調整可能な抵抗パルスセンシングを使用して定量化し、細胞外小胞の大きさ、プロファイリング
2014年10月19日
細胞外小胞は、凝固、免疫応答、および癌または薬物送達又は再生医療のような潜在的な治療剤を含む生理学的および病理学的プロセスにおいて重要な役割を果たしている。このプロトコルは、調整可能な抵抗パルスセンシングを用いた各種流体中の絶縁および非単離された細胞外小胞の定量化とサイズ特性評価のための方法を提示します。
次の実験の全体的な目標は、調整可能な抵抗パルスセンシングを使用して細胞外小胞を定量化し、プロファイルをサイジングすることです。標準的なアプローチは、精製された細胞外小胞から取得した電流遮断測定値とポリスチレンビーズ標準から取得した測定値を比較することです。細胞外小胞の特性評価を行うための2つ目のアプローチは、サンプルにポリスチレンビーズをスパイクすることです。これは、未精製の細胞外小胞などの複雑なサンプルを扱う場合に使用されます。
細胞培養培地では、得られたデータは、精製されているかどうかに関係なく、細胞外小胞のサイズと数を特徴付けます。この手法は、ウェスタンブロッティングやラテックスビーズに結合した細胞外小胞のフローサイトメトリーなどの既存の方法と比較した場合の主な利点は、物理的な単離や標識を必要とせずに、生体液中の粒子を直接特性評価できることです。一般に、この方法に不慣れな個人は、細胞外小胞のサイズが不均一であるため、苦労します。
小さな小胞を検出しようとすると、大きな小胞がナノポアを詰まらせる可能性があります。私たちは、迅速に実行可能な状態に戻るために、いくつかの実用的なヒントとコツをプロトコルに追加しました。私たちは細胞外小胞の産生を減らそうと試みましたが、細胞培養中の小胞の濃度を定量化する方法が必要でした。スネット。
ナノ粒子の特性評価の方法を探していたところ、TRPSに出会い、そのプロトコルをSLESや細胞培養の特性評価により適したものに変更しました。S上清、およびその他の体液 まず、TRPS機器をコンピュータに接続し、Eyes on Control Suiteソフトウェアをインストールします。テキストプロトコルで説明されているように、電気的干渉を最小限に抑えるようにしてください。
次に、ナノポアサイズを選択します。NP 100は70〜200ナノメートルの小胞に最適ですが、NP 150は85〜300ナノメートルサイズの小胞に使用できます。NP 200は、100〜400ナノメートルの小胞を測定するのに適しています。
次に、NP 100およびNP 150用の相補型ポリスチレンキャリブレーション粒子を選択し、NP 200用のCPC 100キャリブレーション粒子を選択します。CPC 200キャリブレーションパーティクルを使用します。キャリブレーション粒子を30秒間ボルテックスします。
それらがまだ凝集している場合は、超音波処理を使用してから、PBS中の較正粒子を目標濃度に希釈します。ナノポアサイズに基づくと、最終容量は少なくとも40マイクロリットルでなければなりません。次に、78マイクロリットルのPBSを塗布し、すぐに取り外して、機器の下部流体セルを濡らします。
これにより、ナノポアの下に気泡が発生するリスクが軽減されます。次に、ナノポアを装置のアームに配置します。デジタルキャリパーを使用して、向かい合う2つのアーム間の距離を測定します。
この値をストレッチというフィールドの下のソフトウェアに入力し、入力したら、反対側のアーム間の距離を制御するサイドホイールを使用してストレッチのキャリブレーションをクリックします。ナノポアを47ミリメートルに伸ばします。サイズまで伸ばしたら、78マイクロリットルのPBSを下流液セルに再塗布します。
キャリブレーションプロセスを開始するには、上部流体セルをナノポアに配置し、シールドケージを取り付けます。次に、希釈したキャリブレーション粒子40マイクロリットルを上部流体セルに加えます。次に、少なくとも0.8キロパスカルの正圧を加えます。
可変圧力モジュールまたはVPMを使用して、正の電圧を選択し、[オン]をクリックします。次に、封鎖を分析しながらゆっくりとストレッチを減らします。キャリブレーション粒子によって引き起こされるイベント。
ストレッチが減少すると、封鎖高さは徐々に増加し、信号対雑音比が向上します。電圧を上げると、ブロッキングの高さも増加する可能性がありますが、RMSノイズも増加する可能性があります。観測された封鎖が信号トレースパネルから指摘されたバックグラウンドレベルを適切に超えている場合は、ストレッチの縮小を停止します。
次に、粒子速度を観察します。ただし、これにはそれほど厳密なカットオフはありません。粒子速度は、理想的には毎分少なくとも100である必要があります。
ただし、粒子速度が毎分2000を超える場合は、サンプルを希釈し、装置を再校正します。この高いレートは、このデモンストレーションの計測が不正確になる可能性があります。脳腫瘍細胞株から以前に精製された細胞外小胞が特徴付けられます。
まず、キャリブレーション粒子を上部流体セルプレスにロードします。オンにしてからVPMを使用して圧力を加え、ここに少なくとも500個のデータ粒子を記録します。0.8キロパスカルの圧力が加えられます。
オプションで、マルチ圧力測定を行い、加えられた圧力を上げて2番目の校正ファイルを記録することもできます。圧力増分は少なくとも0.2キロパスカルである必要があり、上部セルからサンプルを取り出し、洗浄ごとに100マイクロリットルのPBSでセルを3回洗浄します。洗浄後、糸くずの出ない紙で上部の液セルを拭き取ります。
次に実験サンプルを追加します。ベースライン電流は、キャリブレーション粒子を測定するときに観測された電流の3%以内である必要があります。そうでない場合は、シールドキャップを軽くたたいたりひねったり、プランジャーを取り付けたり、ナノポアを完全に取り外して水で洗い流します。
観測された電流が良好な場合は、キャリブレーション粒子に適用されるのとまったく同じ圧力を適用します。次に、少なくとも 500 個のパーティクルを記録し、データ ファイルを保存します。粒子検出が突然中断されたり、ベースライン電流が低下したり、RMSノイズが急激に増加したりした場合は、記録を一時停止してナノポアの詰まりを解消してください。
前回と同様に、サンプルを上下にピペットで動かします。シールドキャップを軽くたたいたりひねったり、プランジャーを当てたり、ナノポアを完全に取り外してDI水で洗い流します。別の戦略は、ナノポアの伸びを最大47ミリメートルまで増やし、VPMからの圧力を約5分間最大化することです。
これはまた、UNCソフトウェアでNPOを切断することができるので。[データの分析]タブに移動し、未処理のファイルオプションを右クリックしてデータの処理を開始し、[ファイルの処理]オプションを選択します。次に、サンプルとキャリブレーションファイルを結合するには、サンプルの横にあるチェックボックスをクリックします。
キャリブレーションされた列で、対応するファイルを選択し、OKです。選択肢。このソフトウェアは、サイズ、分布、ベースライン期間、全幅、半値、濃度分析など、さまざまなサンプル特性を表示します。
