後期胚および幼虫の超音波処理により促進免疫蛍光染色ショウジョウバエ組織その場で
2014年8月14日
免疫染色は、組織内の特定の細胞タイプやタンパク質を可視化するための効果的な技術です。超音波処理を利用することにより、ここに記載されているプロトコルは、免疫染色の前に後期胚および幼虫からショウジョウバエ・メラノガスター組織を解剖する必要性を軽減する。私たちは、ホルムアルデヒド固定全マウント幼虫の免疫染色のための効率的な方法を提供します。
この手順の全体的な目標は、超音波処理後の蛍光顕微鏡法を使用してC 2の組織を視覚化または染色することです。これは、最初に胚と幼虫のサンプルを収集し、次にホルムアルデヒド、ヘプタン、およびメタノールを使用してそれらを固定することによって達成されます。第2のステップは、抗体の浸透を可能にするためにキューティクルを除去するために、固定サンプルを超音波処理することです。
次に、サンプルを一次抗体および蛍光二次抗体で免疫染色します。最後のステップは、サンプルをグリセロールベースのAntifa溶液にマウントすることです。最終的には、共焦点顕微鏡またはエピ蛍光顕微鏡を使用して、発生中の組織、タンパク質の発現および局在を視覚化します。
この技術の主な利点は、組織解剖などの他の方法よりも、さまざまな発達中の組織を視覚化できることです。一般に、この方法に不慣れな個人は、超音波処理ステップが最大効率を達成するためのいくつかの要因に依存しているため、ソニカプローブの適切な位置決めを含む苦労するでしょう。この手順を実演するのは、私の研究室の才能ある学部生研究者であるAshley FiddlerとLauren Boleです。
実験を開始するには、リン酸緩衝液Triton X 100またはPBTX溶液と結合した小さなペイントブラシを使用して、寒天プレートに集めた胚を慎重に取り出します。次に、サンプルを含んだペイントブラシをセルストレーナーの内側に面した隆起部に拭きます。セルストレーナーの下にペトリ皿カバーを置きます。
次に、PBTXが入った噴出ボトルで絵筆とセルストレーナーの壁をすすぎます。サンプルがストレーナに移されたら、サンプルをメッシュから持ち上げるために十分なPBTXをストレーナに注ぎます。この手順を3回繰り返して、酵母とフライ廃棄物を取り除き、PBTXを取り除きます。
次に、50%漂白剤溶液をストレーナーに注ぎ、幼虫を溶液に5分間座らせます。次に、溶液を取り出します。次に、サンプルをPBTXで洗浄し、サンプルを溶液に3分間放置します。
この手順を5回繰り返し、セルストレーナーの底を乾かします。次に、PBTXと結合した絵筆を使用して、サンプルを1.75ミリリットルのPEMSが入ったシンチレーションバイアルに移します。ドラフトに、250マイクロリットルの37%ホルムアルデヒドと8ミリリットルの試薬グレードを追加します。
シンチレーションバイアルにヘプタンを注入し、バイアルを200RPMで20分間振とうします。次に、水相を除去せずにシンチレーションバイアルに10ミリリットルのメタノールを加え、500RPMで激しく振とうします。振とうした後、すぐに内容物を液体廃棄物容器の上のセルストレーナーに注ぎます。
バイアルにメタノールを追加し、内容物をセルストレーナーに通します。サンプル全体が除去されたことを確認するため。細胞ストレーナーの底を実験用ティッシュで試してください。
次に、ペイントブラシを塗布して、サンプルをストレーナーから0.5ミリリットルのメタノールを含む1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移します。サンプルが沈殿するのを待ちます。次に、ピペットでメタノールを取り出し、新しい0.5ミリリットルのメタノールと交換します。
この手順を3回繰り返し、マイナス20°Cで保存する前に、チューブに最後の0.5ミリリットルのメタノールを追加します。後で、冷凍庫から保存したサンプルを取り出し、ピペットでメタノールを取り出します。次に、50%メタノールリン酸緩衝液TweenまたはPBTW溶液1ミリリットルをチューブに加え、チューブを3分間揺とり出します。
次に、サンプルを1ミリリットルのPBTWで2回すすぎ、サンプルを沈殿させてからピペットでPBTWを引き出し、1.0ミリリットルのウシ血清アルブミンリン酸緩衝トゥイーン(BBTW)をバイアルに加え、3分間振とうします。サンプルが沈殿するのを待ち、ピペットでBBTWを取り出します。この手順を 2 回繰り返します。
サンプルを失うことなく、できるだけ多くのBBTWを除去するように注意してください。次に、チューブに0.5ミリリットルのBBTWを加え、氷の上に置きます。次に、超音波処理を10%最大振幅に設定し、一定の速度で2秒の実行時間を設定し、プローブの先端を脱イオン水で満たされた50ミリリットルの円錐形チューブに配置して、超音波処理を実行します。
次に、超音波処理プローブを実験組織で乾燥させます。プローブをサンプルの3〜4ミリメートル上のチューブに沈め、超音波処理を開始します。次に、チューブを取り外して30秒間氷の上に置いて、超音波処理による過熱を防ぎ、サンプルがチューブの底に沈殿するようにします。
