オンチップ·血管内皮の炎症性表現型

このビデオの目的は、内皮細胞の炎症状態を特徴付けるためのラボ・オン・チップ技術を実演することです。まず、ヒト大動脈内皮細胞を組織培養基質上でコンフルエントに増殖させ、次にConanプレートせん断装置に挿入します。細胞は、炎症誘発性サイトカインであるTNFアルファで処理され、同時に、基質の上のコーンの回転を正確に制御することにより、4時間の異なるせん断ストレス条件にさらされ、サイトカインに対する十分に特徴付けられた炎症応答を調節します。

これには、VCA oneやICAM oneなどの接着分子のアップレギュレーションが含まれます。基板は顕微鏡ステージに移され、A-P-D-M-Sマイクロ流体デバイスは単層に直接真空シールされ、流路が形成されます。活性化された単球性、THP 1細胞は、それらが細胞接着分子発現のレベルに比例して結合する前処理されたhs上を飛翔します。

内皮の炎症状態は、THPの総数を定量化することによって決定されます 1つの細胞 しっかりと停止します。こんにちは、私の名前は彼女Dダイバース、グレッグ・フォスターです。そして、私はキース・ベイリーです。

私たちは、カリフォルニア大学デービス校の生物医学工学科の教授、牧師、サイモンの研究室にいます。今日は、内皮機能障害と炎症を定量的に調べるためのラボオンチップベースのアプローチの使用について説明します。これらのツールは、代謝ストレスと流体力学的因子との重ね合わせ、内皮性炎症表現型の調節、およびアテローム性動脈硬化症に対する感受性に関連する研究を実施するためのプラットフォームを提供します。

そのため、私たちはデバイスを血管模倣、マイクロ流体チャンバー、またはvmmcと呼んでいます。これらのデバイスにより、アテローム発生血管の炎症性転帰を模倣した条件下で、内皮細胞および単球の炎症転帰を定量化することができます。VMMCは、供給が限られている可能性のある少量の試薬や材料の使用を容易にします。

また、カスタマイズ可能なレイアウトや形状で構築することもできるため、幅広い用途に非常に適しています。今日は、私たちのラボ・オン・ア・チップ・アプローチを使用した代表的な実験を実演します。ヒト内皮単分子膜は、明確に定義されたせん断応力下でサイトカイン活性化にさらされます。

100ミリメートルの組織培養皿から3インチの円形基質を粉砕する旋盤を使用して内皮活性化の機能的読み出しとして、VMCを使用してヒト単球細胞の単層への動員をリアルタイムで定量化する方法を示します。3インチの基材を蒸留水で洗浄し、70%エタノールに浸して滅菌します。滅菌基質を100ミリメートルのペトリ皿に入れ、乾燥させます。

その後、1型コラーゲンと1ミリリットルあたり100マイクログラムの濃度で室温で1時間インキュベートし、PBSで洗浄します。ヒト大動脈内皮細胞またはHAは、ミリリットルあたり650, 000細胞の濃度で懸濁されています。1ミリリットルの細胞懸濁液を乾燥コラーゲン被覆基質上の液滴中に入れ、均一な懸濁液に広げます。

次に、着座した基質を37度の5%CO2インキュベーターに入れ、基質表面に付着させます。1時間後、E GM 2成長の9ミリリットル、培地を添加し、細胞を約90%Coの流暢さで単層に成長させると、その後の純粋な実験に使用する準備ができています。血管模倣マイクロ流体チャンバーは、所望のチャネルを含むマスターフォーム上にA-P-D-M-Sモールドを流し込むことによって構築されます。幾何学。

シリコーンベースをプラスチック製のウェイボートに注ぎ、続いてシリコーン硬化剤を重量比10対1の比率で注ぎます。PDMSゲルは、ウェイボートの側面をこすらないように注意しながら、よく混合され、それによりプラスチックチップが混合物に導入されます。フォトレジストマスターはヘキサンで洗浄され、VMMCを成形する準備をします。

次に、PDMS混合物をマスターフォームに注ぎ、真空チャンバーに入れます。チャンバー内。空気はPDMS混合物から除去され、15分後に表面に上昇します。

金型をチャンバーから取り出し、PDMS表面に空気をそっと吹き付けて、金型から残っている気泡をパージします。次に、型を覆い、37度のオーブンに1時間入れ、PMSを硬化させます。固化したPDMSゲルをオーブンから取り出し、小さなメスを使用してチャンバーの周囲に円形の切開を行います。