以下のアプローチは、調製中の標準的な方法を使用して、少なくとも50マイクロリットルの細胞培養を遠心分離する、過度の詰まりにつながる生体液などのサンプルに使用されます。細胞外小胞を含む上清を300Gで7分間、サンプルとコントロールの両方について同様に培地単独のコントロールを調製します。20マイクロリットルの上清を新しいチューブに移し、20マイクロリットルのPBSと10マイクロリットルの希釈した335ナノメートルポリスチレンビーズストックを1ミリリットルあたり1,000万ビーズで追加します。
次に、NP 200 Nanoporeを使用して前と同じように装置をセットアップし、メディア中のビーズのみのコントロールサンプルを測定します。まず、精度を上げるために、小さな非ビード粒子のバックグラウンド検出をビード検出の10%未満に最小限に抑える必要があります。次に、反復を記録する前に、各サンプルを一度測定します。
これにより、変動するナノポア条件がサンプル全体に分散されます。各サンプルは、キャリブレーションビーズのみのサンプルを再測定することにより、すべての仕上げで3回測定する必要があります。あとで。データ解析中は、スプレッドシートソフトウェアを使用して濃度計算を行います。
計算例は、記述されたプロトコルに含まれています。細胞外小胞をU 87 M-G-E-G-F-R-V 3細胞培養物から精製し、超遠心分離により上清し、次いで115ナノメートル較正ビーズを用いて記載のプロトコルを用いて測定した。細胞外小胞のサイズ分布が得られました。
細胞外小胞も、サンプルに標準試料をスパイクする代替アプローチを使用して、神経膠芽腫細胞培養上清から直接定量しました。2つのナノ粒子集団が観察されました。より小さな細胞外小胞とより大きな既知の標準、既知の標準に基づく2つの集団のサイズ推定により、小胞集団は140ナノメートルを超えることが特定されました。
より小さな細胞外小胞は、より小さなナノポア開口部を使用して検出できたかもしれませんが、習得すると、より多くの目詰まりがあったでしょう。この手法は、分析するサンプルの数にもよりますが、1〜4時間で実行できます。この手順を実行する際には、サンプルがプロトコルに中隔調整を必要とする場合があることを覚えておくことが重要です。
例えば、より大きな小胞からなるサンプルは、比較的大きなストレッチでより大きなナノポアを使用する必要がある場合があり、また、サンプルの遠心分離をフィルタリングしてナノポアをクロックする可能性のある細胞の破片を除去することで測定を容易にすることができます。このビデオを見れば、TRPSを使用して細胞外小胞を特徴付ける方法について十分に理解できるはずです。細胞外小胞サンプルに応じて、標準プロトコルを適用するか、調整されたスパイクイン法を使用することができます。
概要
このプロトコルは、調整可能な抵抗パルス検出（TRPS）を使用して細胞外小胞（EV）のサイズを定量化および特性化する方法を詳述しています。この技術により、分離やラベリングを必要とせずに生体液の分析が可能となり、従来の方法に比べて有利です。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 細胞生物学
- バイオテクノロジー
背景
- 細胞外小胞は様々な生理学的および病理学的プロセスに関与しています。
- それらはバイオマーカーや治療薬として機能する可能性があります。
- 現在のEV分析方法は分離やラベリングを必要とし、これがその特性を変化させる可能性があります。
- TRPSは複雑な生体サンプルで直接測定アプローチを提供します。
研究の目的
- 異なる生体液中のEVを定量化し、サイズプロファイルを作成すること。
- サンプル準備を最小限に抑えるプロトコルを提供すること。
- 研究におけるEV特性の正確さを向上させること。
使用される方法
- 直接測定のための調整可能な抵抗パルス検出（TRPS）の利用。
- EVからの電流遮断測定とポリスチレンビーズ標準からの比較。
- 特定のナノポアサイズとポリスチレンビーズを用いたTRPS機器の校正。
- サンプル中の粒子サイズと濃度のデータ収集と分析。
主要な結果
- 培養培地中の精製および未精製EVの成功的な特性化。
- 異なるEVサイズ範囲のための最適なナノポアサイズの特定。
- 事前の分離なしにEVを測定するこの方法の効率性の実証。
- 測定中に遭遇する一般的な問題に対するトラブルシューティングのヒントの提供。
結論
- TRPSは細胞外小胞の特性化に有用なツールです。
- この方法は生物学的文脈におけるEVの理解を深めます。
- 将来の応用には治療開発や疾病モニタリングが含まれる可能性があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Accurate quantification and size profiling of extracellular vesicles (EVs) in complex biological fluids is critical for target validation and biomarker discovery in oncology and immunology. Tunable resistive pulse sensing (tRPS) enables direct measurement without isolation or labeling, preserving native EV properties and reducing pre-analytical variability. This supports predictive confidence in early discovery by providing reproducible, quantitative data for go/no-go decisions in therapeutic development pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying EV concentration and size distribution in disease-relevant systems.
- Operational Value: Supports biological de-risking through label-free, direct measurement in complex matrices like cell culture supernatant.
- Predictive Value: Provides quantitative outputs that aid in portfolio triage by correlating EV phenotypes with pathological states.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by delivering size and concentration analytics without purification steps.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility through real-time calibration with polystyrene bead spikes in challenging samples.
