Name: マルチ深円形の断面内皮マイクロチャンネル·オン·ア·チップの開発のための手順 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-21T19:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: 学ぶ マイクロ流体チップ上の多層円形断面内皮マイクロチャネル作製法。PDMS複製と連続灌流培養により、ヒト臍帯静脈内皮細胞を用いて生体内微小血管の3D構造を再現し、リアルタイムイメージングで複雑な血管現象を解析する革新的プラットフォームを構築します。

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本研究の一部は全米科学財団（NSF 1227359）、国立科学財団（EPS-1003907）、それぞれ国立科学財団（1007978）、およびWVU PSCoR、主催WVUのADVANCEオフィスによって資金を供給WVU EPSCoRプログラムによってサポートされていました。微細加工作業はWVU共用研究設備（クリーンルーム施設）とウェストバージニア大学のチップ研究所（マイクロチップラボ）でマイクロ流体統合セルラー研究で行われていた。共焦点イメージングは​​WVU顕微鏡イメージング施設で行われた。

1。フォトレジストマスターモールドのフォトリソグラフィ作製次のプロトコルは30-60ミクロンの直径とマイクロチャネルを作製するためのプロセスを示しています。小径（30μm未満）とマイクロチャネルを取得するには、フォトレジストのシングルスピンコーティングが必要とされている。 <ol><li>使用前に24時間クリーンルームに4℃で冷蔵庫からリフローフォトレジストを転送し、室温まで昇温することができます。 </li><li>シリコンウェハをきれいにし、それを脱水できるように150℃で1時間のためにそれを焼く。脱水は、シリコン基板上にフォトレジストの密着性を支援する。 </li><li>スピンコート次のレシピを使用してフォトレジストの第一層： </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> 手順 </td><td> 時間（秒） </td><td> 回転数（rpm） </td><td> 加速 </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 2 &lt;/ TD&gt; <td> 300 </td><td>最高</td></tr><tr><td> 2 </td><td> 10 </td><td> 0 </td><td></td></tr><tr><td> 3 </td><td> 3 </td><td> 300 </td><td>最高</td></tr><tr><td> 4 </td><td> 60 </td><td> 600 </td><td>最高</td></tr><tr><td> 5 </td><td> 10 </td><td> 500 </td><td>最高</td></tr><tr><td> 6 </td><td> 10 </td><td> 600 </td><td>最高</td></tr></tbody></table><ol start="4"><li>その後、90秒110°Cの温度にホットプレート上でウェーハを焼く。ソフトベーク後のフォトレジストの厚さは20〜30程度になります。 </li><li>コー​​トの第一層に使用されるのと同じレシピに続く第2のフォトレジスト層をスピン。 </li><li>ソフトベーク90秒110°Cの温度にホットプレートの上に置くことによって、再びウェハ。このソフトベーク後のフォトレジストの厚さは40〜60程度になります。 </li><li> photor露光することによって正のマスターパターンを生成フィルムマスクを介し14,500 mJの個/ cm 2の露光量でUV光にesist。 </li><li>脱イオン（DI）水（1:2（v / v）の）で現像剤を希釈する。パターンが完全に開発されるまで、溶液中で繰り返しウエハを洗浄します。次いでDI水でウエハーを洗浄し、窒素ガスを用いて乾燥させる。 </li><li>リフロー：4分と溶媒の蒸発を防ぐために、ガラスのペトリ皿とカバーのため120°Cの温度にホットプレートの上に置き、ウェハを。ホットプレートからウェハを取り出し、それを室温まで冷却することができます。リフロー後のフォトレジストの厚さは50〜60程度になります。 </li></ol> 2。 PDMSマイクロチャネルネットワークのソフトリソグラフィーの作製<ol><li> 10:1の重量比（ベース：硬化剤）で、ポリジメチルシロキサン（PDMS）溶液を調製し、それを徹底的に自転·公転ミキサーを使って混ぜる。 </li><li>リフローされたフォトレジストマスターモールド上にPDMSソリューションをキャスト。ドガに15分間デシケーター中でキャストPDMSを置き。必要に応じて残りの気泡を除去するために窒素ガスを使用してください。 </li><li>それを治すために可能にするために3時間60°Cの温度でオーブンでPDMSを焼く。その後、マスターモールドから硬化PDMS層を除去。 </li><li>チャネルネットワークに穴をパンチすることにより入口/出口の穴を作成するために削っパンチャーを使用します。窒素ガスを用いたPDMSの表面を清掃してください。 </li><li> 4.5×10 -2トルの動作圧力でのプラズマクリーナーおよび3.5立方フィート /分の酸素流量内側に30秒間酸素プラズマを持つ2つのPDMS層を扱う。その後、光学顕微鏡下で手動でPDMSの表面を合わせます。アライメントのよりよい制御のために必要に応じて水を一滴も使用します。 </li><li>永久的な結合を実現するために30分間60℃のオーブンでデバイスを焼く。 </li></ol> 3。チップでHUVEC文化と種まき<ol><li>培養はL-グルタミンを有する培養培地でHUVECを、10％ウシ胎児血清（FBS）を補充した。目のために2〜5の電子実験通路を使用した。 </li><li> HUVECをが合流したら、37℃で2-6分間細胞をカウントし、最初のHEPESは（HEPES-BSS）緩衝生理食塩水で細胞を洗浄することによって、それらを収穫した後、トリプシン/ EDTAとインキュベートで細胞を扱うトリプシン処理が完了した後、トリプシン溶液で中和トリプシン/ EDTAを中和する。遠心分離し、それらを収集するために8％のデキストランを培養培地で細胞を懸濁する。デキストランは、良好な細胞播種や添付ファイルを助けるために媒体の粘度を増加させるために使用した。 </li><li> 5 4.5×10 -2トルの動作圧力とminと3.5の酸素流量フィート3 /分酸素プラズマでデバイスを扱う。その後、DI水でデバイスをロードし、殺菌のために層流バイオセーフティーフード内で8時間紫外線を扱う。 </li><li>細胞は準備ができて一日前に、1×リン酸塩を使用してデバイスを洗うフィブロネクチン（は100μg/ mlの、希でコート後、（1×PBS）緩衝生理食塩水1×PBSで貢献しました）、4℃で一晩冷蔵庫でインキュベート。 </li><li>フィブロネクチンコーティングした後、培養液でロードし1×PBSでデバイスを洗う。 15分間37℃の温度でデバイスをインキュベートする。 </li><li> 3-4×10 6細胞/ mlの細胞濃度を8％デキストラン培地でHUVEC細胞をロードする。デバイスの一つの入口で細胞20μlの液滴を置き、マイクロ流体チャネルに細胞を導入することを傾ける。 15-20分後、細胞は、チャネルの側壁に付着するために開始されます。デバイスの細胞のより均一な分布を作成するために15分毎に回転させます。必要に応じて、追加のローディングを行うことができる。 </li></ol> 4。長期灌流セットアップ静置培養の5-6時間後、添付されたHUVECを、完全に広げ始めます。 10μlの/時の定常流とリモコンシリンジポンプシステムを用いた灌流を設定します。灌流をfを調整することができる以上の流量、及び2週間〜4日の間の期間続くことができます。 5。細胞染色と顕微鏡の特性<ol><li>細胞はデバイス内部合流に到達すると、まず、徹底的にメディアを削除するには、1×PBSでデバイスを洗う。その後、希釈剤（4μL-1 ml）で希釈した赤色染料を使用してデバイスをロードします。セルローディング手順と同様の染料をロードします。室温で5分間、暗所で装置をインキュベートした後、染色を停止する培養液で装置を洗浄する。染料の長いインキュベーションは、細胞毒性とdisadhesionを引き起こす可能性があります。 </li><li> 1×PBS（1mL当たり2滴）で希釈し、青色色素をデバイスにロードします。室温で5分間、暗所でインキュベートし、その後完全に1×PBSで装置を洗浄する。 </li><li>倒立光学顕微鏡下で細胞染色を調べます。染色が良好であった場合は、（1×PBSで希釈した3.5％パラホルムアルデヒド）固定培地でマイクロチャネルをロード、その後水没培地と完全にアルミホイルでそれをカバーを固定でデバイス。 4℃の温度で冷蔵庫でデバイスを保管℃で乾燥し、退色からデバイスを防ぐことができます。固定デバイスは共焦点レーザ走査型顕微鏡によって行うことができる共焦点イメージングのための準備ができている。 </li></ol>

