Name: 内因性の免疫蛍光分析および外因性セントロメア、動原体タンパク質 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 35 s
Description: 学ぶ間接免疫蛍光法によるヒト細胞における内因性・外因性セントロメア・動原体タンパク質の局在化と定量解析。パラホルムアルデヒドなど各種固定法を用いて、CENP-Aなどのタンパク質検出を最適化する手法を解説します。

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近年では多くの研究が固定された細胞のための異なる定量的な顕微鏡アッセイを開発した。42セントロメア動原体の生物学の進歩は、多くの場合、細胞内の空間的・時間的規制はの変更機能を反映するのタンパク質のセントロメア特異的または動原体特異的な機能を理解する必要があります細胞周期の間に、これらのタンパク質。そこで、ここではIIF染色、具体的に異なって処理されたサンプルで適用することができる内因性および外因性のCENP-A蛋白質の相対レベルを、分析するための定量的IIFアッセイの方法を開発しました。現在、我々はこの研究でプロトコル2を使用して、内因性CENP-I、CENP-H、KNL1、Hec1、およびSka1の成功IIF染色を達成した（新倉ら 24と示されていないデータを参照してください;抗体の情報のための材料/機器のリスト） 。将来的には、1は、（異なるセントロメア動原体タンパク質のレベルを定量化するために、両方のendogを同じ方法を適用することができます特異的な抗体を選択）enousおよびFLAGタグ外因性タンパク質は、しかし、私たちのIIFの方法は、生細胞内または細胞全体のサイ...

「セントロメア」は、古典的遺伝学の抑制減数分裂期組換えの領域として定義され、それ以降の有糸分裂の間に正確な染色体の分離において重要な役割を果たしている有糸分裂染色体の一次狭窄、として認識されました。 「動原体」は、電子顕微鏡によって明らかにされるように、動原体の表面に微小管に結合した多層構造として説明しました。 「動原体」は、後に、有糸分裂の染色体のセントロメアに局在高分子複合体として定義されていました。脊椎動物の中で動原体DNA配列の劇的な相違にもかかわらず、動原体の構造および組成は、高度に保存されています。スピンドル微小管と動原体の間の動的相互作用は、忠実な有糸分裂時の染色体の分離、および異数性およびそれによって癌にセン​​トロメア動原体機能のリードの欠陥のために必要とされます。 ほとんどの真核生物におけるセントロメア何も定義されたDNA配列を持っていませんが、171-bpのαサテライトDNAからなる反復アルフォイドDNAの大規模な配列（0.3-5 MB）で構成されています。出芽酵母を除いて、セントロメアのアイデンティティはないDNA配列ではなく、ヒストンH3バリアントCenH3（ヒトにおけるセントロメアプロテインA [CENP-A]）を含む特別なヌクレオソームの存在によって達成される。5 CENP-Aヌクレオソームがに局在します171-bpのαサテライトDNAに対する哺乳動物動原体7と結合するのインナープレート。アクティブ動原体は、一緒に紡錘体チェックポイントを介して紡錘体とそれに続く周期の進行に染色体の付着を調節する構成的セントロメア関連するネットワーク（CCAN）の動員および動原体タンパク質を、指示するためにCENP-Aを含むヌクレオソームが必要です。 上記の証拠に照らして、CENP-Aはセントロメア8のエピジェネティックなマークであることが提案されています。しかしながら、CENP-Aが組み込まれたプロセスは、私NtoのセントロメアDNAと、この取り込みを担当する要因はまだ十分に特徴付けられていません。ショートセントロメア標的化ドメイン（CATD）は、CENP-Aの領域に折り畳むヒストンに常駐し、CATDとH3の対応する領域の交換が動原体への直接H3に十分なものである。9いくつかの研究は、翻訳後のための機能的役割を示唆しましたCENP-12-16の変更（PTM）。しかし、動原体への動員においてCENP-AのこれらのPTMの分子メカニズムはまだ解明されていません。我々は以前CUL4A-RBX1-COPS8 E3リガーゼ活性が動原体にCENP-AのCENP-A K124のユビキチン化およびローカライズのために必要とされていることを報告した。17 動原体タンパク質の発見および特徴付けは、染色体分離に関する新たな知見をもたらしている。18 100以上の動原体の構成要素は様々なアプローチによって、脊椎動物細胞で同定されている。19,20の下で動原体が集合し、機能はまた、細胞内の各セントロメア-動原体タンパク質の細胞機能の特性評価およびタンパク質間ネットワークから来ている。19直接可視化し、蛍光顕微鏡での高度な画像処理方法が動原体動原体の構成要素の著しい分解能を提供し、許可する方法のスタンディングセントロメアと動原体の特定の分子成分の直接観察。また、特異的な抗体を用いた間接蛍光抗体法（IIF）染色は、これらの観​​測に不可欠です。しかし、IIFプロトコルに関する多くの報告にもかかわらず、特定のセントロメア-動原体タンパク質の詳細な問題に議論少数。1-4はこのように、開発と特異的に各セントロメア動原体タンパク質を分析するIIF染色および定量IIFアッセイの方法を報告することは非常に重要です。 IIF染色では、一つの目的のタンパク質の損失を回避するために、染色プロトコルを進めるべきですかセルの残りの部分。しかし、固定は時折抗原部位を破壊し、異なる抗体-抗原の組み合わせは、他と非常によく1固定液で十分に機能しない、しかし、21および固定剤の選択は、目的のタンパク質（複数可）に大きく依存します。したがって、異なる固定液法が動原体動原体タンパク質のIIF染色で重要です。 間接免疫蛍光（IIF）染色およびCENP-AおよびFLAGタグ外因性のCENP-A蛋白質、およびヒト細胞におけるこれらのタンパク質の定量を含む内因性のセントロメア-動原体タンパク質の局在化に対処するためのアッセイのここで最適化された方法が開発されています。これらの方法は、他の種におけるセントロメア、動原体タンパク質の分析に適用することができます。