超音波処理が完了した後、サンプルの年齢に応じてこの手順を繰り返します。サンプルを1ミリリットルのBBTWで2回すすぎます。各すすぎ後、BBTWを乾燥させる前にサンプルを沈殿させます ピペットで、バイアルに1ミリリットルのBBTWを追加し、ロッカーに置きます。
3分後、サンプルを沈殿させ、ピペットでBBTWを取り出します。次に、これを繰り返します。2回ステップし、BBTWで希釈した0.5ミリリットルの5%正常血清でサンプルをブロックし、サンプルを室温でロッカーに1時間置きます。
次に、0.5ミリリットルの一次抗体溶液を加え、サンプルを摂氏4度で一晩揺さぶり、サンプルをチューブの底に沈殿させます。次に、ピペットで一次抗体を取り出し、1ミリリットルのBBTWで2回すすぎます。バイアルに1ミリリットルのBBTWを加え、ロッカーに3分間置きます。
次に、ピペットでBBTWを取り外し、これを繰り返します。ステップを5回進め、サンプルを5%正常血清BBTW溶液でブロックし、30分間揺さぶる。次に、溶液を削除します。
5%正常血清BBTW溶液で希釈した二次抗体を添加し、チューブをアルミホイルで包みます。次に、サンプルを摂氏4度で一晩揺さぶります。ピペットで二次抗体を取り出し、1ミリリットルのPBTWでサンプルを2回すすぎます。
次に、バイアルに1ミリリットルのPBTWを加え、ロッカーに5分間置きます。次に、サンプルを沈降させ、ピペットでPBTWを取り出します。これを繰り返します。
ステップを3回実行します。80〜100マイクロリットルのDAB co溶液をチューブに加え、摂氏マイナス20度で保存します。最後に、サンプルをマウントするには、5〜10マイクロリットルのdab BCO p lene diamine、またはPPDアンチフェードを使用します。
その後、蛍光顕微鏡で観察します。これらの4つの共焦点スライスのZ投影は、ショウジョウバエの発生の後期胚期から初期および中期のL 3段階におけるC 2の形態学的特徴および個々の細胞を視覚化するためのプロトコルの有効性を示しています。精巣の成熟は幼虫の発育を通じて動的であるため、精巣の発育はプロトコルの有効性を説明するのに特に優れたシステムです。
これらの画像は、中央Lの3つの脳の赤色およびハブ細胞の生殖細胞と緑色の単一共焦点切片のFUゾーンを強調しています。神経節母細胞、緑色および未成熟および初代ニューロンの未分化ニューロンの免疫染色。赤は、脳葉と腹側神経索に明確な発現パターンを持つ強い染色を示しており、取り付け方向に応じて、背側表面、腹側表面、または矢状断面からの脳組織可視化が可能です。
このin situ 2の技術により、生物学者は、保護キューティクルが抗体の浸透を妨げる生物の組織形態形成における器官の発達を探求することができます。このビデオを見た後、C twoで発生中の組織を視覚化するために、後期胚および幼虫の食道サンプルを超音波処理および免疫染色する方法を十分に理解しているはずです。ホルムアルデヒド、ヘプタン、メタノールの取り扱いは非常に危険であり、ドラフト内での作業などの予防措置が必要であることを忘れないでください。
この手順を実行するときは、適切な手袋と白衣を常に着用する必要があります。
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概要
本記事では、超音波処理を用いたキイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）組織の免疫染色のプロトコルを紹介します。この手法により、解剖を行うことなく特定の細胞型やタンパク質の可視化が可能となり、発達組織の研究における効率性が向上します。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 細胞生物学
- 発生生物学
背景
- 免疫染色は、組織内のタンパク質を可視化するために不可欠である。
- 従来の手法では解剖が必要な場合が多く、時間を要することがある。
- 超音波処理（ソニケーション）によって角質層を除去することで、抗体の浸透を促進できる。
- タンパク質の局在を観察するために、蛍光顕微鏡が用いられる。
研究目的
- ホールマウント幼虫のための効率的な免疫染色プロトコルを提供すること。
- Drosophila組織におけるタンパク質発現を可視化すること。
- 固定サンプルの抗体浸透性を向上させること。
使用された手法
- 胚および幼生サンプルの採取。
- ホルムアルデヒド、ヘプタン、およびメタノールを用いた固定。
- 超音波処理によるクチクラの除去。
- 一次抗体および蛍光二次抗体を用いた免疫染色。
主な結果
- 蛍光顕微鏡を用いた、発達組織の可視化に成功。
- 超音波処理により、効果的な抗体浸透を実現。
- サンプル内におけるタンパク質の明確な局在化。
- 本プロトコルにより、免疫染色の手順の効率が向上。
結論
- 本手法により、免疫染色の工程が簡素化されます。
- 超音波処理は、ショウジョウバエ組織の調製において有用な技術です。
- 本プロトコールは、発生生物学における同様の研究に広く採用することが可能です。
