エキソソームの定量化とサイズの測定のための革新的方法

この手順の目標は、エキソソームをサイズで分析し、ナノ粒子追跡分析またはNTA装置を使用して半自動法でエキソソームを定量化することです。これは、ヒトの血液からエキソソームペレットを得るために、微分中心化ステップを使用することによって達成されます。エキソソームは、適切な散乱強度を得るために、開始血漿の量に対して予め決定された濃度で再懸濁される。

NTAでは、懸濁液をろ過して、より大きな粒子からエキソソームを分離します。次に、200ナノメートルサイズのポリスチレン粒子を含む制御懸濁液を使用して、NTA機器のキャリブレーションを行います。次に、エキソソーム溶液をNTA機器に注入し、最終テストを実行する前に事前テストを行うことにより、NTAの理想的な設定を選択します。

最終的には、測定されたすべての粒子の定量化と、粒子のサイズ別のリストを示す結果を得ることができます。最良の結果を得るためには、調製した各エキソソーム溶液の溶液と設定を個別に実行する必要があるため、この方法のデモンストレーションは非常に重要です。測定されたエキソソームは、ライブビューモードで画面あたり約600個の粒子が表示されるように、I濃度である必要があります。

また、測定に最適な感度範囲を見つけるために、事前テストを実行する必要があります。感度を高く設定すると、より小さな粒子が視覚化され、バックグラウンドノイズに関連する問題も増加します。この手順は、私たちの研究室の大学院生であるアント・メイによって実演されます エキソソームの準備を開始するには、静脈穿刺を介して3つのクエン酸チューブに全血を合計9ミリリットル集めます。

次に、血液を15ミリリットルのファルコンチューブに注ぎ、サンプルを1,500Gで4°Cの20分間遠心分離して、血漿からの細胞の分離を開始します。Sの新生を新しい15ミリリットルのファルコンチューブに移します。次に、サンプルを2, 800Gで4°Cで20分間再度遠心分離し、血漿からすべての細胞を除去します。

無細胞血漿またはCFPを1本あたり1ミリリットルで超遠心チューブに移します。次に、CFPを100, 000 Gで摂氏4度で90分間遠心分離し、エキソソームを枯渇させます。900マイクロリットルの上清を取り除き、残りの100マイクロリットルにペレットを超遠心チューブに再懸濁します。

PBS遠心分離機の900マイクロリットルを加えた後、摂氏4度で30分間100, 000 Gで得ます。前と同様に、900マイクロリットルの仰臥位剤を取り除き、残りの100マイクロリットルでペレットを再懸濁します。5〜20マイクロリットルのResus懸濁液を40ミリリットルの蒸留水に移します。

懸濁液を450ナノメートルのフィルターでろ過し、より大きな粒子からエキソソームを分離します。この最終懸濁液を粒子測定に使用して、粒子追跡装置を使用します。まず、ソフトウェアアイコンをダブルクリックしてプログラムを起動します。

さまざまなソフトウェアタブをクリックして、プロトコル全体でそれらを切り替えます。画面の指示に従います。スタートアップ手順を自動的に実装するには、セル品質チェックと自動アライメントの両方のボックスを選択します。

これらの手順は、必要に応じてセルチェックタブのボタンAまたはBを押すことで、個別に繰り返すことができます。展望ポートの下にビーカーを置いて廃液を収集し、システムに気泡を注入しないでください。ナノ粒子追跡分析またはNTA装置の入口および見通しポートを開き、注入口を介して細胞チャネルにシリンジで10ミリリットルの蒸留水を注入します。

最後の量の水が注入されているので、すぐに入口と出口のポートを閉じます。測定セルに気泡がないことを確認してください。をクリックして、セル品質チェックを実行します。大丈夫です。

ソフトウェアは、ソフトウェアのライブビュー画面に粒子がまだ視覚化されている場合、または品質チェックの結果が良好または不良である場合は、測定セルLから残りの粒子が除去されるまで遠位水注入を繰り返します。 粒子の蓄積を避けるために、各測定後にこの手順を繰り返します。次に、均一な200ナノメートルサイズのポリスチレン粒子を含むコントロール懸濁液を調製します。レーザーと顕微鏡の焦点を合わせるには、機器メーカーが提供する懸濁液濃縮物を500ミリリットルの蒸留水に1滴加えると、ライブビューの画面ごとに600プラスマイナス100個の粒子が表示されるように必要な濃度になります。