<table><tbody><tr><td>Lipofectamin 2000</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>11668</td><td>トランスフェクション試薬 I</td></tr><tr><td>リポフェクタミン RNAiMAX</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>13778</td><td>トランスフェクション試薬 II</td></tr><tr><td>Opti-MEM I</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>31985</td><td>還元血清培地、温度 37°C;Cウォーターバス使用前の</td></tr><tr><td>高グルコースDMEM(Dulbecco'修正されたイーグル」s medium)</td><td>Life Technologies/BioWhittaker</td><td>12-604</td><td>高グルコースDMEM、37°Cで暖かい;Cウォーターバス使用前</td></tr> ウ<tr><td>シ胎児血清、認定、熱不活性化、米国原産</td><td>Life Technologies/Gibco</td><td>10082</td><td>FBS(ウシ胎児血清)</td></tr><tr><td>ポリ-L-リジン 溶液</td><td>SIGMA-SLDRICH</td><td>P 8920</td><td>ポリ-L-リジン、0.1% w/v、水中</td></tr><tr><td>UltraPure 蒸留水</td><td>Life Technologies/Invitrogen/Gibco</td><td>10977</td><td>滅菌組織培養グレード水&nbsp;</td></tr><tr><td>マイクロカバーガラス(22mm×22mm)&nbsp;</td><td>Surgipath</td><td>105</td><td>カバーガラス (22 mm x 22 mm)&nbsp;</td></tr><tr><td>6ウェル細胞培養クラスター</td><td>Fisher/Corning Incorporated</td><td>07-200-83</td><td>6ウェルポリスチレンプレート&nbsp;</td></tr><tr><td>ペニシリン、ストレプトマイシン;リキ</td><td>ッドフィッシャー/ギブコ</td><td>15-140</td><td>ペニシリン-ストレプトマイシン</td></tr><tr><td>PAP PEN&nbsp;</td><td>結合部位</td><td>AD100.1</td><td>疎水性バリアペン(免疫蛍光染色用撥水バリア用)</td></tr><tr><td>パクリタキセル(タキソール)</td><td>SIGMA-SLDRICH</td><td>T7402</td><td>有糸分裂細胞解析用タキソール</td></tr><tr><td>TN-16、微小管阻害剤(TN16)</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>BML-T120</td><td>TN16 有糸分裂細胞解析用</td></tr><tr><td>BSA(ウシ血清アルブミン)</td><td>SIGMA-SLDRICH</td><td>A7906</td><td>ブロッキング試薬</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>SIGMA-SLDRICH</td><td>T8787</td><td>透過性パラ</td></tr><tr><td>ホルムアルデヒド</td>用洗剤 <td>SIGMA-SLDRICH</td><td>P6148</td><td>固定用</td></tr><tr><td>試薬 DAPI</td><td>SIGMA-SLDRICH</td><td>D9542</td><td>核染色用</td></tr><tr><td>p-フェニレンジアミン</td><td>SIGMA-SLDRICH</td><td>P6001</td><td>封入用液</td></tr><tr><td>VWR マイクロスライド つや消し</td><td>VWR International</td><td>48312-013</td><td>マイクロスライド&nbsp;</td></tr><tr><td>抗CENP-A抗体</td><td>Stressgen/Enzo Life Sciences</td><td>KAM-CC006</td><td>マウスモノクローナル抗体 希釈倍率 1:100 (IIF), 1:5000 (WB)</td></tr><tr><td>抗CENP-B抗体</td><td>Novus Biologicals</td><td>H00001059-B01P</td><td>マウスモノクローナル抗体 希釈倍率1:200 (IIF, メタノール/アセトン固定)-1:400 (IIF, パラホルムアルデヒド固定)</td></tr><tr><td>抗CENP-B抗体&nbsp;</td><td>abcam</td><td>ab25734</td><td>ウサギポリクローナル抗体; 希釈比 1:200 (IIF, メタノール/アセトン固定)-1:400 (IIF, パラホルムアルデヒド固定)</td></tr><tr><td>抗セントロメア抗体 (ACA)</td><td>Fitzgerald Industries International, Inc.</td><td>90C-CS1058</td><td>Human centromere antiserum; dilution ratio of 1:2000 (IIF)</td></tr><tr><td>Anti-CENP-H antibody</td><td>Bethyl Laboratories</td><td>BL1112 (A400-007A)</td><td>Rabbit polyclonal antibody; dilution ratio of 1:200 (IIF)</td></tr><tr><td>Anti-CENP-H antibody</td><td>BD</td><td>612142</td><td>Mouse monoclonal antibody; dilution ratio of 1:200 (IIF)</td></tr><tr><td>Anti-CENP-I antibody</td><td>N/A, Dr. Katusmi Kitagawa</td><td>N/A, Dr. Katusmi Kitagawa</td><td>ウサギポリクローナル抗体;希釈比は1:1000(IIF)です。