調整可能な抵抗パルスセンシングを使用して定量化し、細胞外小胞の大きさ、プロファイリング

本実験の全体的な目的は、調整可能な抵抗パルスセンシングを用いて、細胞外小胞の定量およびサイズプロファイリングを行うことです。標準的な手法は、精製された細胞外小胞から得られた電流遮断測定値と、ポリスチレンビーズ標準試料から得られた測定値を比較することです。細胞外小胞を特性評価するもう一つの手法として、サンプルにポリスチレンビーズをスパイクする方法があり、これは未精製の細胞外小胞のような複雑なサンプルを扱う際に用いられます。

細胞培養培地において、得られたデータは、精製済みか未精製かに関わらず、細胞外小胞のサイズと数を特徴付けます。ウェスタンブロッティングやラテックスビーズに結合させた細胞外小胞のフローサイトメトリーなどの既存の手法に対する本手法の主な利点は、物理的な分離や標識を必要とせず、生物学的流体中の粒子を直接的に特徴付けられる点にあります。一般的に、この手法に慣れていない人は、細胞外小胞のサイズが不均一であるため、解析に苦慮することがあります。

より小さな小胞を検出しようとする際、大きな小胞がナノポアを閉塞させることがあります。迅速に動作可能な状態に戻すための実用的なヒントとコツをプロトコルに追加しました。我々は細胞外小胞の産生を抑制することを試み、細胞培養液中の小胞濃度を定量する方法を必要としました。Snet。

ナノ粒子の特性評価手法を探索した結果、我々はTRPSに着目し、SLE（全身性エリテマトーデス）の細胞培養上清およびその他の生物学的流体の特性評価により適するようにプロトコルを修正しました。まず、nProbeコントロールスイートソフトウェアがインストールされたコンピュータにTRPS装置を接続します。テキストプロトコルで述べている通り、電気的干渉を最小限に抑えるようにしてください。

次に、ナノポアのサイズを選択します。70から200 nmの小胞にはNP 100が最適であり、85から300 nmのサイズの小胞にはNP 150を使用できます。100から400 nmの小胞を測定する場合は、NP 200がより適しています。

次に、NP 100およびNP 150には対応するポリスチレン校正粒子を選択し、NP 200にはCPC 100校正粒子を選択します。CPC 200校正粒子を使用してください。校正粒子を30秒間ボルテックスします。

依然として凝集している場合は、超音波処理を行い、その後、校正用粒子をPBSで目的の濃度まで希釈します。ナノポアのサイズに基づき、最終容量は少なくとも40 microlitersである必要があります。次に、78 microlitersのPBSを注入して直ちに除去することで、装置の下部流路セルを湿らせます。

これにより、ナノポアの下に気泡が生じるリスクを低減できます。次に、ナノポアを装置の4本のアームに配置します。デジタル calipers を使用して、向かい合う2つのアーム間の距離を測定してください。

この値をソフトウェアのstretchというフィールドに入力し、入力後、対向アーム間の距離を制御するサイドホイールを使用してcalibrate stretchをクリックします。ナノポアを47 millimetersまで伸長させます。規定のサイズまで伸長させた後、下部の流体セルに78 µLのPBSを再度添加します。

ナノポア上に上部流体セルを配置し、遮蔽ケージを取り付けて校正プロセスを開始します。次に、希釈した校正用粒子 40 µL を上部流体セルに注入します。その後、少なくとも 0.8 kPa の正圧を印加します。

可変圧力モジュール（VPM）を使用して、正の電圧を選択し、「Turn on」をクリックします。次に、ブロッキングを分析しながら、ゆっくりとストレッチを減少させます。キャリブレーション粒子によって生じるイベントを確認します。

ストレッチを減少させると、ブロッケードの高さが徐々に増加し、その結果、信号対雑音比（S/N比）が向上します。電圧を上げることでブロッケードの高さを高めることも可能ですが、RMSノイズが増加する場合もあります。信号トレースパネルで確認し、観察されるブロッケードがバックグラウンドレベルを適切に上回った時点で、ストレッチの減少を停止してください。

次に、パーティクルレートを確認します。ただし、これについてはカットオフ値がそれほど厳格ではありません。パーティクルレートは、理想的には1分あたり少なくとも100個である必要があります。

ただし、粒子数が毎分2000個を超える場合は、サンプルを希釈し、装置を再校正してください。これほど高い粒子数では、本デモンストレーションにおいて不正確な測定結果となる可能性があります。ここでは、あらかじめ精製された脳腫瘍細胞株由来の細胞外小胞の特性評価を行います。

まず、校正用粒子を上部流体セルプレスにロードします。電源を入れ、VPMを用いて圧力を加え、ここで少なくとも500個の粒子のデータを記録します。圧力は0.8 kilopascalを印加します。