著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

<html> 1。マスターモールドの製造血管の形態計測のために設計し、指針の一つは、ネットワーク全体に血管径の分布は最小エネルギー配慮によって支配されていることを述べているマレーの法則16、として知られています。また、分岐で親血管の直径のキューブが娘血管の直径の立方体の和に等しいと述べている（ <img alt="式（1）" fo:content-width="0.9in" fo:src="/files/ftp_upload/50771/50771eq1.jpg" src="/files/ftp_upload/50771/50771eq1.jpg" width="100px" />なお）19、ポアズイユの法則は以下のように脈管構造のほとんどでせん断応力の大きさを推定するために使用されている<img alt="式（2）" fo:content-width="0.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50771/50771eq2.jpg" src="/files/ftp_upload/50771/50771eq2.jpg" ...

循環系の一部として微小血管は、血液や組織の間の相互作用を媒介する、代謝活動を支援し、組織微小環境を定義し、多くの健康および病理学的条件において重要な役割を果たす。 in vitroでの機能的な微小血管の要約は、複雑な血管現象の研究のためのプラットフォームを提供することができます。しかしながら、このような内皮細胞の遊走アッセイ、内皮管形成アッセイ、およびラットおよびマウス大動脈輪アッセイなどのインビトロ微小血管アッセイ、従来の三次元（3D）ジオメトリおよび連続フロー制御に対してインビボ微小血管に再現することができない1-8。このような角膜血管新生アッセイ、ニワトリ絨毛尿膜血管新生アッセイ、およびマトリゲルプラグアッセイなどの動物モデルおよびin vivoアッセイを使用して、微小血管の研究は、多くの時間がかかり、コストが高く、観察や数量化に関して挑戦、および倫理的な問題1、9-13を上げる。 持っていないでしょうな、簡単かつ厳密に制御生物学的条件と動的流体環境などの研究14、、動物とし、 生体内での関連する高い実験的なコストと複雑さを節減しながらmicromanufacturingとマイクロ流体チップ技術の進歩は、生物医学科学の洞察の様々を有効にしている従来のマクロスケールの技術で可能であっ。 ここでは、 生体内微小血管内の3Dジオメトリを模倣し、フォトリソグラフィリフローフォトレジスト技術、ソフトリソグラフィー、マイクロフルイディクスとの組み合わせを使用して管理された連続的な灌流の流れの下で実行され内皮マイクロチャネルオンチップを構築するためのアプローチを提示する。

<table><tbody><tr><td>試薬/材料</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>リフロー フォトレジスト</td><td>AZ エレクトロニック・マテリアル</td>ズ <td>AZP4620</td><td></td></tr><tr><td>現像液</td><td>AZ エレクトロニック・マテリアル</td><td>ズ AZ 400K</td><td></td></tr><tr><td>PDMS</td><td>ダウ・コーニング・コーポレーション</td><td>シルガード 184</td><td></td></tr><tr><td>MCDB 131 培地</td><td>Invitrogen</td><td>10372-019</td><td></td></tr><tr><td>NacBlue 核染色</td><td>Invitrogen</td><td>H1399</td><td></td></tr><tr><td>PKH Red Stain</td><td>Sigma</td><td>MINI26 and PKH26GL</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>Gibco</td><td>PHE0023</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Sigma</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水</td><td>Invitrogen</td><td>14040-133</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 緩衝生理食塩水</td><td>Lonza</td><td>CC-5024</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン/EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25300-062</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン中和液</td><td>ロンザ</td><td>CC-5002</td><td></td></tr><tr><td>PDMS 硬化剤</td><td>ダウ コーニングコーポレーション</td><td>シルガード 184</td><td></td></tr><tr><td>初代ヒト臍帯静脈内皮細胞</td><td>ロンザ</td><td>CC-2517</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>ロンザ</td><td>14-501F</td><td></td></tr><tr><td>希釈剤 C</td><td>Sigma</td><td>CGLDIL</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst33342</td><td>Invitrogen, Molecular Probes</td><td>R37605</td><td></td></tr><tr><td>Dextran</td><td>, Sigma</td><td>95771</td><td></td></tr><tr><td>3.5% パラホルムアルデヒド電子</td><td>顕微鏡 Science</td><td>15710-S</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spinner</td><td>Laurell Technologies Corporation</td><td>WS-400BZ-6NPP/LITE</td><td></td></tr><tr><td>デシケーター</td><td>BelArt 製品</td><td>999320237</td><td></td></tr><tr><td>倒立顕微鏡</td><td>ニコン</td><td>エクリプス Ti</td><td></td></tr><tr><td>シリンジポンプシステム</td><td>ハーバード装置</td><td>PHD 超</td><td></td></tr><tr><td>層流 バイオセーフティフード</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td>1300 シリーズ A2</td><td></td></tr><tr><td>プラネタリー遠心ミキサー</td><td>Thinky</td><td>ARE-310</td><td></td></tr><tr><td>Isotemp オーブン</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-246-516GAQ</td><td></td></tr><tr><td>光学顕微鏡</td><td>Zeiss</td><td>Invertoskop 40C</td><td></td></tr><tr><td>プラズマクリーナー</td><td>Harrick プラズマ</td><td>PDC-32G</td><td></td></tr><tr><td>ホットプレート</td><td>バーンステッド / サーモリン Cimarec</td><td>SP131635</td><td></td></tr><tr><td>レーザー走査型共焦点顕微鏡</td><td>Zeiss</td><td>LSM 510</td><td></td></tr></tbody></table>