Niikura et al., Oncogene, 4133-4146 (2006)</td></tr><tr><td>抗KNL1抗体</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP1-89223</td><td>Rabbit polyclonal antibody; dilution ratio of 1:100 (IIF)</td></tr><tr><td>Anti-Hec1 antibody</td><td>Novus Biologicals / GeneTex</td><td>NB 100-338 / GTX70268</td><td>Mouse monoclonal antibody; dilution ratio of 1:100 (IIF)</td></tr><tr><td>Anti-Hec1 antibody</td><td>GeneTex</td><td>GTX110735</td><td>Rabbit polyclonal antibody; dilution ratio of 1:100 (IIF)1:100 (IIF)</td></tr><tr><td>抗Ska1抗体</td><td>abcam</td><td>ab46826</td><td>ウサギポリクローナル抗体 希釈倍率 1:100 (IIF)</td></tr><tr><td>抗フラグ抗体</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>F3165</td><td>マウスモノクローナル抗体 希釈倍率 1:1000 (IIF), 1:5000 (WB)</td></tr><tr><td>抗フラグ抗体</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>F7425</td><td>ウサギポリクローナル抗体 希釈倍率 1:1000 (IIF), 1:5000 (WB)</td></tr><tr><td>抗CUL4A抗体</td><td>N/A, Dr. Pradip Raychaudhuri</td><td>N/A, Dr. Pradip Raychaudhuri</td><td>Rabbit polyclonal antibody;希釈比1:3000 (WB);Shiyanov et al., The Journal of biological chemistry, 35309-35312 (1999)</td></tr><tr><td>Anti-RBX1 antibody</td><td>Cell Signaling</td><td>4397</td><td>Rabbit polyclonal antibody; dilution ratio of 1:2000 (WB)</td></tr><tr><td>Anti-GAPDH antibody</td><td>Chemicon</td><td>MAB374</td><td>Mouse monoclonal antibody; dilution ratio of 1:5000 (WB)</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG Life</td><td>Technologies/Invitrogen</td><td>A11001</td><td>蛍光色素標識二次抗体 (Affinity-purified secondary antibody)</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG Life Technologies</td><td>/Invitrogen</td><td>A11005</td><td>fluorophore-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody)</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG Life Technologies</td><td>/Invitrogen</td><td>A11008</td><td>fluorophore-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody)</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Goat Anti-Rabbit IgG Life Technologies</td><td>/Invitrogen</td><td>A11012</td><td>fluorophore-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody)</td></tr><tr><td>無脂肪粉乳 (カーネーション粉ミルクの代替品として承認</td>)<td>Fisher Scientific</td><td>NC9255871 (Reorder No. 190915;Lot# 90629)</td><td>脱脂乳</td></tr><tr><td>ライカ DM IRE2 電動蛍光顕微鏡&nbsp;</td><td>ライカ</td><td></td><td>電動蛍光顕微鏡&nbsp;</td></tr><tr><td>HCX PL APO 63x 油浸レンズ</td><td>ライ</td><td>カ LEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PH 3 CS</td><td>63X 油浸レンズ</td></tr><tr><td>HCX PL APO 100x 油浸レンズ</td><td>ライカ</td><td>LEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PHE</td><td>100X 油浸レンズ</td></tr><tr><td>ライカ EL6000 コンパクト光源</td><td>ライカ</td><td></td><td>蛍光励起用外部コンパクト光源</td></tr><tr><td>ORCA-R2 デジタルCCDカメラ&nbsp;</td><td>浜松ホトニクス</td><td>C10600-10B</td><td>デジタルCCDカメラ&nbsp;</td></tr><tr><td>Openlabバージョン5.5.2科学イメージングソフトウェア&nbsp;</td><td>Perkin Elmer/Improvision</td><td></td><td>画像観察、取得、定量化、分析用</td></tr><tr><td>Velocity version 6.1.1 3D画像解析ソフトウェア&nbsp;</td><td>Perkin