Name: 免疫無傷のヒトMUC1トランスジェニックマウスにおける侵襲移行細胞膀胱癌の誘導：免疫療法の開発のためのモデル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-30T22:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 2 s
Description: 学ぶMUC1標的ペプチドワクチンによる膀胱がん免疫療法モデル。MUC1トランスジェニックマウスを用いて細胞傷害性Tリンパ球応答を誘導し、免疫応答を評価する方法です。

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著者らは、マウスを飼育するためのUCデービスマウス生物学プログラムに感謝したいと思います。この研究は、メルク、ダルムシュタット、ドイツからの助成金によってサポートされていました。

すべての動物実験及び実験は、カリフォルニア大学デ​​ービスインスティテューア​​ニマルケアと管理諮問委員会を使用することによって承認されたプロトコルの下で実施された。 1。 MUC1.Tgマウス繁殖と伝播<ol><li>ヘテロ接合MUC1.Tg C57BL / 6雌マウスとUCデービスマウス生物学プログラム（MBP）は、品種、野生型C57BL / 6雄マウスたちの繁殖コロニーを確立する。 MUC1.Tg子孫は、必要に応じて研究のために提供されています。 </li><li> MBPの担当者はマウスの識別のために定義されたパターン（0-99）に子孫のつま先をクリップし、該当する場合、クリップ尾。つま先又はテール組織は、標準的なDNA抽出およびポリメラーゼ連鎖反応（PCR）分析を用いて遺伝子型決定のために処理される。 </li></ol> 2。研究デザイン<ol><li>研究グループの割り当て<ol><li>バランスに個別に各マウスを秤量し、各マウス用グラムの体重を記録します。 </li><li> INV手順のこの部分研究の方法論と設計olves。研究の最初の部分については、OH-BBNと膀胱癌の誘導を開始するために年齢をマッチさせたMUC1.Tgと野生型マウスを割り当てる。組織学による膀胱腫瘍の存在を確認するために8週間最後O​​H-BBNを投与後、マウスを安楽死させる。 </li><li>試験の第二部分は、治療群と対照群の適切な数に雄MUC1.Tgマウスをランダム。これらのマウスは8週最後のOH-BBNを投与後誘導および腫瘍の発生時に、その後の研究の終了時に血清サイトカインおよびT細胞免疫応答のために監視されます。 </li></ol></li><li>膀胱癌誘発<ol><li> OH-BBNは発癌物質と非常に有毒である。この化学物質を処理し、格納するときの材料安全データシートのガイドラインを読み、それに従ってください。 </li><li>平均的な重みとnumbeに基づいて、各マウスに、100μlの量で適切な用量（3 mg）を、実現するために必要な投薬溶液濃度を計算それぞれの研究とグループのマウスのR。 </li><li> 100％エタノールでOH-BBNを希釈。滅菌水で30 mg / mlのへの最終濃度を持参してください。最終エタノール：水の濃度は20:80、V / Vでなければなりません</li><li> 8週齢から始まる治療群の割り当てに基づいて、ステンレス鋼、20 G強制飼養針毎日、5日/週、12週間を使ってOH-BBN経口を管理します。 </li></ol></li><li>ワクチン接種トリートメント<ol><li>再構成では、各0.9％滅菌生理食塩水600μlの中に凍結乾燥したペプチドワクチンのバイアル、徹底的6X 0.5インチ27 G針を通してソリューションを描くことによって再懸濁します。生理食塩水を使用して、所望の用量を100μLの容量で提供されるように濃度を調整します。 </li><li> OH-BBNの最後の投与後、25 G針（週番号は、マウスの年齢に相当）を使用して、100μlのの皮下注射による8週間のサイクルのために週単位でワクチンを投与、20週以降。 </li></ol></li><li>モニタリングとサンプルコレクション<ol><li>すべてのマウスを秤量し、毎週一回、新しい腫瘍の有無を触診。明白な腫瘍、尿中の血液、および/または尿閉がある場合、または体重の≥20％を失っている任意のマウスを安楽死させる。 </li><li>以前は最初のOH-BBN線量にしてから、4週間間隔で、その後、顎下出血を経由して全血を収集します。血清凝固チューブ（BD Microtainer）中の血液を収集し、血液凝固のために30分を可能にします。 </li><li> 10分間、3,500×gで遠心で血液サンプルを遠心分離。慎重にピペットを用いてキャップクライオチューブをネジに血清を移す。 </li><li>フラッシュ液体窒素中で凍結し、-80℃で保存多重によるさらなる分析までC。 </li><li> 8週間OH-BBNの最後の投与後、CO 2窒息によりすべてのマウスを安楽死させる。 </li><li>解剖ボード上の各マウスを置き、すべての4つの手足によって突き止める。 </li><li> MAは、鉗子やハサミを使うKE上腹部の水平切開。表皮層と腹壁の間に切開にはさみを入れ、静かに鉗子の助けを借りて、下にある組織から肌を分離。 </li><li>マウスの前方終わりに向かって中央の軸に続く水平切開から縦切開を加えます。胸郭から肌を分離し、1ミリリットルのシリンジと22 G針を用いて、穿刺心と円滑かつ着実なドローで血を集める。 </li><li>血清分離と貯蔵のために2.4.3と2.4.4のステップを参照してください。 </li><li>鉗子やハサミ、カットと裏表皮層の残りの部分を使用。腹壁と腹膜を通してカットし、無菌的に免疫組織化学（IHC）とウエスタンブロットのために膀胱腫瘍を取り除く。 </li><li>細胞の生存分析（ミューズ）とエリスポット用脾臓を収集します。 IHC、場所膀胱腫瘍組織カセット内の試料と室温で冷やしたホルマリン一晩で解決するために。 </lI&gt; <li>翌日、70％エタノールでホルマリンを置き換える。 </li><li>腫瘍のウェスタンブロット分析については、腫瘍を均質タンパク質抽出バッファープラスホールトプロテアーゼ阻害剤を追加し、1.5 mlのマイクロチューブに移す。 </li><li> 30〜60秒間ボルテックスし、氷上で5分間保持する。 Flashには、周囲の水に液体窒素で凍結融解。 、ボルテックス凍結倍解凍のプロセスを繰り返します。 </li><li> 4で10分間°C、10,000×gでサンプルを遠心分離して、新しいラベルしたチューブに細胞抽出物を転送します。 </li><li>タンパク質測定用ビシンコニン酸タンパク質アッセイ（BCA）を行うことにより濃度を定量化する。ストアサンプル-80℃でウェスタンブロット分析のための準備ができるまでC。 </li></ol></li></ol> 3。分子生物学/ウェスタン以下の手順は、標準的なウェスタンブロットプロトコルを使用して、マウスの膀胱腫瘍組織におけるMUC1の発現を確認するために行った（データは示さないn）でなければならない。 <ol><li>半乾燥装置を用いてPVDF膜上に転送してSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）によってタンパク質抽出物を分離。 </li><li>リン酸0.1％、5％脱脂乳とタンパク質転写した膜をブロックのTween-20は、室温でオービタルシェーカーで1時間生理食塩水（PBS-T）pH7.4のバッファ付き。 </li><li> 0.1％PBS-Tにおける抗MUC1または抗β-アクチン抗体を用いてシェーカー上で室温で1時間、膜をインキュベートする。 </li><li>ソリューションをデカントし、0.1％PBS-Tを追加することにより、膜を洗浄します。 5分間デカント用シェーカー上渦巻膜。二回、この手順を繰り返します。 </li><li>西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）標識二次抗体と室温で1時間、膜をインキュベートする。 </li><li> 3倍の（3.4のステップを参照してください）​​洗ってください。 </li><li>透視をアクティブにして読むために強化された化学発光（ECL）キットのためのプロトコルに従ってください。 </li></ol> 4。プレックス蛍光マイクロビーズイムノアッセイ &lt;OL&gt; <li>セットアップと計算<ol><li> 96ウェルプレートマップを使用して、ウェルに空白、標準、コントロール、および未知を割り当てます。分析物、捕捉抗体、アッセイに必要なストレプトアビジン - フィコエリトリン（SA-PE）の数と体積を計算する。 </li><li>すべてのバッファおよび希釈は室温に平衡化することができます。空白の96ウェルプレートを用いて基準とサンプル希釈液を調製する。 </li><li>製造元のプロトコールと96ウェルプレートの適切な希釈剤と標準の1時05分の段階希釈を作るに従って血清マトリックスと凍結乾燥標準再構成。ブランクウェルには、適切な希釈剤を使用しています。 </li><li> 96ウェルプレートの残りの部分で適切な希釈剤ですべてのコントロールと未知試料1:2希釈する。 </li><li>ビーズミックス、15 mlチューブに適切な希釈剤の必要量をピペット。ボルテックス20秒とピペットは、各ビーズのバイアルを15mlチューブに各検体の必要量。 </lI&gt; <li>常に光退色を避けるために、光からビーズを守る。ウィッキングを通してサンプルの損失を避けるために、吸収材で96ウェルプレートに置かないでください。 </li></ol></li><li>アッセイプロトコール<ol><li>アッセイ緩​​衝液200μlで96ウェルフィルター底板を予め湿らせ、フィルタの完全な浸漬が可能になります。静かに96ウェルプレートの真空装置を用いて排出し、ペーパータオルでプレートの底を乾燥ブロット。 </li><li>マルチチャンネルピペット、空白および標準コントロールと未知数のために割り当てられたウェルにアッセイバッファーのピペット25μlのために割り当てられたウェルに血清マトリックスのピペットを25μlを使用。 </li><li>ブランク、標準、コントロール、およびそれぞれの割り当てられたウエルに未知数のピペット25μlの。ボルテックス20秒ビーズミックスとリザーバーにビーズを移す。 </li><li>各ウェルにビーズミックスピペット25μlの。アルミ箔や光から保護するための不透明なプレートカバーをしてプレートをカバーしています。 </li><lI&gt;プレートシェーカー上で室温で2時間500rpmでプレートを振る。ドレインと0.1％200μlのリン酸のTween 20とプレートを洗う二回（PBS-T）緩衝生理食塩水。ドレインとドライブロット。 </li><li>捕獲抗体溶液を準備します。 0.1％PBS-Tの必要量をピペットで10秒、15 mlチューブと渦に抗体を捕捉。各ウェルに貯水池とピペット25μlに捕捉抗体ミックスを転送します。 </li><li>プレートシェーカー上で室温で1時間500rpmでプレートを振る。回を排出し、0.1％PBS-T200μlでプレートを洗浄する。ドレインとドライブロット。 </li><li> SA-PE溶液を調製。 15ミリリットル管と10秒間ボルテックスに0.1％PBS-TとSA-PEの必要量をピペット。各ウェルに貯水池とピペット25μlの解決策を移す。 </li><li>プレートシェーカー上で室温で30分間、500 rpmでプレートを振る。回を排出し、0.1％PBS-T200μlでプレートを洗浄する。ドレインとBたくさん乾燥。 </li><li>ピペット100 0.1％PBS-Tμlの、ビーズを再懸濁するために、少なくとも2分間500rpmでプレートシェーカーで振る。ルミネックスLX200マシン上のプレートを読み、分析します。 </li></ol></li></ol> 5。 IFN-γ/IL-4エリスポットの準備と分析<ol><li>生物学的安全キャビネットでは、100μmのナイロン組織を介して脾臓を処理を5 mlの滅菌リン酸にふるい生理食塩水（PBS）は、滅菌ペトリ皿にバッファ。滅菌15mlのチューブにリンパ球分離培地3mlの上にレイヤ脾細胞を。 </li><li>赤血球からリンパ球を分離し、15分間600×gで遠心する。新しい無菌の15 mlチューブにグラデーション上記レイヤードリンパ球を転送します。 </li><li>滅菌PBSで10mlまで音量を調整します。ペレット細胞に10分間600 xgでサスペンションを遠心分離。 </li><li>上清を吸引し、細胞生存のために1mlのPBSで細胞を再懸濁しミューズを数えるアナライザ。ミューズカウント＆生存キットのプロトコルに従ってください。 </li><li> 1.5 mlのスクリューキャップ遠心1:10の希釈要因でチューブ、1:20、およびCount＆生存試薬で1:40（または必要に応じて）（最小総量を300μl）中のリンパ球の段階希釈を作る。ミューズにミックスし、分析するには、上下に数回、各希釈ピペット。 </li><li>エリスポットプレートのためのサンプルと条件のプレートマップを準備します。製造元のプロトコールと培地のピペットを100μl、ペプチド（10μgの/ ml）を、またはスクランブル各ウェルにペプチド（10μgの/ ml）をに従ってエリスポットプレートを準備します。 </li><li>各ウェルに1.0×10 6個の細胞を提供し、37℃で一晩静置し、細胞懸濁液をピペットで100μlを、。 </li><li> ELISPOTアッセイのために、製造業者のプロトコルに従ってください。解剖顕微鏡を使用して開発されたエリスポットプレートを分析します。 </li><li>着色されたスポットcorrespondiの数をカウントすることによって結果を定量化各ウェル中の各分析にNG。スポットは、各ウェルのスポット形成細胞数（SFC）に対応しています。 </li></ol> 6。免疫組織化学（IHC）とヘマトキシリン​​＆エオジン（H＆E）染色<ol><li>免疫組織化学的分析のためには4μmでパラフィンおよびステップ部に埋め込む上記のように保持膀胱腫瘍組織（セクション2.4.11）を取る。 </li><li> MUC1のタンデムリピート領域を認識MUC1抗体を用いたIHCを実行します。組織に存在する内因性免疫グロブリン二次マウス抗体の反応性を最小限にするために動物実験キットペルオキシダーゼを使用します。 </li><li>標準プロトコルを使用して、H＆E染色を行う。 </li></ol> 7。統計的方法多重蛍光マイクロビーズのイムノアッセイのために、平均値を比較するために両側スチューデントt-検定を使用して治療群と対照群との間血清サイトカイン濃度を観察した。エリスポットについては、1-Wを使用メディアコントロールの間にコロニーを形成するスポットを比較するAY ANOVAは、ペプチドおよびペプチドのグループをスクランブル。偽陽性の結果の可能性を軽減するためにDunnettの多重比較検定を使用してください。 ≤0.05のp値は、すべての分析のために大きく異なると考えられている。

