免疫無傷のヒトMUC1トランスジェニックマウスにおける侵襲移行細胞膀胱癌の誘導：免疫療法の開発のためのモデル

N-ブチル-N-（4 - ヒドロキシブチル）ニトロソアミン誘発性膀胱癌モデルは、ヒトムチン-1（MUC1）テストの目的MUC1特異的免疫療法のためのトランスジェニックマウスに開発された。ターゲットMUC1ペプチドワクチンを投与した後、MUC1の細胞傷害性Tリンパ球応答は、血清サイトカインレベルおよびT細胞特異的活性を測定することにより確認した。

次の実験の全体的な目標は、膀胱癌の腫瘍関連抗原を標的とする細胞傷害性Tリンパ球応答を効果的に誘導することです。これは、ヒト腫瘍関連抗原マッハ1を発現するマウスに膀胱癌を誘導することによって達成されます。次に、ペプチドワクチンをマウスに注射し、マッハ1の特異的な細胞傷害性Tリンパ球応答を作製する。

次に、血清腫瘍と脾臓を分離し、組織をそれぞれサイトカイン、抗原、および免疫応答について分析します。ウェスタンブロットマルチプレックス、蛍光測定マイクロビーズ、イムノアッセイ免疫組織化学、およびライブスポット分析を利用することで、膀胱がんに対するペプチドワクチンの有効性を試験することができます。こんにちは、カリフォルニア州サクラメントにあるカリフォルニア大学デービス校ヘルスシステムの研究員、グレゴリー・ウェッツ博士です。

異種移植片のような既存の方法と比較したこの技術の主な利点は、異種移植片が免疫不全の宿主を必要とするのに対し、私たちのモデルはペプチドワクチンの標的であるヒト腫瘍関連抗原を発現する免疫無傷のトランスジェニックマウスを利用していることです。私と一緒に技術を実演するのは、ダニエル・V博士とチャーガ博士とオードリー・グティエレス博士で、全員が同じ研究科学者であり、マイケル・デ・グレゴリオ博士の研究室とカリフォルニア大学デービス校のヘルスシステムです。膀胱がんを誘発するためにNブチル、N4ヒドロキシ、ブチルニトロソアミン、またはO-H-B-B-Nの初回投与を投与する前に、各マウスで顎下出血を行い、全血と血液凝固チューブを収集し、血液が凝固するまで30分間待ちます。

ステンレス製の20ゲージ強制針を使用して8週間から始まり、O-H-V-B-Nを週5日、12週間経口投与します。20週目に、600マイクロリットルの0.9%滅菌生理食塩水を使用して凍結乾燥ペプチドワクチンの各バイアルを再構成し、生理食塩水を使用して0.5インチ27ゲージの針に溶液を6回引き込むことにより完全に再懸濁します。.O-H-B-B-Nの最後の投与後、所望の用量が100マイクロリットルの容量で送達されるように濃度を調整し、O-H-B-B-Nの最後の投与から8週間後に25ゲージの針を使用して100マイクロリットルのワクチンを注入することにより、8週間サイクルで毎週ワクチンを投与します。

すべてのマウスを二酸化炭素窒息で安楽死させた後、各マウスを解剖ボードに置き、4つの手足すべてを固定します。次に、鉗子とハサミを使用して、上腹部に水平切開を行います。はさみを表皮層と腹壁の間の切開部に挿入し、鉗子の助けを借りて、皮膚を下の組織から穏やかに分離します。

マウスの中央軸に沿って水平に切開するところから、マウスの前端に向かって縦に切開します。次に、胸郭から皮膚を分離し、1ミリリットルの注射器と22ゲージの針を使用して心臓に穴を開け、鉗子とはさみを使用して滑らかで安定した吸引で血液を採取します。生物学的安全キャビネット内の表皮層の残りの部分を切り取り、剥がします。

腹壁と腹膜を無菌的に切り込みます。免疫組織化学またはIHCの場合は膀胱腫瘍を、IHCの場合はウェスタンブロットを切除します。膀胱腫瘍標本をティッシュカセットに入れ、冷やしたホルミンで一晩固定します。

室温で、細胞生存率分析のために脾臓を採取し、マルチプレックス蛍光測定微生物免疫測定法を実施するためのライスポットを採取します。200マイクロリットルのアッセイバッファーを使用して事前に濡らします。96ウェルフィルターの底板で、フィルターを完全に浸すことができます。

次に、96ウェルプレート真空装置を使用してフィルターを穏やかに排水し、ペーパータオルを使用してプレートの底を血液乾燥させますマルチチャンネルピペットピペット25マイクロリットルの血清マトリックスをブランクと標準に割り当てられたウェルに、25マイクロリットルのアッセイバッファーをコントロールと未知数に割り当てられたウェルにピペットします。次に、ブランクの標準、コントロール、および未知数の25マイクロリットルをそれぞれの割り当てられたウェルにピペットします。ビーズミックスを20秒間ボルテックスし、ビーズをリザーバーに移します。