Elmer/Improvision</td><td></td><td>画像観察、取得、定量化、分析用</td></tr><tr><td>完全なEDTAフリープロテアーゼ阻害剤カクテル</td><td>ロシュ</td><td>11873580001/11836170001</td><td>プロテアーゼ阻害剤カクテル錠</td></tr><tr><td>PlusOne 2-D Quant Kit</td><td>Amersham Biosciences</td><td>80-6483-56</td><td>タンパク質濃度の測定用市販タンパク質アッセイ試薬I(2% SDSに対応)</td></tr><tr><td>バイオ・ラッド プロテインアッセイ</td><td>バイオ・ラッド</td><td>500-0006</td><td>市販のタンパク質濃度測定試薬 II (0.1% SDS 対応)</td></tr><tr><td>Immobilon-FL</td><td>EMD Millipore</td><td>IPFL00010</td><td>PVDF 膜</td></tr><tr><td>IRDye 800CW ヤギ抗マウス IgG</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>926-32210</td><td>IR 蛍光色素標識二次抗体 (アフィニティー精製二次抗体); 希釈比1:20000 (IIF)</td></tr><tr><td>IRDye 680 Goat Anti-Rabbit IgG</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>926-32221</td><td>IR 蛍光色素標識二次抗体 (Affinity-purified secondary antibody); 希釈比 1:20000 (IIF)</td></tr><tr><td>Goat anti-Mouse IgG DyLight 549</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI35507</td><td>DyLight-conjugated secondary antibodyIR fluorescent dye-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody); 希釈比 1:20000(IIF)</td></tr><tr><td>ヤギ抗ウサギ DyLight 649</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI35565</td><td>DyLight標識二次抗体IR 蛍光色素標識二次抗体 (Affinity-purified secondary antibody); 希釈比 1:20000 (IIF)</td></tr><tr><td>ヤギ抗マウス IgG-HRP</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-2005</td><td>HRP 標識二次抗体DyLight標識二次抗体IR 蛍光色素標識二次抗体 (Affinity-purified secondary antibody抗体);希釈倍率 1:10000 (IIF)</td></tr><tr><td>ヤギ抗ウサギ IgG-HRP</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-2004</td><td>HRP 標識二次抗体DyLight標識二次抗体IR 蛍光色素標識二次抗体 (Affinity-purified secondary antibody); 希釈倍率 1:10000 (IIF)</td></tr><tr><td>Openlab version 5.5.2.科学イメージングソフトウェア&nbsp;</td><td>Improvision/PerkinElmer</td><td></td><td>Software A</td></tr><tr><td>Volocity version 6.3 3D Image Analysis Software (Volocity Acquisition)</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>Software B1</td></tr><tr><td>Volocity version 6.3 3D Image Analysis Software (Volocity Quantification)</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>Software B2</td></tr><tr><td>Branson SONIFIER 450</td><td></td><td></td><td>Sonicator</td></tr><tr><td>Branson Ultrasonics sonicator Microtip Step, Solid,ねじ式9.5 mm</td><td>VWR Scientific Products Inc.</td><td>&nbsp;33995-325</td><td>超音波処理用ディスラプターホー</td></tr>ンブラン<tr><td>ソン超音波超音波発生器マイクロチップテーパー6.5 mm</td><td>VWRサイエンティフィックプロダクツ株式会社</td><td>&nbsp;33996-185</td><td>超音波処理用マイクロチップ</td></tr><tr><td>Odyssey CLx 赤外線イメージング システム&nbsp;</td><td>LI-COR Biosciences</td><td></td><td>イムノブロット検出用赤外線イメージングシステム</td></tr><tr><td>Image Studio 解析ソフトウェア Ver 4.0&nbsp;</td><td>LI-COR Biosciences</td><td></td><td>Software C</td></tr><tr><td>Molecular Imager Versadoc MP4000 システム&nbsp;</td><td>バイオ・ラッド</td><td></td><td>イムノブロット検出用化学発光イメージャー</td></tr><tr><td>Quantity One 1-D 解析ソフトウェア&nbsp;</td><td>バイオ・ラッド</td><td></td><td>ソフトウェア D</td></tr><tr><td>SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate</td><td>Thermo</td><td>34095</td><td>超高感度化学発光 (ECL) 基板</td></tr></tbody></table>