マルチ深円形の断面内皮マイクロチャンネル·オン·ア·チップの開発のための手順

Procedure for the Development of Multi-depth Circular Cross-sectional Endothelialized Microchannels-on-a-chip

インビボでの動物実験は、より時間がかかり、高価であり、観察および定量は非常に挑戦的であるための努力が微小血管の研究のためのin vitroアッセイの開発に焦点を当ててきた。 3次元（3D）ジオメトリに対してインビボ微小血管に表現し、連続的な流体の流れを提供する場合しかし、微小血管ビトロアッセイにおける従来は限界がある。フォトリソグラフィリフローフォトレジスト技術、ソフトリソグラフィー、マイクロフルイディクスとの組み合わせを使用して、我々は管理された連続灌流下で生体内微小血管および実行中の3Dジオメトリを模倣マルチ深円形の断面内皮マイクロチャネルオンチップを開発した流れ。ポジティブフォトレジストをリフロー半円形の断面マイクロチャンネルネットワークにマスターモールドを作製した。 replを2ポリジメチルシロキサン（PDMS）マイクロチャネルの整列及び接合によるマスター型からicated、円筒マイクロネットワークが作成されました。マイクロチャネルの直径は十分に制御することができる。また、チップ内部で播種し、一次ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）は、細胞は4日〜2週間の間の時間期間の持続的な制御の下で灌流マイクロチャンネルの内面を内張りすることを示した。

マルチデプスマイクロチャネルネットワークを製造する当社のアプローチは、マイクロチャネルは、クロスセクション15を丸めていた、 生体内微小血管内の複雑な3D形状を模倣しています。さらに、チャネルと娘チャネルを分岐親の直径はおよそ全体のチャネル抵抗が低く、流動速度がネットワーク16-18全体より均一であるように要求されるレベルで流体の流れを維持するためにマレーの法則に従う。半円フォトレジストマスターモールドと円形の断面PDMSマイクロチャネルネットワークを製造するためのプロセス及び結果を、それぞれムービー1、図2、およびムービー2で実証された。 PDMSマイクロチャンネル網の幾何学的特徴は、特徴および図2に示した。我々の結果は、フォトレジストのリフロー技術はマルチデプス分岐チャネル·ネットワークを作成できることを示している私NAより便利レジストリフロー技術によるアプローチ、および約マレーの法則に従う微小バイオミメティックシステムを設計することができます。 </p...

マイクロチャネル·オン·チップ·プラットフォームは、フォトリソグラフィリフローフォトレジスト技術、ソフトリソグラフィー、マイクロフルイディクスとの組み合わせによって開発されました。内皮マイクロチャネルプラットフォームは、 インビボにおける微小血管の3次元（3D）ジオメトリを模倣する制御された連続かん流の流れの下で実行され、高品質かつリアルタイムイメージングを可能にし、微小血管の研究に適用することができる。

Efforts have been focused on developing in vitro assays for the study of microvessels because in vivo animal studies are more time-consuming, expensive, ...

