後期胚および幼虫の超音波処理により促進免疫蛍光染色ショウジョウバエ組織その場で

この手順の全体的な目標は、超音波処理後の蛍光顕微鏡法を使用してC 2の組織を視覚化または染色することです。これは、最初に胚と幼虫のサンプルを収集し、次にホルムアルデヒド、ヘプタン、およびメタノールを使用してそれらを固定することによって達成されます。第2のステップは、抗体の浸透を可能にするためにキューティクルを除去するために、固定サンプルを超音波処理することです。

次に、サンプルを一次抗体および蛍光二次抗体で免疫染色します。最後のステップは、サンプルをグリセロールベースのAntifa溶液にマウントすることです。最終的には、共焦点顕微鏡またはエピ蛍光顕微鏡を使用して、発生中の組織、タンパク質の発現および局在を視覚化します。

この技術の主な利点は、組織解剖などの他の方法よりも、さまざまな発達中の組織を視覚化できることです。一般に、この方法に不慣れな個人は、超音波処理ステップが最大効率を達成するためのいくつかの要因に依存しているため、ソニカプローブの適切な位置決めを含む苦労するでしょう。この手順を実演するのは、私の研究室の才能ある学部生研究者であるAshley FiddlerとLauren Boleです。

実験を開始するには、リン酸緩衝液Triton X 100またはPBTX溶液と結合した小さなペイントブラシを使用して、寒天プレートに集めた胚を慎重に取り出します。次に、サンプルを含んだペイントブラシをセルストレーナーの内側に面した隆起部に拭きます。セルストレーナーの下にペトリ皿カバーを置きます。

次に、PBTXが入った噴出ボトルで絵筆とセルストレーナーの壁をすすぎます。サンプルがストレーナに移されたら、サンプルをメッシュから持ち上げるために十分なPBTXをストレーナに注ぎます。この手順を3回繰り返して、酵母とフライ廃棄物を取り除き、PBTXを取り除きます。

次に、50%漂白剤溶液をストレーナーに注ぎ、幼虫を溶液に5分間座らせます。次に、溶液を取り出します。次に、サンプルをPBTXで洗浄し、サンプルを溶液に3分間放置します。

この手順を5回繰り返し、セルストレーナーの底を乾かします。次に、PBTXと結合した絵筆を使用して、サンプルを1.75ミリリットルのPEMSが入ったシンチレーションバイアルに移します。ドラフトに、250マイクロリットルの37%ホルムアルデヒドと8ミリリットルの試薬グレードを追加します。

シンチレーションバイアルにヘプタンを注入し、バイアルを200RPMで20分間振とうします。次に、水相を除去せずにシンチレーションバイアルに10ミリリットルのメタノールを加え、500RPMで激しく振とうします。振とうした後、すぐに内容物を液体廃棄物容器の上のセルストレーナーに注ぎます。

バイアルにメタノールを追加し、内容物をセルストレーナーに通します。サンプル全体が除去されたことを確認するため。細胞ストレーナーの底を実験用ティッシュで試してください。

次に、ペイントブラシを塗布して、サンプルをストレーナーから0.5ミリリットルのメタノールを含む1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移します。サンプルが沈殿するのを待ちます。次に、ピペットでメタノールを取り出し、新しい0.5ミリリットルのメタノールと交換します。

この手順を3回繰り返し、マイナス20°Cで保存する前に、チューブに最後の0.5ミリリットルのメタノールを追加します。後で、冷凍庫から保存したサンプルを取り出し、ピペットでメタノールを取り出します。次に、50%メタノールリン酸緩衝液TweenまたはPBTW溶液1ミリリットルをチューブに加え、チューブを3分間揺とり出します。

次に、サンプルを1ミリリットルのPBTWで2回すすぎ、サンプルを沈殿させてからピペットでPBTWを引き出し、1.0ミリリットルのウシ血清アルブミンリン酸緩衝トゥイーン(BBTW)をバイアルに加え、3分間振とうします。サンプルが沈殿するのを待ち、ピペットでBBTWを取り出します。この手順を 2 回繰り返します。