内因性の免疫蛍光分析および外因性セントロメア、動原体タンパク質

 Immunofluorescence Analysis of Endogenous and Exogenous Centromere-kinetochore Proteins

「セントロメア」と「キネトコア」は、細胞分裂中に染色体が紡錘体と会合する部位を指します。細胞周期中のセントロメア-動原体タンパク質の直接可視化は、これらのタンパク質のメカニズムを調査するための基本的なツールであり続けています。蛍光顕微鏡の高度なイメージング法により、セントロメア-動原体成分の優れた分解能が得られ、セントロメアと動原体の特定の分子成分を直接観察できます。さらに、特異的抗体を用いた間接免疫蛍光染色(IIF)の方法も、これらの観察に不可欠です。しかし、IIFのプロトコルに関する多数の報告にもかかわらず、特定のセントロメア-キネトコールタンパク質の問題を詳細に議論したものはほとんどありませんでした。1-4 ここでは、パラホルムアルデヒド固定とIIF染色を使用して、ヒト細胞内の内因性セントロメア-動原体タンパク質を染色するための最適化されたプロトコルを報告します。さらに、アセトンまたはメタノール固定を受けたヒト細胞内のFlagタグ付き外因性CENP-Aタンパク質を検出するためのプロトコルを報告しています。これらの方法は、内因性セントロメア-動原体タンパク質およびFlagタグ付きCENP-Aタンパク質(ヒト細胞を含む)の検出および定量に有用です。

内因性のCENP-Aの免疫蛍光分析は、CUL4A-E3リガーゼは、セントロメアにCENP-Aの局在に必要とされるという仮説を支持します 我々の最近の研究では、CUL4A-RBX1-COPS8 E3リガーゼ活性がCENP-Aおよび動原体へのCENP-Aの局在化に対するリジン124（K124）のユビキチン化のために必要とされることを示した。17最初に、相間-動原体複合体（ICENが）によって単離しました抗CENP-A：ネイティブクロマチン免疫沈降、32-34、ICENタンパク質のいくつかはセントロメアにCENP-Aをローカライズする役割を果たしていると仮定されています。したがって、siRNAノックダウン実験は、その不在発現の動原体17にCENP-Aの非局在化を誘導したタンパク質をスクリーニングするために実施した（データは示していない）：非同期的に成長したHeLa細胞を、回カリン4A（CUL4A）siRNAまたはRBX1のsiRNAをトランスフェクトしました。最適な...

