内因性の免疫蛍光分析および外因性セントロメア、動原体タンパク質
2016年3月3日
ここでは、ヒト細胞内の内因性および外因性のセントロメア-動糖体タンパク質を検出し、固定(パラホルムアルデヒド、アセトン、またはメタノール固定)の使用による間接免疫蛍光染色により、セントロメア-キネトコアでのこれらのタンパク質レベルを定量するプロトコールを報告します。
この間接免疫蛍光アッセイの全体的な目標は、ヒト細胞内のセントロメアタンパク質Aおよびフラグタグ付き外因性CENP-Aタンパク質を含む、内因性および外因性のセントロメア-動原体タンパク質の局在化と定量を最適化することです。この方法は、セントロメア-動原体タンパク質の同定と定量方法に関する重要な疑問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、選択した後期の関心に応じて、さまざまなレベルのセントロメア-動原体発現を定量化するために使用できることです。
播種後18時間後、培養細胞をPBSで1回洗浄し、6ウェルポリスチレン培養プレートの各ウェルに500マイクロリットルの還元血清培地を加えます。次に、各ウェルの細胞に新たに調製したAおよびB混合物溶液をトランスフェクションし、培養物を摂氏37度および二酸化炭素5%でインキュベートします。4時間半後、中から高グルコースのDMEMにFBSと抗生物質を補充し、プレートを細胞培養インキュベーターに戻します。
48〜72時間後、細胞培養培地を吸引し、PBSで細胞を1回すすぎ、細胞の乱れを避けるために培養ウェルの側面に生理食塩水を加えます。次に、細胞を4%パラホルムアルデヒドで4°Cで30分間固定します。固定期間の終了時に、細胞をKb2バッファーで2回すすぎ、サンプルをKb1バッファーに室温で30分間浸透させます。
次に、細胞をKb2バッファーで1回すすぎ、新しいKb2バッファーを添加して非特異的結合をブロックします。室温で5分後、鉗子を使用して播種したカバーガラスを各ウェルから取り出し、疎水性バリアペンを使用して各カバーガラスサンプルの周囲に疎水性バリアを描画します。カバーガラスを新しい6ウェルポリスチレンプレートに移し、サンプルを適切な一次抗体に摂氏37度で1時間浸します。
次に、細胞をKb2バッファーで3回すすぎ、適切な二次抗体でさらに37°Cで標識します。インキュベーションの終了時に、Kb2バッファーで6分間の洗浄を5回行い、サンプルをすすぎます。次に、DapEを含むKb3バッファーで細胞核を室温で5分間標識し、その後、Kb2バッファーで1〜2回洗浄し、ウェルにKb2バッファーを再充填します。
次に、細胞のカバーガラスごとに1つの顕微鏡スライドの中央に封入剤を滴下し、細胞サンプルから液体を取り除きます。最後に、準備した顕微鏡スライドの中央に各サンプルを慎重に置き、ペーパータオルで余分な封入剤を取り除きます。この代表的な実験で観察されたように、CUL4A siRNAトランスフェクト細胞の全細胞ライセートにおける内在性CENP-Aタンパク質発現のレベルは、ルシフェラーゼsiRNAトランスフェクト細胞におけるCENP-A発現レベルと同程度でした。
さらに、RBX1 siRNAトランスフェクト細胞の全細胞ライセート中の内因性CENP-Aのタンパク質レベルは、ルシフェラーゼsiRNAトランスフェクト細胞の内因性CENP-Aレベルと同程度であり、CENP-Aのセントロメアへの局在にはCUL4A RBX1 E3リガーゼが必要であることが示唆されました。CENP-Aリジン変異体はセントロメア内で局在する能力を失うため、CENP-A K124のユビキチン化がCENP-Aのセントロメアへの局在に不可欠であることが示唆されています。重要なことに、CENP-Aタンパク質の外因性モノユビキチン融合が脱局在化CENP-A K124R変異体を救い、タンパク質をセントロメア位置に戻しました。
一度習得すると、細胞固定と免疫蛍光染色の手順は、適切に実行されれば5〜6時間で完了できます。サンプルをすすぎたり浸漬したりするときに細胞がカバーグラスから外れないように、すべての溶液をウェルの側面に優しく塗布することを忘れないでください。換気された部屋の外で加熱されたパラホルムアルデヒドを扱うこと、または火の近くの可燃性物質は非常に危険である可能性があること、およびこの手順を実行するときは常に適切な予防措置を講じる必要があることを忘れないでください。
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概要
本研究では、間接免疫蛍光染色を用いてヒト細胞内のセントロメア・キネトコアタンパク質を検出および定量するためのプロトコルを提示します。これらの手法では、これらのタンパク質の局在を最適化するために、さまざまな固定法を用いています。
研究の主要構成要素
科学分野
- 細胞生物学
- 神経科学
- タンパク質解析
背景
- セントロメア・キネトコアタンパク質は、細胞分裂において重要な役割を果たしています。
- これらのタンパク質の局在と発現レベルを理解することは、細胞生物学研究において不可欠です。
- 間接免疫蛍光染色は、これらのタンパク質を研究するための一般的な手法です。
- 固定方法の違いが、これらのタンパク質の検出に影響を及ぼす可能性があります。
