マルチ深円形の断面内皮マイクロチャンネル·オン·ア·チップの開発のための手順

この手順の全体的な目的は、生体内の微小血管の3D幾何学的構造を模倣し、制御された連続灌流フロー下で動作する、多深度の円形断面を持つ内皮細胞マイクロチャネル・オン・チップを開発することです。これは、まずポジ型のリフロー可能なフォトレジストを用いて、半円形断面のマイクロチャネルネットワークを持つマスターモールドをフォトリソグラフィで作製することによって達成されます。第2のステップでは、このマスターモールドを使用して2つのポリジメチルシロキサンマイクロチャネルを複製し、それらを整合させて接合することで、円筒形マイクロチャネルネットワークを構築します。

次に、ヒト臍帯静脈内皮細胞（primary human umbilical vein endothelial cells）をマイクロチャネルネットワーク内に播種し、制御された連続培地灌流条件下で4日間から2週間の期間、細胞を培養します。最終的に、顕微鏡下で細胞膜と核が確認できるコンフルエントな細胞単層がマイクロチャネルネットワークの内表面に形成され、複雑な血管現象の研究プラットフォームとなる機能的な微小血管が構築されます。しかし、細胞遊走アッセイ、管腔形成アッセイ、あるいはリングアッセイなどの従来の個別の微小血管アッセイでは、三次元的な形状および連続的なフロー制御に関して、個々の微小血管を再現することに限界があります。

我々の既存の微細加工法による手法の主な利点は、断面が円形である生体内の微小血管の複雑な3D幾何学的構造を模倣した、多深度のマイクロ流路ネットワークを従来の手法で作製できることです。また、この手法により、より緩やかな流れに従い、かつ流体フローを必要レベルに維持できる微小血管バイオ磁気システムの設計が可能となり、チャネル全体の抵抗を低く抑え、ネットワーク全体でより均一な流れを得ることができます。本手順のデモンストレーションは、私の研究室の大学院生が行います。この手順は、テキストプロトコルに詳述されている通り、直径30 $\mu\text{m}$から60 $\mu\text{m}$のマイクロチャネルで構成されるフォトレジストのマスターモールドの作製から始まります。簡潔に述べると、使用する24時間前に、リフロー用フォトレジストを4 $\text{°C}$の冷蔵庫からクリーンルームへ移動させ、室温まで昇温させます。

まず、テキストプロトコルの手順に従い、事前に洗浄したシリコン基板上にポジ型リフローフォトレジスト層をスピンコートします。次に、パターンマスクを通してフォトレジストにUV光を露光し、パターン化したマイクロチャネルを現像します。最後に、リフロー処理を行うことで、半円形の断面を持つマイクロチャネルネットワークを作成します。

マスターモールドが完成したら、ベースと硬化剤の重量比を10:1としてポリメチルシロキサン（PDMS）溶液を調製し、プラネタリー遠心ミキサーを用いて十分に混合させます。リフロー処理を施したフォトレジストマスターモールド上にPDMS溶液をキャストします。キャストしたPDMSをデシケーターに入れ、15分間脱気させます。

必要に応じて、窒素ガスを使用して残っている気泡を除去します。PDMSを60 °Cのオーブンで3時間加熱し、硬化させます。その後、硬化したPDMS層をマスターモールドから取り出します。

鋭利なパンチャーを用いて、流路ネットワークに穴を開け、入口と出口の穴を作成します。窒素ガスを使用してPDMSの表面を洗浄します。プラズマクリーナー内で、動作圧力45 milato、酸素流量3.5 cubic feet per minuteの条件下で、2枚のPDMS層を30秒間酸素プラズマ処理します。

次に、光学顕微鏡下でPDMSの表面を手動で合わせます。位置合わせをより正確に行う必要がある場合は、水滴を使用してください。最後に、デバイスをオーブンにて60°Cで30分間加熱し、恒久的な接合を実現させます。

10%胎児牛血清を添加し、L-glutamineを補った培地で培養した初代ヒト臍帯静脈内皮細胞（VE）を使用します。動作圧力45 milit、酸素流量3.5 cubic feet per minuteの条件下で、デバイスを5分間酸素プラズマ処理します。その後、デバイスに脱イオン水を充填し、滅菌のためラミナーフローバイオセーフティキャビネット内で8時間UV照射します。

細胞の準備が整う前日に、デバイスを1x リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で洗浄し、フィブロネクチンでコーティングします。4°Cの冷蔵庫で一晩インキュベートしてください。細胞がコンフルエントになったら、まず細胞をHEPES緩衝生理食塩水でリンスし、次にトリプシンを添加してトリプシン-EDTAで処理し、細胞を回収します。