ここでは、ヒト細胞内の内因性および外因性のセントロメア-動糖体タンパク質を検出し、固定(パラホルムアルデヒド、アセトン、またはメタノール固定)の使用による間接免疫蛍光染色により、セントロメア-キネトコアでのこれらのタンパク質レベルを定量するプロトコールを報告します。

"Centromeres" and "kinetochores" refer to the site where chromosomes associate with the spindle during cell division. Direct visualization of ...

この間接免疫蛍光法の全般的目的は、ヒト細胞におけるセントロメアタンパク質AおよびFLAGタグ付き外来性CENP-Aタンパク質を含む、内因性および外来性のセントロメア-キネトコアタンパク質の局在化と定量を最適化することです。この手法は、セントロメア-キネトコアタンパク質をどのように同定し定量するかという重要な疑問に答えるのに役立ちます。本手法の主な利点は、関心のある後期の段階に応じて、異なるレベルのセントロメア-キネトコア発現量を定量できることです。播種から18時間後、培養細胞をPBSで1回洗浄し、6ウェルポリスチレン培養プレートの各ウェルに500 µLの低血清培地を加えます。次に、各ウェルの細胞に調製したばかりのAおよびB混合溶液をトランスフェクションし、37 °C、5% CO2条件下で培養します。4時間半後、培地をFBSおよび抗生物質を添加した高グルコースDMEMに交換し、プレートを細胞培養インキュベーターに戻します。48～72時間後、細胞培養液を吸引し、PBSで細胞を1回洗浄します。この際、細胞が剥がれないよう、培養ウェルの壁面に沿って緩衝液を加えてください。次に、4%パラホルムアルデヒドを用いて、4°Cで30分間細胞を固定します。固定期間の終了後、Kb2バッファーで細胞を2回洗浄し、室温でKb1バッファーを用いて30分間サンプルの透過処理を行います。次に、細胞をKb2バッファーで1回洗浄し、新鮮なKb2バッファーを加えて非特異的結合をブロックします。室温で5分間静置した後、ピンセットを用いて各ウェルから播種したカバーガラスを取り出し、疎水性バリアペンを使用して各カバーガラスサンプルの周囲に疎水性バリアを描きます。カバーガラスを新しい6ウェルポリスチレンプレートに移し、適切な一次抗体に浸して37 °Cで1時間反応させます。次に、細胞をKb2緩衝液で3回洗浄し、適切な二次抗体を用いて37°Cでさらに1時間ラベルします。インキュベーション終了後、Kb2緩衝液で6分間の洗浄を5回行い、サンプルを洗浄します。その後、DapEを含むKb3緩衝液を用いて室温で5分間細胞核をラベルし、続いてKb2緩衝液で1〜2回洗浄し、ウェルにKb2緩衝液を満たします。次に、細胞が入ったカバーガラス1枚につき、顕微鏡スライド1枚の中央に封入剤を1滴ずつ滴下し、細胞サンプルの余分な液体を取り除きます。最後に、各サンプルを準備した顕微鏡スライドの中央に慎重に配置し、余分な封入剤をペーパータオルで取り除きます。この代表的な実験で観察されたように、CUL4A siRNAを導入した細胞の全細胞ライセートにおける内因性CENP-Aタンパク質の発現レベルは、Luciferase siRNAを導入した細胞におけるCENP-Aの発現レベルと同程度でした。さらに、RBX1 siRNAを導入した細胞の全細胞溶解液における内因性CENP-Aのタンパク質レベルは、Luciferase siRNAを導入した細胞の内因性CENP-Aレベルと同等であり、CUL4A RBX1 E3リガーゼがCENP-Aのセントロメアへの局在に必要であることが示唆された。CENP-Aのリシン変異体はセントロメア内に局在する能力を失っており、CENP-A K124のユビキチン化がCENP-Aのセントロメアへの局在に不可欠であることが示唆された。重要なことに、外来性のモノユビキチン融合CENP-Aタンパク質によってCENP-A K124R変異体の脱局在が回復し、タンパク質がセントロメアの位置に戻った。細胞固定および免疫蛍光染色の手順を習得し、適切に実施すれば、5〜6時間で完了させることができます。洗浄やサンプルの浸漬時に細胞がカバーガラスから剥がれないよう、すべての溶液はウェルの壁面に沿って静かに加えるようにしてください。換気設備のない場所で加熱したパラホルムアルデヒドを取り扱うことや、火気の近くに可燃性物質を置くことは極めて危険であるため、本手順の実施にあたっては常に適切な予防措置を講じてください。

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Biology

生物学

ここでは、3D顕微鏡や分析（3D免疫DNA FISH）が続いたDNA...