オプションとして、これを実現するために多点圧力測定を行うこともできます。印加圧力を上げ、2つ目のキャリブレーションファイルを記録してください。圧力の増分は少なくとも0.2 kilopascalsである必要があります。ここで、上部セルからサンプルを取り出し、1回あたり100 microlitersのPBSを用いてセルを3回洗浄します。洗浄後、糸くずの出ないペーパーで上部流体セルを拭き取ってください。

次に実験サンプルを添加します。ベースライン電流が、キャリブレーション粒子測定時に観察された電流の3%以内である必要があります。そうでない場合は、遮蔽キャップを軽く叩くか回すか、プランジャーを操作するか、あるいはナノポアを完全に除去してDI waterで洗浄してください。

観測される電流が良好な場合は、校正粒子に適用したのと全く同じ圧力を適用します。その後、少なくとも500個の粒子を記録し、データファイルを保存してください。粒子の検出が突然中断されたり、ベースライン電流の低下やRMSノイズの急増が見られた場合は、記録を一時停止し、ナノポアの詰まりを解消してください。

前述と同様に、サンプルをピペッティングします。遮蔽キャップを軽く叩くか回し、プランジャーを押し込むか、あるいはナノポアを完全に除去してDI waterで洗浄します。別の戦略としては、ナノポアの伸長を最大47 millimetersまで伸ばし、VPMからの圧力を約5分間最大に高める方法があります。

これにより、ソフトウェア内でNPOを解除することも可能です。「データ解析」タブに移動し、「未処理ファイル」オプションを右クリックして「ファイルの処理」オプションを選択し、データの処理を開始します。次に、サンプルファイルと校正ファイルを結合させるため、サンプルの隣にあるチェックボックスをクリックします。

キャリブレーション済みカラムで、対応するファイルを選択してOKをクリックします。ソフトウェアに、サイズ、分布、ベースライン期間、半値幅、濃度分析などの異なるサンプル特性が表示されます。

標準的な方法による調製で目詰まりが激しくなる生物学的流体などの試料には、次のアプローチを用います。細胞培養上清（細胞外小胞を含む）を少なくとも50 µL取り、300 Gで7分間遠心分離します。試料とコントロールの両方について、同様の方法で培地のみのコントロールも調製します。上清を20 µL新しいチューブに移し、20 µLのPBSおよび10 million beads/mLに希釈した335 nmポリスチレンビーズストック液を10 µL加えます。

前述と同様に装置をセットアップし、NP 200 Nanoporeを使用して、培地中のビーズのみを含むコントロールサンプルを測定します。まず、正確性を期すため、非ビーズ微小粒子の背景検出がビーズ検出数の10%未満になるまで最小限に抑える必要があります。その後、繰り返し測定を記録する前に、各サンプルを一度ずつ測定します。

これにより、変動するナノポアの状態を各サンプルに分散させることができます。最終的に、キャリブレーションビーズのみのサンプルを再測定することで、各サンプルを合計3回ずつ測定してください。その後、データ解析時に表計算ソフトを使用して濃度計算を行います。

計算例は記述プロトコルに含まれています。U 87 M-G-E-G-F-R-V 3細胞培養上清から超遠心分離により細胞外小胞を精製し、115 nanometerのキャリブレーションビーズを用いて、記載されたプロトコルに従って測定しました。これにより、細胞外小胞のサイズ分布が得られました。

また、サンプルに標準物質を添加する代替アプローチを用い、膠芽腫細胞培養上清から細胞外小胞を直接定量しました。その結果、2つのナノ粒子集団が観察されました。より小さい細胞外小胞と、より大きい既知の標準物質であり、既知の標準物質に基づいたこれら2つの集団のサイズ推定により、小胞集団は140 nanometers超であることが特定されました。

より小さなナノポア開口部を使用することで、より小型の細胞外小胞を検出できた可能性がありますが、その場合は目詰まりが多く発生したと考えられます。習熟すれば、この手法は分析するサンプル数に応じて1時間から4時間で完了できます。本手順を実施する際は、サンプルによってプロトコルのセプタム調整が必要になる場合があることに留意することが重要です。

例えば、より大きな小胞を含むサンプルの場合は、相対的に大きなストレッチ状態で、より大きなナノポアを使用する必要があるかもしれません。また、ナノポアを詰まらせる原因となる細胞残渣を除去するために、サンプルのろ過や遠心分離を行うことで測定がスムーズになります。このビデオを視聴することで、TRPSを用いた細胞外小胞の特性評価方法について十分に理解できたはずです。細胞外小胞サンプルの性質に応じて、標準プロトコルを適用するか、調整済みのスパイクイン法を使用してください。