画に示されているように、内皮マイクロチャネルの高品質でリアルタイムのイメージングを可能にします。

このビデオを見れば、このマス モードのリフローを作成する方法を十分に理解できるはずです。円形の断面PDMSマイクロチャネルネットワークを作成し、エンドセル細胞をデバイスにロードし、長期の培地増殖を設定します。要約すると、開発されたチップ上のエンド直列化マイクロチャネルは、InVivoマイクロ血管の形状を模倣した円形の断面マルチデプスマイクロチャネルネットワークを作成するための迅速で再現性のあるアプローチを提供します。

この手順は、高度なマイクロ製造およびマイクロ食品技術の独自の機能を使用して、長期の連続灌流制御を備えた微小血管モデルを作成するとともに、細胞生物学、組織工学、および生物工学アプリケーションのためのマイクロ食品チャネルの有用性が高まることで、高品質でリアルタイムのイメージング機能を作成する方法を示しています。エンドのシリアル化されたチップ上のマイクロチャネルは、微小血管研究の潜在的なエッセイです。