- Scalability: Enables reliable compound evaluation by maintaining measurement integrity in high-throughput settings.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery to preclinical validation by enabling consistent EV characterization across sample types.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports decision-making by providing concentration and size data that inform mechanistic de-risking.
- Disease-Relevant System: Applicable to glioblastoma and other cancer models where EVs play roles in immune response and coagulation.
Pipeline & Workflow Integration
tRPS fits within the discovery continuum from hypothesis testing to lead identification, offering quantitative particle analytics that support target confidence and assay readiness.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by sizing and counting EVs in biological fluids without isolation.
- Screening: Delivers assay readiness through reproducible size distribution and concentration measurements enabled by nanopore calibration.
- Analytics: Provides particle rate, blockade height, and size distribution outputs that allow comparison across experimental conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by enabling EV profiling in disease models such as U87-MG glioblastoma supernatant.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for EV analysis across projects, reducing reliance on isolation-dependent methods.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through direct, label-free EV quantification in native conditions.
- Operational Value: Standardization and scalability via tunable nanopore stretch and pressure controls for consistent measurements.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions by reducing mechanistic ambiguity in EV-based biomarker studies.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization through quantitative size and concentration data that inform therapeutic potential.
Implementation Considerations
- Requires expertise in nanopore instrumentation and fluidic system setup to minimize electrical interference and bubble formation.
- Depends on access to qNano system with variable pressure module and appropriate nanopore sizes (NP 100, NP 150, NP 200) matched to EV size ranges.
- Necessitates cross-team standardization of calibration protocols, including polystyrene bead preparation and dilution in PBS.
- Involves adaptation considerations for sample types, such as using larger nanopores for larger vesicles or pre-filtration to reduce debris-induced clogging.
- Includes practical limitations like nanopore clogging by larger vesicles and the need for pressure and stretch adjustments based on sample complexity.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:48
Preparations
3:54
Calibrating the Settings
5:20
Measuring the Calibration and Sample Particles
7:32
Data Analysis
8:15
Alternative Approach to Measuring Non-purified Extracellular Vesicles
9:58
Results: U87-MG/EGERvIII Extracellular Vesicle Characterization
11:03
Conclusion