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</ol>

DPV、GTW、SMG、CJK、AMG、そしてGKHは競合する利益を宣言しません。 MWDは、メルクKGaA社から受け取った助成金の主任であり、MWはメルクの従業員である。

人間MUC1.Tgマウスの侵襲的移行と扁平上皮膀胱癌の正常な誘導は免疫療法の開発のための前臨床モデルを提供しています。免疫療法の研究では、経時的に腫瘍の進行に対する炎症応答、ならびに免疫療法に対する免疫応答を評価するために、自発的、免疫無傷のモデルの使用を必要とする。自発的な腫瘍の開発モデルにおいて、腫瘍微小環境はそのまま残り、腫瘍は治療の抗腫瘍効果の評価を可能にするより代表的な成長速度で成長。さらに、免疫系は、治療効果の評価を可能にするバイオマーカーを介して測定し、監視することができる。 免疫療法をテストするための文献に記載された他の腫瘍担持マウスモデルは、異種移植片モデルおよび移植モデルの両方を含む。これらのモデルは、便利であり、広く癌研究において使用されてきたが、免疫療法の研究を実施する際に考慮すべき重要な制限がいくつかあります。異種移植も移植された腫瘍はいずれも自発的に開発し、それらは、腫瘍が元々由来した組織の代表ではない微小環境で増殖。さらに、異種移植片と移植腫瘍が少ない時間が治療の免疫効果を研究することができ、より迅速に自発的な腫瘍よりも成長します。最も重要なことは、こ...

膀胱がんは、がんの第四の最も一般的な形式とアメリカの男性のがんによる死亡の第八の主要な原因である。米国では、膀胱癌からの推定72,500の新しい症例と15,000人が死亡、2013年1で組み合わせるの男性と女性の間で期待されている。膀胱癌の発生率は女性に比べ男性で高い約3倍である。症例の90％以上を占める米国、移行上皮癌（TCC）で、一方、扁平上皮癌（SCC）は、2％未満2の発生率を持っている。乳頭TCCの全体的な相対5年生存率はSCC 2のための唯一の30.9％に比べて91.5パーセントである。非侵襲的な乳頭のTCCも患者の50％以上の治療よりは、筋肉侵襲性疾患3,4に進行し、これらの患者の30％までで、5年以内に再発を経験すると、診断時の症例の約75％を占めていますが。 INV非筋肉の典型的な治療レジメンasive病気は膀胱内化学療法に続いて経尿道的切除術（TUR）が含まれています。高品位のTaまたはT1腫瘍を有する患者では、リピートTURは、化学療法3,4の前に行ってもよい。低悪性度のTa再発またはハイグレードのTaまたはT1病変を有する患者については、TURはカルメット-ゲランが（BCG）3,4を使用することができバチルスの形で補助化学療法や免疫療法が続く。膀胱内BCGは、再発までの時間5に対する膀胱マイトマイシンCよりも優れていることが示されている。 T2筋肉侵襲性疾患については、術前化学療法の有無にかかわらず根治的膀胱切除術は、治療3の推奨コースです。 SCC患者において、ラジカル膀胱切除は、最も効果的な治療6であると思われる。利用可能な最善の治療法にもかかわらず、再発の非常に高い率を考えると、膀胱癌のための新しい、より効果的な治療法の必要性が明らかに存在する。 bladdに対する新しい免疫療法を拡大えーがんは、無病生存期間を延長するための約束を保持することができる1つの可能なアプローチである。歴史的に、BCGは膀胱癌のための唯一の効果的な免疫療法となっています。その作用機構は増加するインターロイキン-2のレベル（IL-2）およびインターフェロンγ（IFN-γ）4を介してTヘルパー1（Th1型）型免疫応答の非特異的誘導が関与すると考えられている。携帯電話、またはTh1型免疫は、体液、またはTh2のような癌免疫療法において重要である、免疫が成長因子受容体7に対する抗体を除いて、固形腫瘍に対して有効であることが示されていない。 BCG単独療法の利点を改善する試みでは、IFN-α2B/BCGコンビネーション免疫療法は、決定的な結果は8との第II相臨床試験で評価した。膀胱癌に対する免疫療法の代替アプローチは7癌免疫療法は、より具体的な行った識別そのうち腫瘍関連抗原（のTAA）を、ターゲットにするかもしれない</s&gt;まで。 そのようなTAAは、例えば膀胱癌、乳癌、肺癌および膵癌9,10などの多くの上皮細胞癌において過剰に発現する細胞表面糖タンパク質であるムチン-1（MUC1）である。 MUC1の発現及び変更は、実質的発癌の間に変更され、その結果underglycosylationは、ペプチドコア上のタンデムリピートの可変数（VNTR）として知られているアミノ酸の抗原配列が公開されています。 MUC1は、自己分子であるが、これらの免疫VNTR領域は、通常、広範なグリコシル化のために露出されないので、それらは外来11,12などの免疫系によって見られる。具体的にはMUC1エピトープを認識する細胞傷害性Tリンパ球（CTLが）MUC1のための潜在的なターゲット作り、乳癌患者13と同様に、骨髄腫患者14,15の血液および骨髄の腫瘍流入領域リンパ節から単離されている細胞性免疫応答。 underglycosylateの免疫VNTRsMUC1のD形は、腫瘍細胞の16-19の破壊をもたらし、CTLにより認識されています。癌MUC1へのネイティブ細胞および/または体液性免疫応答は、しかし、腫瘍を除去するために十分な強さではありません。 MUC1に対する既存の弱い免疫応答を増強するために、合成ペプチドが免疫優性臨床的利益18,20からなるのに十分に強いCTL応答を生成するためにワクチン接種を介して導入することができる。 MUC1リポソームワクチンは既に、肺癌患者21,22の生存率を増加させるMUC1陽性腫瘍細胞を死滅させることができるCTLを生成し、Th1型偏サイトカイン応答23,24を生成することが示されている。 MUC1発現を9,11,25の高いレベルでは、膀胱癌は、MUC1特異的免疫療法26,27をテストするための論理的な候補である。さらに、MUC1は膀胱癌28で予後因子としての可能性を秘めている、TCCにおけるMUC1の発現が有意ステージとグレードに関連付けられており、転移性TCCMUC1 29を発現し続けることが示されている。 膀胱癌におけるMUC1特異的免疫療法の潜在的な有用性を評価するために、我々は、免疫無傷のヒトMUC1（hMUC1）を発現するC57BL / 6背景に30膀胱癌ジェニックのトランスジェニック（MUC1.Tg）マウスモデルを開発した。ヒトMUC1は、ヒト30,31において観察されるそれと一致した組織発現パターンを得、自身のプロモーターの制御下で自己タンパク質として発現される。マウスは、公知の膀胱発癌物質N-ブチル-N-（4 -ヒドロキシブチル）ニトロソアミン（BBN-OH）32で誘導した後、得られた腫瘍hMUC1発現と腫瘍の種類や悪性度を評価した。腫瘍現像時のTh1/Th2サイ​​トカインレベルに発癌物質の効果を評価するために、血清サンプルを多重分析のために定期的に収集した。次いで、マウスをターゲットMUC1ペプチドワクチンで処理し、血清サイトカインおよび免疫応答があった評価多重蛍光マイクロビーズイムノアッセイとエリスポットによってテッド。

