内因性の免疫蛍光分析および外因性セントロメア、動原体タンパク質

この間接免疫蛍光アッセイの全体的な目標は、ヒト細胞内のセントロメアタンパク質Aおよびフラグタグ付き外因性CENP-Aタンパク質を含む、内因性および外因性のセントロメア-動原体タンパク質の局在化と定量を最適化することです。この方法は、セントロメア-動原体タンパク質の同定と定量方法に関する重要な疑問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、選択した後期の関心に応じて、さまざまなレベルのセントロメア-動原体発現を定量化するために使用できることです。

播種後18時間後、培養細胞をPBSで1回洗浄し、6ウェルポリスチレン培養プレートの各ウェルに500マイクロリットルの還元血清培地を加えます。次に、各ウェルの細胞に新たに調製したAおよびB混合物溶液をトランスフェクションし、培養物を摂氏37度および二酸化炭素5%でインキュベートします。4時間半後、中から高グルコースのDMEMにFBSと抗生物質を補充し、プレートを細胞培養インキュベーターに戻します。

48〜72時間後、細胞培養培地を吸引し、PBSで細胞を1回すすぎ、細胞の乱れを避けるために培養ウェルの側面に生理食塩水を加えます。次に、細胞を4%パラホルムアルデヒドで4°Cで30分間固定します。固定期間の終了時に、細胞をKb2バッファーで2回すすぎ、サンプルをKb1バッファーに室温で30分間浸透させます。

次に、細胞をKb2バッファーで1回すすぎ、新しいKb2バッファーを添加して非特異的結合をブロックします。室温で5分後、鉗子を使用して播種したカバーガラスを各ウェルから取り出し、疎水性バリアペンを使用して各カバーガラスサンプルの周囲に疎水性バリアを描画します。カバーガラスを新しい6ウェルポリスチレンプレートに移し、サンプルを適切な一次抗体に摂氏37度で1時間浸します。

次に、細胞をKb2バッファーで3回すすぎ、適切な二次抗体でさらに37°Cで標識します。インキュベーションの終了時に、Kb2バッファーで6分間の洗浄を5回行い、サンプルをすすぎます。次に、DapEを含むKb3バッファーで細胞核を室温で5分間標識し、その後、Kb2バッファーで1〜2回洗浄し、ウェルにKb2バッファーを再充填します。

次に、細胞のカバーガラスごとに1つの顕微鏡スライドの中央に封入剤を滴下し、細胞サンプルから液体を取り除きます。最後に、準備した顕微鏡スライドの中央に各サンプルを慎重に置き、ペーパータオルで余分な封入剤を取り除きます。この代表的な実験で観察されたように、CUL4A siRNAトランスフェクト細胞の全細胞ライセートにおける内在性CENP-Aタンパク質発現のレベルは、ルシフェラーゼsiRNAトランスフェクト細胞におけるCENP-A発現レベルと同程度でした。

さらに、RBX1 siRNAトランスフェクト細胞の全細胞ライセート中の内因性CENP-Aのタンパク質レベルは、ルシフェラーゼsiRNAトランスフェクト細胞の内因性CENP-Aレベルと同程度であり、CENP-Aのセントロメアへの局在にはCUL4A RBX1 E3リガーゼが必要であることが示唆されました。CENP-Aリジン変異体はセントロメア内で局在する能力を失うため、CENP-A K124のユビキチン化がCENP-Aのセントロメアへの局在に不可欠であることが示唆されています。重要なことに、CENP-Aタンパク質の外因性モノユビキチン融合が脱局在化CENP-A K124R変異体を救い、タンパク質をセントロメア位置に戻しました。

一度習得すると、細胞固定と免疫蛍光染色の手順は、適切に実行されれば5〜6時間で完了できます。サンプルをすすぎたり浸漬したりするときに細胞がカバーグラスから外れないように、すべての溶液をウェルの側面に優しく塗布することを忘れないでください。換気された部屋の外で加熱されたパラホルムアルデヒドを扱うこと、または火の近くの可燃性物質は非常に危険である可能性があること、およびこの手順を実行するときは常に適切な予防措置を講じる必要があることを忘れないでください。