この手順の全体的な目的は、生体内の微小血管の3D幾何学的構造を模倣し、制御された連続灌流フロー下で動作する、多深度の円形断面を持つ内皮細胞マイクロチャネル・オン・チップを開発することです。これは、まずポジ型のリフロー可能なフォトレジストを用いて、半円形断面のマイクロチャネルネットワークを持つマスターモールドをフォトリソグラフィで作製することによって達成されます。第2のステップでは、このマスターモールドを使用して2つのポリジメチルシロキサンマイクロチャネルを複製し、それらを整合させて接合することで、円筒形マイクロチャネルネットワークを構築します。次に、ヒト臍帯静脈内皮細胞（primary human umbilical vein endothelial cells）をマイクロチャネルネットワーク内に播種し、制御された連続培地灌流条件下で4日間から2週間の期間、細胞を培養します。最終的に、顕微鏡下で細胞膜と核が確認できるコンフルエントな細胞単層がマイクロチャネルネットワークの内表面に形成され、複雑な血管現象の研究プラットフォームとなる機能的な微小血管が構築されます。しかし、細胞遊走アッセイ、管腔形成アッセイ、あるいはリングアッセイなどの従来の個別の微小血管アッセイでは、三次元的な形状および連続的なフロー制御に関して、個々の微小血管を再現することに限界があります。我々の既存の微細加工法による手法の主な利点は、断面が円形である生体内の微小血管の複雑な3D幾何学的構造を模倣した、多深度のマイクロ流路ネットワークを従来の手法で作製できることです。また、この手法により、より緩やかな流れに従い、かつ流体フローを必要レベルに維持できる微小血管バイオ磁気システムの設計が可能となり、チャネル全体の抵抗を低く抑え、ネットワーク全体でより均一な流れを得ることができます。本手順のデモンストレーションは、私の研究室の大学院生が行います。この手順は、テキストプロトコルに詳述されている通り、直径30 $\mu\text{m}$から60 $\mu\text{m}$のマイクロチャネルで構成されるフォトレジストのマスターモールドの作製から始まります。簡潔に述べると、使用する24時間前に、リフロー用フォトレジストを4 $\text{°C}$の冷蔵庫からクリーンルームへ移動させ、室温まで昇温させます。まず、テキストプロトコルの手順に従い、事前に洗浄したシリコン基板上にポジ型リフローフォトレジスト層をスピンコートします。次に、パターンマスクを通してフォトレジストにUV光を露光し、パターン化したマイクロチャネルを現像します。最後に、リフロー処理を行うことで、半円形の断面を持つマイクロチャネルネットワークを作成します。マスターモールドが完成したら、ベースと硬化剤の重量比を10:1としてポリメチルシロキサン（PDMS）溶液を調製し、プラネタリー遠心ミキサーを用いて十分に混合させます。リフロー処理を施したフォトレジストマスターモールド上にPDMS溶液をキャストします。キャストしたPDMSをデシケーターに入れ、15分間脱気させます。必要に応じて、窒素ガスを使用して残っている気泡を除去します。PDMSを60 °Cのオーブンで3時間加熱し、硬化させます。その後、硬化したPDMS層をマスターモールドから取り出します。鋭利なパンチャーを用いて、流路ネットワークに穴を開け、入口と出口の穴を作成します。窒素ガスを使用してPDMSの表面を洗浄します。プラズマクリーナー内で、動作圧力45 milato、酸素流量3.5 cubic feet per minuteの条件下で、2枚のPDMS層を30秒間酸素プラズマ処理します。次に、光学顕微鏡下でPDMSの表面を手動で合わせます。位置合わせをより正確に行う必要がある場合は、水滴を使用してください。最後に、デバイスをオーブンにて60°Cで30分間加熱し、恒久的な接合を実現させます。10%胎児牛血清を添加し、L-glutamineを補った培地で培養した初代ヒト臍帯静脈内皮細胞（VE）を使用します。動作圧力45 milit、酸素流量3.5 cubic feet per minuteの条件下で、デバイスを5分間酸素プラズマ処理します。その後、デバイスに脱イオン水を充填し、滅菌のためラミナーフローバイオセーフティキャビネット内で8時間UV照射します。細胞の準備が整う前日に、デバイスを1x リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で洗浄し、フィブロネクチンでコーティングします。4°Cの冷蔵庫で一晩インキュベートしてください。