フォトレジスト材料との接触を避けるために、これを徐々に行うことが重要です。これは、マスターモールドを損傷するためです。19ゲージのルアーロックニードルを使用して、各チャネルのモールドパンチ入口ポートと出口ポートからマイクロ流体チャンバーを取り出します。さらに、チャネルから離れた真空管用の穴を開けます。

これで、VMMC の準備は完了です。炎症誘発性サイトカインTNFアルファを6ミリリットルのL 15培地にピペットで移し、最終濃度0.5ナノグラム/ミリリットルを達成します。L 15媒体は、5%CO2の不在下でのpH緩衝能力により、ここではせん断流体として利用されます。

その後、メディアは滅菌済みの10ミリリットルシリンジに引き込まれ、せん断装置をロードするために使用されます。次に、Confluent単分子膜をセルせん断装置に移し、エタノールで滅菌し、コーンギャップ高さを設定します。基板をペトリ皿から取り出し、中央のガラスゲージブロックに置き、コーンがセルの真上にくるようにハウジングチャンバーの底部に慎重に挿入します。

基板は、ゲージブロックの周りにステンレス鋼のネジを均等に締めることによって固定されます。その後、せん断媒体は、気泡が入らないように注意しながらチャンバーに装填されます。次に、コンピューターを使用して目的のせん断応力プログラムを入力し、マイクロセパレートモーターをオンにします。

ここでは、ゼロプラスマイナス5ダイネ/センチメートルの二乗の振動せん断を利用します。4時間後、せん断プログラムは停止します。ゲージブロックを取り外し、基板を慎重にペトリ皿に戻します。

これで、細胞は単球接着アッセイの準備が整いました。せん断の直後に、HA単分子膜はVMMCの組み立てのために顕微鏡ステーションに運ばれます。VMMCはバキュームホースに取り付けられ、DI水に浸されて、チャネル内に閉じ込められた気泡を取り除きます。

真空バルブを最初にオフにした状態で、チャンバーを単層の上に慎重に押し付け、真空バルブのスイッチを入れます。ここでは、チャンバーのチャネル内に気泡が閉じ込められていないことを確認することが重要です。今、カルシウムとマグネシウムとHBSSの80マイクロリットルは、19ゲージのルアーロック針液の先端を切断して作られたリザーバーにピペットで移され、リザーバーの上部をしっかりと押すことによって先端から押し出され、その後、VMMCの入口ポートに挿入されます。

アセンブリ全体が顕微鏡ステージに配置され、顕微鏡カメラとビデオモニターがオンになります。10ミリリットルのガラス製シリンジをシリンジポンプに装填します。次に、シリンジチューブをVMMCの出口ポートに接続します。

流量は、チャネル内で1 dine per cmの二乗の純粋なストレスを誘発し、シリンジがチャネルを介してリザーバから流体を引き込むように補充モードで実行するように設定されています。SDF 1で刺激されたP 1細胞は、1ミリリットルあたり200万個の細胞の濃度で懸濁されます。フロー活性化から2分以内に、50マイクロリットルの細胞懸濁液をリザーバーに加えます。

繰り返しになりますが、流れが完全に発達したときに気泡が入り込まないように注意してください。ビデオは毎秒3フレームでキャプチャされ、データはImageJソフトウェアを使用して列挙されます。弟子。THP 1セルは、10秒間にセルの半分の直径以下を移動することと定義されます。

ここでは、TNF αで刺激され、15 dines per cent mhimd の安定した高壁せん断応力、または振動せん断応力がゼロプラスマイナス 5 dines per センチメートル 2 乗の ha 単分子膜で条件付けされた ha 単分子膜への THP 1 接着を示すデータを示します。今日、私たちは、アテローム性動脈硬化症の根底にある初期の炎症イベントに関する重要な洞察を提供するために組み合わせることができるカスタマイズ可能なin vitro技術の使用を示しています。具体的には、内皮機能障害に関連する結果と、明確に定義された流体力学的条件下で炎症刺激に曝露された細胞を定量化します。

VMM CSを用いることで、内皮と白血球の接着相互作用の根底にある特定のメカニズムを調べることができます。これらのデバイスは、柔軟性があり安価であるという利点もあり、ヒト被験者からの血清由来成分など、供給が制限される可能性のある材料の使用を容易にします。これらのデバイスを適用した私たちの研究には、内皮細胞におけるサイトカイン、脂質、および怒り誘発性炎症の研究が含まれています。

また、複数の白血球タイプや全血の接着メカニズムを調べるオンチップアッセイも開発しました。最終的には、この技術が、炎症媒介性心血管疾患の個人のリスクを評価するためのex vivoアプローチにつながると考えています。