フライ精巣における撮像中心体

この手順の全体的な目標は、遺伝的にタグ付けされたセントロソマームマーカーを使用して、新しい遺伝子変異をスクリーニングし、新たに同定されたセントロソーム遺伝子の機能を明らかにすることです。これは、3つの異なるイメージング戦略によって実現できます。生きた精巣のイメージング、トラックB、精巣の化学的固定、またはトラックC免疫染色を追跡します。

この手順の最初のステップは、遺伝的にタグ付けされたcentrisソマタンパク質を発現するハエの精巣を単離することであり、その後すぐにイメージングを行うことができます。2番目のステップは、精巣を化学的に固定することですが、これに続いてイメージングを行うこともできます。第三に、精巣を免疫染色してから画像化することができます。

最終的に、中心タンパク質の位置は蛍光顕微鏡法によって特定されます。この方法は、中心形成の分子基盤、中心伸長、中心分離など、中央ゾーンフィールドの主要な質問に答えるのに役立ちます。JoVE出版物2 6 4 1で詳述されているように、ショウジョウバエの精巣を分離することから始めます。

精巣を分離した後、正に帯電したガラス顕微鏡スライド上で、新たに調製した室温のダッピー染色緩衝液6マイクロリットルに標本を浸します。10分待ってから、染色バッファーを2回交換して余分なDPIをやさしく洗い流します。6マイクロリットルのPBS付き。

精巣を洗い流さないように注意してください。濾紙を使用してスライドから溶液を取り出し、スライドを吸い取ります。6マイクロリットルの容量は、18平方ミリメートルのカバースリップに適しています。

現在では、鋭利なメスを使用して目的の細胞タイプの近くの精巣を突き刺すのに役立ち、これにより、押しつぶしステップ中のこれらの細胞への圧力が最小限に抑えられます。次に、標本の上にカバースリップを慎重に置き、マニキュアで密封します。次に、スライド上の精巣の位置をペンでマークし、イメージングに進みます。

精巣を分離した後、正に帯電したガラス顕微鏡スライドの上にPBSの6マイクロリットル滴に浸します。精巣を手動で直線的に、または他の方法で好まれるように向き付けます。次に、濾紙を使用してPBSを吸い取り、新たに準備した6マイクロリットルの固定バッファーと交換します。

固定バッファーで5分後、濾紙で吸い取ります。次に、試料を新たに調製したDPI染色緩衝液6マイクロリットルに10分間浸します。DPIを6マイクロリットルの容量のPBS2つに交換して洗い流します。

次に、18平方ミリメートルのカバースリップを試験片の上に慎重に置き、マニキュアで密封します。次に、スライド上の精巣の位置をマークし、イメージングを進めます。この手順では、まず、シリコン処理されたカバースリップを準備します。

まず、カバースリップをシコナイズド溶液の小さなトレイに室温で1分間、ヒュームフードの下に浸し、カバースリップが完全に露出し、互いに重なっていないことを確認します。次に、カバースリップを水で3回、1回の洗濯につき1分間洗います。これに続いて、70%エタノールで1分間の洗浄を3回行い、最後に水で1分間洗浄します。

次に、シリコン処理されたカバースリップをドラフトの下で風乾させます。いくつかの睾丸を解剖し、標本タイプのスライドを彫刻した後、シリコン処理されたカバースリップに5マイクロリットルのPBSを追加し、精巣をPBSの液滴に移します。成功を確実にするためには、それぞれに1つの精巣を持ついくつかのカバースリップが必要です。

次に、解剖顕微鏡で、前に示したように各精巣を注意深く穴を開けます。次に、正に帯電したガラス顕微鏡をそっと置きます。カバースリップの上をスライドさせて、PBSがカバースリップとスライドの間に均一に分散するようにします。

次に、カバースリップとスライドの間から余分なバッファーを吸い上げ、精巣への圧力を高めて押しつぶします。次に、準備したスライドを液体窒素に落とします。これで、さらにスライドを準備してタンクに追加できます。

大きな鉗子を使用して続行する前に、液体窒素からスライドの1つを取り外し、メスをすばやく使用してカバースリップを取り除きます。試験片はスライド上に残し、カバースリップを試験片から取り外します。Sスライドの表面に付着しないように注意してください。

これは、メスを使用してカバースリップを1回の素早い動きでスナップオフすることで実現できます。次に、メタノールで満たされたガラス製のコプラン染色ジャーでスライドをインキュベートします。マイナス20°Cで15分冷やします。

インキュベーション後、スライドをアセトンの入った瓶に移します。アセトンで30秒後、マイナス20°Cで冷やします。スライドをPBSで室温で1分間洗浄します。

次に、新たに調製したPBSTでスライドを10分間インキュベートして、非特異的な部位をブロックしますPBS結核のインキュベーション中に、水分チャンバーのウェルに水を入れます10分後、PBSTからスライドを取り出し、標本の周りの各スライドを乾燥させます。試料自体を乾燥させないように注意してください。各スライドが乾燥するにつれて。

モイスチャーチャンバーに入れます。抗体溶液を添加する前に、スライドの標本を囲む領域を乾燥させることが重要です。これにより、抗体が検体上に局在したままになり、インキュベーションステップ中の乾燥を防ぐことができます。

次に、調製したばかりのP-B-S-T-B-Rで希釈した100マイクロリットルの一次抗体を検体に静かに滴下します。特性が未評価の抗体には、1〜200希釈を使用してください。次に、検体の上に1cm四方のパラフォームを置き、抗体溶液を広げて抗体溶液が蒸発するのを防ぎます。

試料を室温で1時間インキュベートします。1時間後、鉗子を使用してパラフォームをスライドからそっと取り外します。次に、スライドをPBSTで室温で3回、1回の洗浄につき5分間洗浄します。

その後、スライドを検体を上に向けて水分チャンバーに移し、PBST、BRで希釈した100マイクロリットルの二次抗体を検体に穏やかに加えます。前と同じように、パラフォームを適用し、PBSTで5分間の洗浄を3回、次にPBSで5分間の洗浄を3回行い、セカンダリを1時間待って洗い流します。次に、スライドを試料に触れずに慎重に拭き取ります。

6マイクロリットルの封入剤を追加し、標準のカバースリップを貼り付けます。カバースリップをマニキュアで密封し、精巣の位置をマークした後、イメージングを進めます。中心体は、精子形成の過程で複数の形態学的および機能的変化を経験します。

容易に観察されるプロセスの1つは、精原細胞における中心体伸長であり、LARマーカーANA one GFPは、このOLが精子形成中に伸び、ほぼ成熟した精子細胞で2.5ミクロンの長さに達する0.6ミクロンの長さを示します。ショウジョウバエ精子の遠心油は独特な長いので、イメージングを使用して中心体の伸長に関する定量的な記述を行うことができます。野生型の形態と比較して、中枢の成長を変化させる様々な変異が同定されている。

2つの例は常に早期であり、減数分裂の開始前に精子形成を阻止するが、成熟した精母細胞のこれらの突然変異体のセント油のセント伸びをブロックしない砲弾の突然変異は、最大長1.8ミクロンに達する対照細胞のセント油と比較して約2.4ミクロンに成長します。マスタリングが完了すると、サンプルサイズにもよりますが、トラックAは20分、トラックBは30分、トラックCは3〜5時間で完了します。このビデオを見た後、飛行中の中心体を画像化する方法についてよく理解しているはずです。