細胞がコンフルエントになったら、まず細胞をHEPES緩衝生理食塩水でリンスし、次にトリプシンを添加してトリプシン-EDTAで処理し、細胞を回収します。細胞を37 °Cで2〜6分間インキュベートします。トリプシン処理が完了した後、トリプシン中和溶液を用いてトリプシンEDTAを中和します。細胞数をカウントし、再懸濁させる前に遠心分離を行います。8%デキストリンを含む培地での懸濁は、培地の粘性を高め、FI ENCコーティング後の細胞の沈降と接着を促進するために行われます。デバイスを1回のXPBSで洗浄した後、培地を充填し、37 °Cで15分間インキュベートします。次に、3〜4 million cells/mLの濃度で8%デキストリン培地に懸濁した細胞をデバイスにロードします。デバイスの一方の入口に20 µLの細胞懸濁液を滴下し、デバイスを傾けて細胞をマイクロ流路内に導入します。15〜20分後、細胞が流路の側壁に接着し始めます。細胞をより均一に分布させるため、15分ごとにデバイスを回転させます。必要に応じて、追加の播種を行うことができます。5〜6時間の静置培養後、接着した細胞は十分に広がります。遠隔操作可能なシリンジポンプシステムを用いて、10 µL/hの一定流量で長期灌流を設定します。灌流はより高い流速に調整することが可能であり、4日間から2週間の期間で実施できます。デバイス内で細胞がコンフルエントになったら、まず、1回分のXPBSでデバイスを洗浄し、培地を完全に除去します。次に、デバイスを室温の暗所で5分間インキュベートした後、希釈した赤色染料をロードします。最後に、培養培地で洗浄して染色を停止させます。染料の長時間インキュベーションは、細胞毒性や剥離を引き起こす可能性があります。次に、1×PBSで希釈した青色染料をデバイスに充填し、室温・暗所にて5分間インキュベートした後、1×PBSでデバイスを十分に洗浄します。倒立光学顕微鏡を用いて、細胞の染まり具合を確認してください。染色状態が良好であれば、マイクロチャネルに固定液を注入し、次にデバイスを固定液に浸し、アルミホイルで完全に覆います。デバイスの乾燥を防ぐため、4°Cの冷蔵庫で保管してください。固定したデバイスはこれで共焦点イメージングが可能な状態となり、レーザースキャニング共焦点顕微鏡、走査電子顕微鏡、および光学顕微鏡を用いて観察できます。これらの手法を用いて、リフロー前後のフォトレジストおよび複製されたPDMSチャネルの特性評価を行いました。PDMSマイクロチャネルネットワークの幾何学的特徴を評価し、ここに示した。PDMSモールドの円形断面により、各分岐レベルにおけるチャネル寸法が示されている。結果から、フォトレジストリフロー法を用いることで、より簡便な手法で多深度の分岐チャネルネットワークを構築でき、ここに示すMurrayの法則に近似して設計された微小血管バイオミメティックシステムの作製が可能であることが分かった。なお、ここでは赤色の蛍光細胞膜染料と青色の細胞核染料を用いた顕微鏡画像を示している。円形断面図により、VEが異なる分岐領域において円筒形マイクロチャネルネットワークの内表面に沿って並んでいることが明らかになりました。生体内の微小血管は複雑な幾何学的構造を持つため、これらの微小血管をリアルタイムでモニタリングすることは困難です。開発されたPDMSベースのチップは優れた光学特性を備えており、この円形チャネルネットワークに沿った細胞層の共焦点動画に示されているように、内皮マイクロチャネルの高画質かつリアルタイムなイメージングを可能にします。このビデオを視聴することで、このマスモードの回路作製方法について十分に理解できるはずです。円形断面のPDMSマイクロチャネルネットワークを作製し、デバイスに内皮細胞を導入して、長期的な培地灌流をセットアップします。要約すると、チップ上に構築された内皮直列マイクロチャネルは、生体内の微小血管の形状を模倣した、円形断面の多深度マイクロチャネルネットワークを迅速かつ再現性よく作製するためのアプローチを提供します。本手順では、高度なマイクロ製造およびマイクロフーディック技術の独自の機能を活用し、長期的な連続灌流制御が可能な微小血管モデルを構築する方法を示します。また、細胞生物学、組織工学、およびバイオエンジニアリングへの応用において有用性が高まっているマイクロフーディックチャネルを用いた、高品質なリアルタイムイメージング機能についても解説します。チップ上のエンドセリアライズド・マイクロチャネルは、微小血管研究における有望なアッセイとなり得ます。