<table><tbody><tr><td><ストロング>試薬&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-ブチル-N-(4-ヒドロキシブチル)-ニトロソアミン(OH-BBN)</td><td>TCIアメリカ</td><td>B0938</td><td></td></tr><tr><td>20 G強制ニードル</td>ポ<td>ッパーサンズ株式会社</td><td>7921</td><td>ステンレス鋼</td></tr><tr><td>ペプチドワクチン</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>治験薬</td></tr><tr><td>BD Microtainers</td><td>BD</td><td>365957</td><td></td></tr><tr><td>組織カセット</td><td>Simport</td><td>M490-12</td><td></td></tr><tr><td>10% 中性緩衝ホルマリン</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>SF100-4</td><td></td></tr><tr><td>溶解緩衝液</td><td>ピアス</td><td>87787</td><td></td></tr><tr><td>停止プロテアーゼ&ホスファターゼ阻害剤カクテル</td><td>Thermo Scientific</td><td>78444</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td><td>Pierce</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Cytokine 20plex Kit</td><td>Invitrogen</td><td>LMC006</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic Microsphere Beads</td><td>Luminex</td><td>MC100xx-01</td><td>xx is the bead region</td></tr><tr><td>Anti-mouse TNF- Capture Antibody</td><td>BD Pharmingen</td><td>551225</td><td></td></tr><tr><td>抗マウスTNF-検出抗体</td><td>BD Pharmingen</td><td>554415</td><td></td></tr><tr><td>抗マウスIFN-捕捉抗体</td><td></td><td>Abcam ab10742</td><td></td></tr><tr><td>抗マウスIFN-検出抗体</td><td>Abcam</td><td>ab83136</td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH 7.4</td><td>Sigma</td><td>P3813-10PAK</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Fisher</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>アッセイバッファーミリ</td><td>ポア</td><td>L-MAB</td><td></td></tr><tr><td>サイトカイン スタンダード</td><td>ミリポア</td><td>MXM8070</td><td></td></tr><tr><td>マルチスクリーンHTS 96ウェルフィルタープレート</td><td>ミリポア</td><td>MSBVN1210</td><td></td></tr><tr><td>SA-PE</td><td>Invitrogen</td><td>SA10044</td><td></td></tr><tr><td>100 m ナイロン組織ふるい</td><td>BD</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>脾細胞分離培地</td><td>ロンザ</td><td>17-829E</td><td></td></tr><tr><td>TNF- /IL-4 ELISpot プレート</td><td>R&Dシステム</td>ズ<td>ELD5217</td><td></td></tr><tr><td>ウサギ抗MUC1モノクローナル抗体</td><td>エピトミクス</td><td>2900-1</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗アクチンモノクローナル抗体</td><td>シグマ</td><td>A1978</td><td></td></tr><tr><td>抗ウサギHRP抗体</td><td>プロメガ</td><td>W401B</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗マウスHRP抗体</td><td>サンタクルスバイオテクノロジー株式会社</td><td>SC-2005</td><td></td></tr><tr><td>PVDF 膜</td><td>BioRad</td><td>162-0174</td><td></td></tr><tr><td>ミニ プロティアン TGX プレキャスト ゲル</td><td>BioRad</td><td>456-1083</td><td></td></tr><tr><td>ミューズ数 &生存率キット</td><td>ミリポア</td><td>MCH100104</td><td></td></tr><tr><td>MUC1 抗体</td><td>BD ファーミンゲン</td><td>550486</td><td>IHC 抗体</td></tr><tr><td>動物研究 ペルオキシダーゼキット</td><td>Dako</td><td>K3954</td><td>IHC 染色</td></tr><tr><td><ストロング>機器およびソフトウェア</ストロング></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ミリポアプレート真空装置</td><td>ミリポア</td><td>MSVMHTS00</td><td></td></tr><tr><td>ルミネックスLx200</td><td>Millipore / Luminex</td><td>40-013</td><td>Luminex製、Millipore</td></tr><tr><td>Luminex Xponent Software</td><td>Millipore / Luminex</td><td>N/A</td><td>Version 3.1に付属 Luminex Lx200</td></tr><tr><td>Milliple Analyst Software</td><td>Milliplex / VigeneTech</td><td>40-086</td><td>Version 5.1</td></tr><tr><td>Muse Cell Analyzer</td><td>Millipore</td><td>0500-3115</td><td></td></tr><tr><td>Muse Software</td><td>Millipore</td><td>N/A</td><td>Version 1.1.0.0; Analyzer</td></tr><tr><td>Dissecting Microscope</td><td>Unitron</td><td>Z730</td><td></td></tr><tr><td>Graphpad Prism Software</td><td>Graphpad Software Inc.</td>に付属<td>N/A</td><td>バージョン 5.1</td></tr><tr><td>Mini Protean Tetra Cell Gel apparatus</td><td>BioRad</td><td>165-8001</td><td></td></tr><tr><td>Trans Blot SD Cell and PowerPac</td><td>BioRad</td><td>170-3849</td><td></td></tr></tbody></table>