細胞を37 °Cで2〜6分間インキュベートします。トリプシン処理が完了した後、トリプシン中和溶液を用いてトリプシンEDTAを中和します。細胞数をカウントし、再懸濁させる前に遠心分離を行います。

8%デキストリンを含む培地での懸濁は、培地の粘性を高め、FI ENCコーティング後の細胞の沈降と接着を促進するために行われます。デバイスを1回のXPBSで洗浄した後、培地を充填し、37 °Cで15分間インキュベートします。次に、3〜4 million cells/mLの濃度で8%デキストリン培地に懸濁した細胞をデバイスにロードします。

デバイスの一方の入口に20 µLの細胞懸濁液を滴下し、デバイスを傾けて細胞をマイクロ流路内に導入します。15〜20分後、細胞が流路の側壁に接着し始めます。細胞をより均一に分布させるため、15分ごとにデバイスを回転させます。

必要に応じて、追加の播種を行うことができます。5〜6時間の静置培養後、接着した細胞は十分に広がります。遠隔操作可能なシリンジポンプシステムを用いて、10 µL/hの一定流量で長期灌流を設定します。灌流はより高い流速に調整することが可能であり、4日間から2週間の期間で実施できます。

デバイス内で細胞がコンフルエントになったら、まず、1回分のXPBSでデバイスを洗浄し、培地を完全に除去します。次に、デバイスを室温の暗所で5分間インキュベートした後、希釈した赤色染料をロードします。最後に、培養培地で洗浄して染色を停止させます。

染料の長時間インキュベーションは、細胞毒性や剥離を引き起こす可能性があります。次に、1×PBSで希釈した青色染料をデバイスに充填し、室温・暗所にて5分間インキュベートした後、1×PBSでデバイスを十分に洗浄します。倒立光学顕微鏡を用いて、細胞の染まり具合を確認してください。

染色状態が良好であれば、マイクロチャネルに固定液を注入し、次にデバイスを固定液に浸し、アルミホイルで完全に覆います。デバイスの乾燥を防ぐため、4°Cの冷蔵庫で保管してください。固定したデバイスはこれで共焦点イメージングが可能な状態となり、レーザースキャニング共焦点顕微鏡、走査電子顕微鏡、および光学顕微鏡を用いて観察できます。これらの手法を用いて、リフロー前後のフォトレジストおよび複製されたPDMSチャネルの特性評価を行いました。

PDMSマイクロチャネルネットワークの幾何学的特徴を評価し、ここに示した。PDMSモールドの円形断面により、各分岐レベルにおけるチャネル寸法が示されている。結果から、フォトレジストリフロー法を用いることで、より簡便な手法で多深度の分岐チャネルネットワークを構築でき、ここに示すMurrayの法則に近似して設計された微小血管バイオミメティックシステムの作製が可能であることが分かった。なお、ここでは赤色の蛍光細胞膜染料と青色の細胞核染料を用いた顕微鏡画像を示している。

円形断面図により、VEが異なる分岐領域において円筒形マイクロチャネルネットワークの内表面に沿って並んでいることが明らかになりました。生体内の微小血管は複雑な幾何学的構造を持つため、これらの微小血管をリアルタイムでモニタリングすることは困難です。開発されたPDMSベースのチップは優れた光学特性を備えており、この円形チャネルネットワークに沿った細胞層の共焦点動画に示されているように、内皮マイクロチャネルの高画質かつリアルタイムなイメージングを可能にします。

このビデオを視聴することで、このマスモードの回路作製方法について十分に理解できるはずです。円形断面のPDMSマイクロチャネルネットワークを作製し、デバイスに内皮細胞を導入して、長期的な培地灌流をセットアップします。要約すると、チップ上に構築された内皮直列マイクロチャネルは、生体内の微小血管の形状を模倣した、円形断面の多深度マイクロチャネルネットワークを迅速かつ再現性よく作製するためのアプローチを提供します。

本手順では、高度なマイクロ製造およびマイクロフーディック技術の独自の機能を活用し、長期的な連続灌流制御が可能な微小血管モデルを構築する方法を示します。また、細胞生物学、組織工学、およびバイオエンジニアリングへの応用において有用性が高まっているマイクロフーディックチャネルを用いた、高品質なリアルタイムイメージング機能についても解説します。チップ上のエンドセリアライズド・マイクロチャネルは、微小血管研究における有望なアッセイとなり得ます。