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

我々は、マイクロバイオリアクターにおける細胞の三次元培養のためのチップベースのプラットフォームについて説明します。一つのチップは10ミオまで収容することができる。流体の流れに関しては正確に定義された条件下で培養することができる細胞、滅菌、閉鎖循環ループ内の酸素分圧など。...

灌流マイクロバイオリアクターのチップベースの三次元細胞培養

微小サイズのチャネル（&lt;30μm）を持つマイクロ流体デバイスの全体の内部の三次元表面全体に文化内皮細胞単層をに方法が記載されています。この...

血液疾患における血管相互作用を研究するためのEndothelializedマイクロフルイディクス

フォトリソグラフィ法によりエッチングし、PDMSから製造されるマイクロ流体フローチャンバーは、EC機能不全や炎症に関連付けられた機能的転帰を調べるために適用されます。代表的な実験では、EC単層を活性化サイトカインの単球の細胞接着を調節する差動せん断応力の能力が実証されています。...

オンチップ·血管内皮の炎症性表現型

一次元閉じ込められた微小環境における細胞の自発的な遊走を研究するための定量的方法が記載されている。この方法は、微細加工されたチャネルを利用し、単一の実験では、異なる条件下で多数の細胞の遊走を研​​究するために使用することができる。...

微細加工チャネルにおける細胞移動の研究

この文書では、内皮下電気抵抗 (TEER) の直接定量の統合された電極を用いた臓器のオンチップ デバイスの作製について説明します。検証、このマイクロ流体デバイス内部の血液-脳関門をまねて、そのバリア機能をモニターしていた。電極の統合及び直接 TEER...

作製と内皮下電気抵抗を直接定量化する統合型電極を用いたオンチップ器官システムの検証

ポリジメチルシロキサン マイクロ流体デバイスに埋め込まれた非長方形断面のチャンネルの作製には、いくつかの方法があります。それらのほとんどは、多段階の製造と広範な配置を含みます。本稿でワンステップ アプローチはポリジメチルシロキサン シーケンシャル ウェット エッチングによって異なる幾何学的な断面のマイクロ...

ワンステップ連続湿式エッチング法によって異なる幾何学的なセクションのポリジメチルシロキサン マイクロ流路の加工方法

ここでは、伸縮性、デュアル チャネルの作製、臓器レベルの機能体外の概説のため器官チップ マイクロ細胞培養装置を記述するプロトコルを提案する.

伸縮性、デュアル チャネル、オルガン マイクロ流体チップのスケーラブルな作製

ここでは、マイクロ流体チップと、新生血管形成の初期微小環境を再現する、自動制御された高効率循環マイクロ流体システムを提供し、高い発光せん断応力、経経皮流の生理学的レベル、および様々な血管内皮成長因子(VEGF)分布によって内皮細胞(ECs)を同時に刺激することを可能にする。...

新血管新生初期事象を模倣する微発性モデル

ここでは、マイクロマシンマイクロ流体プラットフォームを用いて、3次元の簡易および未分化皮膚モデルを生成するプロトコルを提示する。平行流アプローチは上の上の上皮細胞の播種のための真皮のコンパートメントの その場の 堆積を可能にし、すべてシリンジポンプによって制御される。...

マイクロマシンマイクロ流体プラットフォームにおける簡単な3次元スキンオンチップモデルの生成

このプロトコルでは、生理学的に関連する微小血管環境を再現し、白血球接着/遊走カスケード全体を再現することができる生体模倣マイクロ流体アッセイが、炎症性疾患における白血球 - 内皮細胞相互作用を研究するために採用される。...

炎症時の白血球-内皮細胞相互作用を研究するための微生理学的システム

学ぶ マイクロ流体チップ上の多層円形断面内皮マイクロチャネル作製法。PDMS複製と連続灌流培養により、ヒト臍帯静脈内皮細胞を用いて生体内微小血管の3D構造を再現し、リアルタイムイメージングで複雑な血管現象を解析する革新的プラットフォームを構築します。

マルチ深円形の断面内皮マイクロチャンネル·オン·ア·チップの開発のための手順

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