免疫無傷のヒトmuc1トランスジェニックマウスにおける侵襲移行細胞膀胱癌の誘導：免疫療法の開発のためのモデル

Induction of Invasive Transitional Cell Bladder Carcinoma in Immune Intact Human MUC1 Transgenic Mice:  A Model for Immunotherapy Development

浸潤性膀胱癌の前臨床モデルは、ヒトムチン-1（MUC1）免疫療法および/または細胞傷害性化学療法を評価するためのトランスジェニック（MUC1.Tg）マウスにおいて開発された。膀胱癌を誘発するために、C57BL / 6マウス（MUC1.Tgおよび野生型）は、3.0 mg /日で発癌物質N-ブチル-N-（4 - ヒドロキシブチル）ニトロソアミン（BBN-OH）、5日/週で経口的に処理した12週間。腫瘍の開発中に血清サイトカインプロファイルにOH-BBNの効果を評価するために、全血を処理し、4週間ごとに先立って顎下出血を介して収集した。また、MUC1ターゲットペプチドワクチンおよびプラセボを8週間毎週マウスの群に投与した。腫瘍の発生と次の予防接種時の血清サイトカインの多重蛍光マイクロビーズimmunoanalysesを行った。終了時に、インターフェロンγ（IFN-γ）/ MUC1特異的T細胞免疫応答および腫瘍型の組織病理学的評価のためのインターロイキン-4（IL-4）のELISpot解析そして等級を行った。その結果、（1）MUC1.Tgと野生型マウスの両方における膀胱癌の発生率は67％であった。（2）2:1の比率で開発された移行上皮癌（TCC）は、扁平上皮癌（SCC）に比べ（3）炎症性サイトカインは、腫瘍の発達の間に経時的に増加し、（4）ペプチドワクチンの投与は、Th1型偏血清サイトカインプロファイルおよびMUC1特異的T細胞応答を誘導する。 MUC1.Tgマウスで全ての腫瘍はMUC1発現について陽性であった、とMUC1.Tgと野生型マウスのすべての腫瘍の半分は侵襲的であった。結論として、薬理学者、免疫学者、病理学者と分子生物学の努力の調整を通じてチームアプローチを使用して、我々はhMUC1を表現膀胱癌の免疫無傷トランスジェニックマウスモデルを開発しました。

