暗視野顕微鏡を用いた抗体標識ナノ粒子ベースの定量:体液から特定のエクソソームを捕捉し定量する手順

エクソソームは、細胞から細胞外空間に分泌される小さな膜で囲まれた構造です。エクソソームは生体液に豊富に存在します。

体液から特定のエクソソームを同定して捕捉するには、まずマルチウェルイムノアッセイスライドを採取します。このスライドは、抗原として作用し、特異的抗体に結合するタンパク質で機能化されています。

スライドに目的の一次抗体溶液を補充し、インキュベートします。これらの抗体は、スライド表面のプレコート抗原に結合します。

残りの溶液を吸引して、結合していない抗体を除去します。次に、遊離抗原をブロックするブロッキングバッファーを追加して、エクソソームの非特異的結合を防ぎます。

次に、ブロッキングバッファーを除去し、血清懸濁液を含むエクソソームをスライドにロードし、インキュベートします。これにより、標的特異的エクソソームを捕捉した一次抗体に排他的に結合することができます。

次に、金ナノ粒子結合二次抗体の懸濁液をスライド表面にロードします。これらの抗体は、事前に結合したエキソソームに結合し、検出複合体を形成します。

最後に、ピペットを使用して、結合していない二次抗体を破棄します。暗視野顕微鏡でスライドを視覚化します。エクソソームの表面に存在する金ナノ粒子は光を散乱させ、暗い背景に対して明るいスポットとして現れます。

スライドの調製を開始するには、目的のエクソソーム捕捉抗体をPBSで1ミリリットルあたり0.025ミリグラムに希釈します。1マイクロリットルの溶液を、光学グレードのガラスで裏打ちされたプロテインA / G処理スライドの各ウェルにピペットで入れます。次に、スライドを加湿ボックスに移して、インキュベーション中にウェルが乾かないようにします。

スライドを摂氏37度で1時間インキュベートして、捕捉抗体を固定化します。次に、残りの溶液を吸引して、結合していない抗体を除去します。1マイクロリットルのPBSを3回添加および吸引して、ウェルを洗浄します。次に、各ウェルに1マイクロリットルのPBSベースのブロッキングバッファーをすばやくロードし、スライドを摂氏37度で2時間インキュベートします。

約 15 サンプルを実行する場合、ブロッキング剤の蒸発を避けるために、シングル チャネル ピペットを使用して 120 ウェルに作業バッファーを 5 分以内にロードする必要があります。

スライドブロッキング中に抗体結合金ナノロッドの溶液の調製を開始します。ブロッキングが終了する約30分前に、室温の水浴で血漿または血清サンプルを急速に解凍します。解凍したサンプルを30秒間ボルテックスして、懸濁液が均一であることを確認します。次に、サンプルを500 x g で15分間遠心分離して、タンパク質凝集体やその他の破片を沈殿させます。

上清の10マイクロリットルのアリコートを新しいチューブに移し、PBSで1対1の希釈を行います。希釈したサンプルを、必要に応じて穏やかなボルテックスまたは反転によって混合します。スライドブロッキングが終了したら、ブロッキングバッファーを吸引し、1マイクロリットルのPBSでウェルを3回洗浄します。ウェルあたり1マイクロリットル、サンプルあたり8回の繰り返しで、サンプルをすぐにウェルにロードします。

同じ方法でエクソソーム標準物質を適切なウェルにロードします。スライドを摂氏4度の冷蔵庫で12〜18時間インキュベートします。次に、ウェルを吸引し、各ウェルを1マイクロリットルのPBSで1回洗浄します。1マイクロリットルの抗体結合金ナノロッド懸濁液を各ウェルにロードし、スライドを摂氏37度で2時間インキュベートします。

その後、ナノロッド懸濁液を吸引し、0.01%ポリソルベート-20を添加したPBSでミキサーを使用してスライドを10分間洗浄します。次に、ウェルを吸引し、スライドを回転ミキサーで脱イオン水で10分間洗浄します。水を取り除き、スライドを暗視野顕微鏡に持っていく前に、スライドを清潔なペトリ皿で自然乾燥させます。