次に、それぞれに25マイクロリットルのビーズを混ぜてピペットでつなぎます。プレートを光から保護するためにプレートをしっかりと覆い、プレートを500RPMのシェーカーで室温で2時間振とうし、プレートを水気を切り、200マイクロリットルのPBSTを使用して2回洗浄してから、水気を切って吸い取ります。検出抗体溶液を調製するには、必要量の0.1%PBSTと検出抗体を15ミリリットルのチューブに入れ、ボルテックスで10秒間

次に、それぞれに25マイクロリットルをピペットで移します。プレートを500RPMで室温で1時間よく振ってください。次に、200マイクロリットルの0.1%PBSTでプレートを排水して洗浄し、新たに調製した連鎖球菌、AVIDおよびFICOエリンまたはSAPEのドライピペット25マイクロリットルをそれぞれに2回排出して吸い取り、プレートシェーカーにプレートをしっかりと置き、室温で500RPMで30分間インキュベートします。

水気を切り、PBSTで2回洗います。ビーズを懸濁するには、各ウェルに0.1%PBSTの100マイクロリットルを加え、500RPMで少なくとも2分間振とうします。Luminex LX 200マシンを使用して、生物学的安全キャビネット内のプレートを読み取り、分析します。

マウスの脾臓を100マイクロメートルのナイロン組織ふるいにかけ、滅菌ペトリ皿で5ミリリットルの滅菌PBSに加工します。無菌の15ミリリットルの管のリンパ球の分離媒体の3ミリリットルにPLEのaytesを重ねる。チューブを600GSで15分間遠心分離します。

赤血球からリンパ球を分離するには、グラジエントの上にある層状リンパ球を、1.5ミリリットルのスクリューキャップ遠心分離チューブ内の新しい滅菌15ミリリットルチューブに移します。Countin Viability Reagentを使用して、リンパ球の段階希釈を行います。次に、ミューズで分析します。

メーカーのプロトコルに従ってプレートを準備し、それぞれに100マイクロリットルの培地ペプチドまたはスクランブルペプチドをピペットで挿入することにより、アライスポットプレートのサンプルと条件のプレートマップを調製します。100マイクロリットルの細胞懸濁液をよく加え、プレートを摂氏37度で一晩インキュベートします。ALIスポットアッセイの製造元のプロトコルに従い、解剖顕微鏡を使用して開発されたAlyスポットプレートを分析します。

各ウェルの各分析物に対応する色付きのスポットの数をカウントして、結果を定量化します。スポットは、化学発がん物質によるトランスジェニックマウスモデル誘導における各ウェルのスポット形成細胞の数に対応しています。O-H-B-B-Nは、この図に示すように、ヒトの膀胱がんと類似している、主に移行性細胞がんまたはTCCを伴うTCCの膀胱がんの発生率が高い結果となりました。

O-H-B-B-N導入膀胱がんの発生率の8週間後、マッハ1トランスジェニックまたはTGおよび野生型マウスの両方で67%ヘマチンおよびエオシン染色により、TCCとSCCの両方の存在が確認され、TCCが2対1の比率で優勢でした。これらのうち、低悪性度および高悪性度の非浸潤性腫瘍から高悪性度の浸潤性腫瘍までの範囲が観察されました。すべてのマッハ1膀胱がん検体は、IHCによるマッハワン発現陽性であった。

モデル開発中、炎症性サイトカインの血清レベルを8週目から28週目まで連続してモニターしました。その結果、炎症性サイトカインのレベルは、導入から研究終了までの時間とともに増加することが観察されました。このサイトカインパターンは、以前に肺がんモデルで観察したものと非常によく似ており、炎症性サイトカインレベルの増加が腫瘍の発生と相関している可能性があることを強く示唆しています。

ペプチドワクチンに対する血清サイトカイン反応を評価するために、ワクチン接種を受けた15匹とプラセボで治療されたマッハ1匹のTGマウスを安楽死させ、研究終了時に血液を採取しました。最後のワクチン治療から24時間後。マルチプレックス解析では、ワクチン群でTNF、アルファインターフェロン、γ、IL、IL 2、IL 12、および IL 17 の 1 番目の血清サイトカインレベルが増加していることが示されています。

プラセボ群と比較して、TNF、アルファ、インターフェロン、ガンマ、およびIL17のレベルは、ワクチンで治療されたマウスで有意に高かった。これらの結果は、ペプチドワクチンに対するTH one、TH twoの免疫応答を評価するために、ペプチドワクチンに対する1分の1分極サイトカイン応答を示唆している。SP細胞は、生存可能なリンパ球をALIスポットプレートに播種した後の生存率について単離されたリンパ球の評価であるインターフェロンγILの4つのALIスポットによって評価され、この実験の結果は、ペプチドに対するインターフェロンγ応答が明確かつ特異的であったため、ペプチドワクチンに対するTH1の免疫応答が確認された。

この技術は、がん免疫学の研究者が進行性膀胱がんの前臨床モデルを利用した新しい免疫療法を探求する道を開きました。