膀胱癌における新規免疫療法との組み合わせの効果の前臨床評価は、適切な動物モデルの開発が必要である。我々のトランスジェニックマウスモデルでは、化学発癌物質OH-BBNによる誘導は、ヒトの膀胱癌に類似しているいくつかのSCC、と主にTCCの膀胱癌の発生率の高さとなった。腫瘍組織学、MUC1発現状態とペプチドワクチン治療に対する免疫応答を決定するために、21 MUC1.Tgと18野生型マウスは、OH-BBNの誘導後、血液、ぼうこう、及び脾臓（ 図1）8週間の収集のために安楽死させた（週28）。両方MUC1.Tg（14/21）と野生型（12/18）マウスで膀胱癌の発生率は67％であった。ヘマトキシリン​​及びエオシン（H＆E）で染色は、2:1の比率で優勢でのTCC、TCCとSCCの両方の存在を確認した。これらの中でも、高品位な浸潤性腫瘍を低及び高品位な非侵襲性の範囲を観察した。すべてMUC1.Tg膀胱癌標本はIHC（ 図2）によってMUC1発現について陽性であった。なお、MUC1 IHCのために使用する抗体は、正常および癌性の両方のヒトMUC1を認識することに留意すべきである。...

N-ブチル-N-（4 - ヒドロキシブチル）ニトロソアミン誘発性膀胱癌モデルは、ヒトムチン-1（MUC1）テストの目的MUC1特異的免疫療法のためのトランスジェニックマウスに開発された。ターゲットMUC1ペプチドワクチンを投与した後、MUC1の細胞傷害性Tリンパ球応答は、血清サイトカインレベルおよびT細胞特異的活性を測定することにより確認した。

免疫無傷のヒトMUC1トランスジェニックマウスにおける侵襲移行細胞膀胱癌の誘導：免疫療法の開発のためのモデル

A preclinical model of invasive bladder cancer was developed in human mucin 1 (MUC1) transgenic (MUC1.Tg) mice for the purpose of evaluating immunotherapy ...

次の実験の全体的な目標は、膀胱癌の腫瘍関連抗原を標的とする細胞傷害性Tリンパ球応答を効果的に誘導することです。これは、ヒト腫瘍関連抗原マッハ1を発現するマウスに膀胱癌を誘導することによって達成されます。次に、ペプチドワクチンをマウスに注射し、マッハ1の特異的な細胞傷害性Tリンパ球応答を作製する。次に、血清腫瘍と脾臓を分離し、組織をそれぞれサイトカイン、抗原、および免疫応答について分析します。ウェスタンブロットマルチプレックス、蛍光測定マイクロビーズ、イムノアッセイ免疫組織化学、およびライブスポット分析を利用することで、膀胱がんに対するペプチドワクチンの有効性を試験することができます。こんにちは、カリフォルニア州サクラメントにあるカリフォルニア大学デービス校ヘルスシステムの研究員、グレゴリー・ウェッツ博士です。異種移植片のような既存の方法と比較したこの技術の主な利点は、異種移植片が免疫不全の宿主を必要とするのに対し、私たちのモデルはペプチドワクチンの標的であるヒト腫瘍関連抗原を発現する免疫無傷のトランスジェニックマウスを利用していることです。私と一緒に技術を実演するのは、ダニエル・V博士とチャーガ博士とオードリー・グティエレス博士で、全員が同じ研究科学者であり、マイケル・デ・グレゴリオ博士の研究室とカリフォルニア大学デービス校のヘルスシステムです。膀胱がんを誘発するためにNブチル、N4ヒドロキシ、ブチルニトロソアミン、またはO-H-B-B-Nの初回投与を投与する前に、各マウスで顎下出血を行い、全血と血液凝固チューブを収集し、血液が凝固するまで30分間待ちます。ステンレス製の20ゲージ強制針を使用して8週間から始まり、O-H-V-B-Nを週5日、12週間経口投与します。20週目に、600マイクロリットルの0.9%滅菌生理食塩水を使用して凍結乾燥ペプチドワクチンの各バイアルを再構成し、生理食塩水を使用して0.5インチ27ゲージの針に溶液を6回引き込むことにより完全に再懸濁します。.O-H-B-B-Nの最後の投与後、所望の用量が100マイクロリットルの容量で送達されるように濃度を調整し、O-H-B-B-Nの最後の投与から8週間後に25ゲージの針を使用して100マイクロリットルのワクチンを注入することにより、8週間サイクルで毎週ワクチンを投与します。すべてのマウスを二酸化炭素窒息で安楽死させた後、各マウスを解剖ボードに置き、4つの手足すべてを固定します。次に、鉗子とハサミを使用して、上腹部に水平切開を行います。はさみを表皮層と腹壁の間の切開部に挿入し、鉗子の助けを借りて、皮膚を下の組織から穏やかに分離します。マウスの中央軸に沿って水平に切開するところから、マウスの前端に向かって縦に切開します。次に、胸郭から皮膚を分離し、1ミリリットルの注射器と22ゲージの針を使用して