サンプルを失うことなく、できるだけ多くのBBTWを除去するように注意してください。次に、チューブに0.5ミリリットルのBBTWを加え、氷の上に置きます。次に、超音波処理を10%最大振幅に設定し、一定の速度で2秒の実行時間を設定し、プローブの先端を脱イオン水で満たされた50ミリリットルの円錐形チューブに配置して、超音波処理を実行します。

次に、超音波処理プローブを実験組織で乾燥させます。プローブをサンプルの3〜4ミリメートル上のチューブに沈め、超音波処理を開始します。次に、チューブを取り外して30秒間氷の上に置いて、超音波処理による過熱を防ぎ、サンプルがチューブの底に沈殿するようにします。

超音波処理が完了した後、サンプルの年齢に応じてこの手順を繰り返します。サンプルを1ミリリットルのBBTWで2回すすぎます。各すすぎ後、BBTWを乾燥させる前にサンプルを沈殿させます ピペットで、バイアルに1ミリリットルのBBTWを追加し、ロッカーに置きます。

3分後、サンプルを沈殿させ、ピペットでBBTWを取り出します。次に、これを繰り返します。2回ステップし、BBTWで希釈した0.5ミリリットルの5%正常血清でサンプルをブロックし、サンプルを室温でロッカーに1時間置きます。

次に、0.5ミリリットルの一次抗体溶液を加え、サンプルを摂氏4度で一晩揺さぶり、サンプルをチューブの底に沈殿させます。次に、ピペットで一次抗体を取り出し、1ミリリットルのBBTWで2回すすぎます。バイアルに1ミリリットルのBBTWを加え、ロッカーに3分間置きます。

次に、ピペットでBBTWを取り外し、これを繰り返します。ステップを5回進め、サンプルを5%正常血清BBTW溶液でブロックし、30分間揺さぶる。次に、溶液を削除します。

5%正常血清BBTW溶液で希釈した二次抗体を添加し、チューブをアルミホイルで包みます。次に、サンプルを摂氏4度で一晩揺さぶります。ピペットで二次抗体を取り出し、1ミリリットルのPBTWでサンプルを2回すすぎます。

次に、バイアルに1ミリリットルのPBTWを加え、ロッカーに5分間置きます。次に、サンプルを沈降させ、ピペットでPBTWを取り出します。これを繰り返します。

ステップを3回実行します。80〜100マイクロリットルのDAB co溶液をチューブに加え、摂氏マイナス20度で保存します。最後に、サンプルをマウントするには、5〜10マイクロリットルのdab BCO p lene diamine、またはPPDアンチフェードを使用します。

その後、蛍光顕微鏡で観察します。これらの4つの共焦点スライスのZ投影は、ショウジョウバエの発生の後期胚期から初期および中期のL 3段階におけるC 2の形態学的特徴および個々の細胞を視覚化するためのプロトコルの有効性を示しています。精巣の成熟は幼虫の発育を通じて動的であるため、精巣の発育はプロトコルの有効性を説明するのに特に優れたシステムです。

これらの画像は、中央Lの3つの脳の赤色およびハブ細胞の生殖細胞と緑色の単一共焦点切片のFUゾーンを強調しています。神経節母細胞、緑色および未成熟および初代ニューロンの未分化ニューロンの免疫染色。赤は、脳葉と腹側神経索に明確な発現パターンを持つ強い染色を示しており、取り付け方向に応じて、背側表面、腹側表面、または矢状断面からの脳組織可視化が可能です。

このin situ 2の技術により、生物学者は、保護キューティクルが抗体の浸透を妨げる生物の組織形態形成における器官の発達を探求することができます。このビデオを見た後、C twoで発生中の組織を視覚化するために、後期胚および幼虫の食道サンプルを超音波処理および免疫染色する方法を十分に理解しているはずです。ホルムアルデヒド、ヘプタン、メタノールの取り扱いは非常に危険であり、ドラフト内での作業などの予防措置が必要であることを忘れないでください。

この手順を実行するときは、適切な手袋と白衣を常に着用する必要があります。