3D原子力組織の変化を研究するために3D保存状態間期核に組み合わさ免疫やDNA FISH

ショウジョウバエの精子形成時に中心体タンパク質のイメージングは、中心体生物学のための重要な新しいタンパク質を同定するだけでなく、このプロセスにおける既知の選手の特定の機能を解明するために強力な方法である。...

フライ精巣における撮像中心体

ここでは、タンパク質の蛍光強度を適切な内部標準の蛍光強度に正規化することにより、中心体におけるタンパク質のレベルの変化を測定するための新しい定量的蛍光アッセイが開発されています。...

中心体におけるタンパク質レベルの変化を測定するための定量的免疫蛍光アッセイ

サイクリン依存性キナーゼ 1 (Cdk1) 細胞周期 G2 段階で活性化し、多くの細胞経路を調節します。この重要なキナーゼの細胞内標的を確立するため Cdk1 固有のリン酸化部位の同定を可能にする Cdk1...

サイクリン依存性キナーゼ 1 の同定の in Vitroキナーゼによって特定のリン酸化のサイトの試金します。

浄化し、多数の超解像顕微鏡法と平均単一粒子の影響を受けやすい向きが異なる由来のイメージ戦略を開発しました。...

分離とクラミドモナス由来の単一粒子再構成のための蛍光イメージング

CENP-Aのユビキタスは、細胞分裂間の二量体化によって受け継がれ、細胞の生存率に不可欠なセントロメレでのCENP-A沈着にとって重要な要件です。ここでは、EYFP タグ付き CENP-A (EYFP-CENP-A)...

EYFP タグ付き CENP-A (EYFP-CENP-A) のユビキタス性を同定するための質量分析分析

DNA損傷の後、ヒト細胞はゲノムの完全性を回復するために不可欠な修復経路を活性化する。ここでは、DNA修復タンパク質を検出し、その空間的および時間的なリクルートメントを分析し、DNA損傷部位におけるタンパク質とタンパク質相互作用を問い合わせた手段として、間接的な免疫蛍光の方法を説明する。...

免疫蛍光によるDNA修復タンパク質相互作用の可視化

ここで提示される、インタクト組織における超解像ライブ細胞イメージングのためのプロトコルである。我々は、そのネイティブ組織環境で非常に敏感な成体幹細胞集団をイメージングするための条件を標準化しました。この技術は、生きた組織における生物学的現象の直接観察を可能にするために、時間的および空間的分解能のバランスを取ることを含む。...

細胞下構造の超分解能ライブ細胞イメージング

染色体分配の誤りは、卵母細胞に共通する特徴です。したがって、紡錘体アセンブリのチェックポイントを研究することは、健康な卵を生産するために必要なメカニズムについての重要な手がかりを与えます。本プロトコルは、マウス卵母細胞における紡錘体アセンブリチェックポイント完全性を評価するための3つの相補的アッセイを記載する。...

マウス卵母細胞における紡錘体アセンブリチェックポイント完全性の評価

タイムラプス顕微鏡は、出芽酵母の減数分裂を研究するための貴重なツールです。このプロトコルでは、細胞周期同期、タイムラプス顕微鏡、および標的タンパク質の条件付き枯渇を組み合わせて、減数分裂染色体分配中の特定のタンパク質の機能を研究する方法を実証する方法について説明しています。...

S. cerevisiaeの減数分裂を研究するためのタイムラプス顕微鏡とタンパク質のステージ特異的核枯渇の使用

減数分裂前期の染色体移動は、胞子形成の基本であるあまり理解されていない現象です。このプロトコルは、 シロイヌナズナ の男性減数分裂前期におけるセントロメアの動きを取得、分析、および定量化する方法を説明しています。...

シロイヌナズナにおける男性減数分裂前期中のセントロメア運動のライブイメージング特性評価

学ぶ間接免疫蛍光法によるヒト細胞における内因性・外因性セントロメア・動原体タンパク質の局在化と定量解析。パラホルムアルデヒドなど各種固定法を用いて、CENP-Aなどのタンパク質検出を最適化する手法を解説します。

内因性の免疫蛍光分析および外因性セントロメア、動原体タンパク質

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