induction-invasive-transitional-cell-bladder-carcinoma-immune-intact

Research

JoVE Journal

Medicine

医学

マウスの膀胱壁の注入は、同所膀胱の幹細胞と癌の生物学を研究するために有用なアプローチである。この繊細な顕微法は慎重に手法と実践を習得することができます。...

マウスの膀胱壁インジェクション

膀胱腫瘍は、カテーテル、局所焼灼、および火傷のサイトへの癌細胞のその後の付着を介して低侵襲的にメスのマウスで確立されている。...

マウス膀胱癌の同所性モデル

超音波検査および生物発光イメージングによる膀胱内に配達Sarnaのとモニタリング腫瘍成長の抗腫瘍効果を評価するために同所性膀胱腫瘍モデルを確立します。...

同所性膀胱腫瘍モデルと膀胱内Sarnaの治療の評価

このビデオでは、マウスモデルの膀胱にがん細胞を送達する膀胱内手順について説明します。この手順は、治療戦略の開発に使用できる同所性膀胱腫瘍モデルを生成するのに役立ちます。...

マウスモデルにおける同所性膀胱腫瘍のモデリング:マウス膀胱への癌細胞の膀胱内投与の手順

起源の臓器への癌細胞の移植は、新規治療法を評価するための有用な前臨床モデルとして役立つことができる。 MB49膀胱癌細胞は、膀胱内注入後の膀胱内に成長させることができる。このプロトコルは、腫瘍移植およびアデノウイルス引渡しのために、マウスの膀胱のカテーテル法を示しています。...

遺伝子送達研究のための同所膀胱癌モデル

主な侵襲的同所性膀胱癌異種移植片を接種するために確立された技術は、開腹手術と膀胱の動員を必要とします。この手順では、マウスに有意な病的状態を負わせる技術的に困難であり、時間がかかる。したがって、我々は、経皮的アプローチは、超音波誘導を利用して、高精度を開発した。...

マウス同所性膀胱異種移植片の最小侵襲性の確立

このプロトコルは、雌のC57BL / 6Jマウスにおけるマウス同所性膀胱腫瘍の発生および腫瘍増殖の監視について説明します。...

マウス同所性膀胱腫瘍モデルおよび腫瘍検出システム

マウス膀胱腫瘍は N-butyl-N-(4-hydroxybutyl) ニトロソアミン発がん性物質 (BBN) で誘導されます。膀胱腫瘍の世代は異質です。したがって、ランダム化実験的な治療の前に腫瘍負荷の正確な評価が必要です。腫瘍の大きさおよび段階を評価する高速で信頼性の高い MRI...

核磁気共鳴化学発癌剤誘発マウス膀胱腫瘍の評価

このプロトコルは、高品位の尿細胞癌細胞または非肥満糖尿病/重度の組み合わせに大腸癌細胞を直腸内注入することにより、患者由来のオルソトピック異種移植片モデルの生成を記述する。ヒト転移性疾患の進行を模倣するリンパ節間質細胞の影響下で原発性腫瘍増殖および自発的転移のための免疫不全(NOD/SCID)マウス。...

ヒト尿路上皮細胞癌および大腸癌腫瘍増殖および自発性転移に対する患者由来の眼科医異所性Xenograft移植片モデル

このプロトコルは、発癌性癌誘発性マウス膀胱癌に由来する膀胱腫瘍オルガノイドの三次元体内培養を確立するための詳細な実験ステップを提供する。腫瘍オルガノイドの受動法、遺伝子工学、および正体移植を含む培養方法が記載されている。...

マウス膀胱腫瘍オルガノイドの培養、操作、および正体移植

学ぶMUC1標的ペプチドワクチンによる膀胱がん免疫療法モデル。MUC1トランスジェニックマウスを用いて細胞傷害性Tリンパ球応答を誘導し、免疫応答を評価する方法です。

免疫無傷のヒトMUC1トランスジェニックマウスにおける侵襲移行細胞膀胱癌の誘導：免疫療法の開発のためのモデル

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