研究の目的
- 内因性および外因性のセントロメア・キネトコアタンパク質の局在を最適化する。
- ヒト細胞におけるセントロメア・キネトコアのタンパク質レベルを定量化する。
- 当該分野の研究者に信頼性の高いプロトコルを提供する。
使用した手法
- 間接免疫蛍光染色法。
- パラホルムアルデヒド、アセトン、またはメタノールによる固定法の使用。
- 特定のタンパク質構築物を用いた培養細胞へのトランスフェクション。
- タンパク質発現を最適化するためのインキュベーションおよび培地交換。
主な結果
- セントロメアタンパク質AおよびFLAGタグ付きCENP-Aタンパク質の局在化に成功した。
- 後期（anaphase）の異なる段階におけるタンパク質レベルを定量化した。
- さまざまな固定法の有効性を実証した。
- 異なる実験上のニーズに適応可能なプロトコルを提供した。
結論
- 本研究は、セントロメア・キネトコアタンパク質を研究するための堅牢な手法を提供します。
- 得られた知見により、細胞分裂中のタンパク質ダイナミクスの理解を深めることができます。
- 本プロトコルは、細胞生物学における今後の研究に活用可能です。
よくある質問
産業界における重要性
セントロメアおよびキネトコアタンパク質の定量的免疫蛍光解析は、細胞分裂研究における重要な転換点である染色体分離メカニズムの精密な検証を可能にします。この能力により、有糸分裂制御に焦点を当てた創薬探索段階のプログラムにおいて、ターゲットバリデーションおよびメカニズムのデリスキングに対する予測精度の向上が期待できます。内因性および外因性タンパク質のロバストな局在化および定量化ワークフローは、初期探索およびトランスレーショナルリサーチにおけるポートフォリオ決定を促進します。
バイオ医薬品研究開発における戦略的応用
初期創薬およびターゲットバリデーション
- ヒト細胞におけるセントロメア・キネトコアタンパク質の局在の直接的な可視化および定量化を可能にします。
- 遺伝的または化学的な摂動がタンパク質のターゲティングに及ぼす影響を区別することで、メカニズム解析におけるリスク低減をサポートします。
- 染色体分離の忠実度に関与する候補ターゲットの機能的検証を容易にします。
- パスウェイ解析および仮説検証のための定量的なベンチマークを提供します。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 有糸分裂調節因子のハイコンテンツスクリーニングに適応可能な、検証済みの免疫蛍光プロトコルを提供します。
- 実験条件を問わず、内因性および外因性タンパク質変異体の再現性のある検出を保証します。
- 化合物または遺伝子スクリーニングにおける比較分析に適した定量的な読み取りを可能にします。
- 研究室間およびプラットフォーム間の研究に向けたアッセイの標準化をサポートします。
トランスレーショナル＆前臨床研究
- 染色体不安定性に結びつくタンパク質の誤局在化の検出を可能にすることで、疾患関連モデルとの整合性を確保します。
- 構築された細胞システムにおけるバイオマーカーの定量化をサポートし、創薬から前臨床検証までの連続性を提供します。
- タンパク質局在の定量データに基づいた、リスク調整後の進捗判断を容易にします。
パイプラインおよびワークフローの統合
この免疫蛍光染色プロトコルは、創薬から前臨床までのコンティニュアムに統合されており、初期のメカニズム研究と、リード化合物同定のためのダウンストリームアッセイ開発の両方をサポートします。
- 探索生物学：セントロメア・キネトコア蛋白質の機能および局在に関する仮説主導の検証を可能にする。
- スクリーニング：有糸分裂経路を標的としたスクリーニングキャンペーンにおいて、定量的で再現性のある免疫蛍光読み取り値を提供する。
- アナリティクス：実験群間における蛋白質の局在および発現の統計的比較をサポートする。
- トランスレーショナルリサーチ：染色体不安定性症候群に関連する蛋白質の局在異常を定量化することで、探索的な知見を前臨床モデルへと橋渡しする。
- エンタープライズ再利用：多様な標的蛋白質および細胞系に適応可能な、標準化されたワークフローを提供する。
運用およびエンタープライズへの影響
- 科学的価値：標的バリデーションにおける予測信頼性を高め、有糸分裂経路研究におけるメカニズムの曖昧さを軽減します。
- 運用的価値：再現可能な免疫蛍光分析のための、標準化され拡張可能なプロトコルを提供します。
- 戦略的価値：堅牢な定量データを提供することにより、Go/No-Go判断の精度を向上させ、資本効率を改善します。
- ポートフォリオへの影響：メカニズムの知見に基づいた、リスク調整済みの標的およびプログラムの優先順位付けを可能にします。
実施上の考慮事項
- 免疫蛍光顕微鏡法および定量的な画像解析に関する専門知識が必要です。
- 検証済みの抗体および高品質なイメージング装置へのアクセスが不可欠です。
- 再現性を確保するため、固定および染色のプロトコルについてチーム間での標準化が必要です。
- さまざまな細胞モデルに適応可能ですが、特定のタンパク質タグや固定化学法に合わせて最適化が必要な場合があります。
- 危険試薬の慎重な取り扱いと安全プロトコルの遵守が不可欠です。