よくある質問
産業界における重要性
この超音波処理を利用した免疫蛍光染色の手法は、発生生物学研究における主要なボトルネックである、抗体の浸透を妨げる後期段階のショウジョウバエ（Drosophila）胚および幼虫の不浸透性クチクラという課題を解決します。解剖なしでホールマウント免疫染色を可能にすることで、本プロトコルはスループットを向上させ、組織形態を保持し、遺伝学的および表現型スクリーニングにおける信頼性の高いターゲット検証を支援します。このアプローチは、治療仮説のメカニズム的なリスク軽減に不可欠な、定量的で空間的に分解されたタンパク質発現データを提供することにより、初期探索における予測の信頼性を高めます。
バイオ医薬品研究開発における戦略的応用
初期発見およびターゲットバリデーション
- 科学的価値： 未処理の組織内におけるタンパク質局在の可視化を通じて治療仮説の検証を可能にし、メカニズムに関する曖昧さを軽減します。
- 運用上の価値： 大量のサンプルのハイスループット処理をサポートし、ターゲットバリデーションワークフローの効率を向上させます。
- 戦略的価値： 発達段階を通じて複数の組織タイプ（例：精巣、卵巣、神経組織）の同時解析を可能にし、表現型スクリーニングを促進します。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値： 定量的な蛍光読み取り値を生成し、抗原発現レベルの標準化された評価を可能にします。
- 運用的価値： 組織のin situ構造を維持し、アッセイの再現性を確保するとともに、解剖によるアーティファクトに起因する変動を低減します。
- 戦略的価値： ターゲットへの結合と発現パターンを確認することにより、下流の化合物スクリーニングに向けた検証済み生物学的システムを準備します。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 科学的価値：Drosophilaモデルにおいて疾患に関連する細胞解像度を提供し、神経発達および生殖経路におけるトランスレーショナルなバイオマーカーの探索を支援します。
- 運用上の価値：一貫した組織調製および染色プロトコルを維持することにより、発見から前臨床検証までの連続性を可能にします。
- 戦略的価値：信頼性の高い空間解像度を備えたタンパク質局在データを提供することで、リスク調整済みの進展判断を支援します。
パイプラインおよびワークフローの統合
この手法は、初期のターゲットバリデーションからリード化合物の同定に至る創薬の連続的なプロセスに組み込まれ、特に表現型スクリーニングにおいて、組織の完全性を維持した解析やタンパク質の定量的な局在解析が必要な場合に有用です。
- 探索生物学： 発展中の組織における特定の細胞型およびタンパク質発現の可視化を可能にすることで、仮説検証およびパスウェイの解明を支援します。
- スクリーニング： 化合物評価に適した定量的蛍光出力を持つ、標準化され再現性のある免疫染色により、アッセイの即時利用性を実現します。
- 分析： 測定可能なリードアウト（蛍光強度、局在パターン）を生成し、実験条件の比較やターゲット変調の評価を可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ： ヒト疾患モデルに関連する発生表現型と一致した組織レベルのデータを提供し、前臨床段階への連続性を確保します。
- エンタープライズ再利用： 発達生物学および遺伝的スクリーニングにおける複数のプロジェクトに適用可能な、再利用可能な試料調製能力を確立します。
運用および企業への影響
- 科学的価値： 抗体の浸透不足による偽陰性を減らし、ターゲットバリデーションの精度を向上させることで、予測の信頼性を高めます。
- 運用上の価値： 大量処理に適した、解剖を必要としない合理化されたプロトコルにより、標準化とスケーラビリティを強化します。
- 戦略的価値： 信頼性の高いメカニズム的な知見を提供することで、go/no-go判断を改善し、ターゲット推進における後期の生物学的リスクを低減します。
- ポートフォリオへの影響： 検証済みの発現パターンおよび疾患関連システムにおける機能的関連性に基づいた、リスク調整後のターゲット優先順位付けを可能にします。
実施上の考慮事項
- クチクラの除去を確実に行いつつ、サンプルの損傷を避けるため、超音波処理パラメータ（プローブの位置、振幅、処理時間）の最適化に関する専門知識が必要です。
- 振幅と時間を精密に制御できる超音波処理装置に加え、標準的な免疫蛍光染色試薬および蛍光顕微鏡へのアクセスが不可欠です。
- ユーザー間および研究室間での再現性を確保するため、超音波処理および染色のプロトコルについてチームをまたいだ標準化が必要です。
- サンプルの齢やクチクラの厚さによって超音波処理の効率が異なるため、異なるDrosophila組織の種類や発生段階に応じた適応的な検討が含まれます。
- 低発現の標的に対する抗体インキュベーション時間の最適化や、有害試薬（ホルムアルデヒド、ヘプタン、メタノール）の慎重な取り扱いなどの実用的な制限事項が含まれます。