蒸留水プレスの場合と同様に、アライメントサスペンションをNTA機器に注入します。アライメントも開始しても問題ありませんが、これはシステムが2つの焦点の最適な位置を自動的に見つける自動化されたルーチンです。システムが実験の準備ができたことを示すプロンプトが表示されたら、[OK]をクリックして測定を開始します。

実験の合間には、エタノールの30%溶液で細胞を洗い流すことにより、細胞チャネルを手動で洗浄することがあります。ソフトウェアが自動エラーレポートを表示するたびに、チャネルをクリーンアップします。システムの測定を行うため。

まず、各サンプル測定の前に、チャネルを蒸留水で洗い流します。次に、エキソソーム懸濁液をチャネルに注入します。次のステップは、ソフトウェアの主要なパラメータを調整して感度を調整することです。

最適な感度範囲を見つけるには、粒子の数と感度をクリックして、さまざまな感度レベルの画面ごとに測定された粒子の曲線を表示します。曲線の最大傾きの前の感度レベルを選択します。感度レベルが高いほど、より多くの小さな粒子を視覚化できますが、バックグラウンドノイズに関連する問題も増加します。

最小輝度を調整するには、エクソソーム測定の開始輝度を20に選択します。この機能をフィルターとして使用するには、このパラメーターを調整して、強い光散乱粒子をブランクにします。それを調整して、毎週の散乱アーティファクトを増幅し、実験全体で必要に応じて非常に明るくします。

次に、デジタルフィルターを設定して、ピクセルノイズと不要な散乱特大パーティクルを排除します。最小サイズと最大サイズを調整することにより、エキソソームの測定には10〜500ピクセルの範囲を使用します。シャッターを300(3.3ミリ秒)に設定してカメラが開いている時間を変更してシャッターを調整します。

ライブ読み出しパラメータを調整するには、ライブ画像ボタンをクリックして、任意の時点でデジタルビューモードとアナログビューモードを切り替えます。実験全体を通して。散乱強度バーを監視すると、サンプルの彩度ステータスが色分けされたインジケーターとして表示されます。

散乱バーが赤色の場合はエクソソームを解析しないでください。測定を開始するには、測定タブをクリックします。run options 配列で設定を選択します。

各取得の前に、チェック移動、繰り返しチェック粒子ドリフトテストを選択し、実験の数とそれらの間の時間遅延を選択します。必要に応じてサンプルチェックを実行します。最後に、ビデオ取得の実行ボタンをクリックします。

新しいウィンドウで、サイクル数と測定位置の数を定義します。最小時間を確認します。パーティクルは、1 つの個別のパーティクルとしてカウントされるように追跡されます。

ビデオ解像度を設定することで、解像度を低くすると、追跡時間が短くなります。最後に、ファイル名を選択し、[OK]をクリックして測定を開始します。パーティクルの数対感度曲線は、1 つの瞬間に 1 つの位置にあるパーティクルを表示します。

自動感度スキャンでは、グラフの最大傾きの前に感度値が選択されます。このテスト実験ではアーティファクトは排除されず、グラフに影響を与える可能性があります。ライブビュー画面でのパーティクルの視覚化は、適切な感度値を設定するのに役立ちます。

値が小さすぎると、検出されるパーティクルが少なくなります。値が高すぎると画像が悪くなりますが、高品質の粒子は、最適な感度レベルで互いに十分に分離された単一のドットとして表示されます。測定後の「結果」タブでは、トレースされた粒子の総数、位置ごとの平均粒子数、粒子濃度、粒子サイズと粒子数の割合の数値比などのパラメータを読み取ることができます。

測定後に計算されたグラフは、サイズ別の粒子の分布を示しています。表示モードのアイコンを使用して、グラフの設定を変更することができます。また、エクソソームを解析する方法もいくつかあります。

この方法は、同様のメソッド分析を高速プロセスで実行し、短時間で結果を生成するための非常にシンプルでエレガントな方法を示しています。複数のサンプルを比較するには、すべてのサンプルで同じ希釈レベルを維持することをお勧めします。すべての設定は感度を受け入れ、ビデオ解像度は、いくつかの分析ソフトウェアのセットを使用して後で変更することができます。

このようにして、エキソソームの量とサイズに関するさまざまな実験で得られたデータの比較分析が半自動的な方法で利用可能になります。