Name: 調整可能な抵抗パルスセンシングを使用して定量化し、細胞外小胞の大きさ、プロファイリング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 1 s
Description: 学ぶ調整可能な抵抗パルスセンシング（TRPS）による細胞外小胞の定量化とサイズプロファイリング手法。標準法とスパイクイン法を用いて、生体液中のEVを直接測定し、神経科学・細胞生物学研究に応用する。

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1。標準オペレーティング·プロトコル 1.1装置のセットアップとサンプル調製<ol><li>インストールIZONコントロールSuiteソフトウェアを使用してコンピュータに楽器を接続します。 </li><li>使用するナノ細孔のサイズを選択します。サイズとEVの濃度測定NP150のために（ターゲットサイズの範囲85から300 nm）以下NP200（ターゲットサイズ範囲100から400 nm）で最も頻繁に使用されている。 220nmのフィルターを通して試料を通過させることによって、例えば、より大きな電気自動車の除去を伴うプロトコルを用いて単離されている電気自動車を操作する場合、NP100孔（目標サイズ範囲70から200 nm）を使用することができる。異なるプロトコルを使用して単離された生物学的試料または電気自動車における電気自動車を操作するときにはあまり頻繁に詰まるように、NP200を使用することができる。 （ - 600nmの目標サイズ範囲150）またはNP400 NP300などのような他のナノ細孔（目標サイズ範囲200から800ナノメートル）、あるいはさらに大きなナノ細孔は、EVの大きなタイプに使用することができる。 </li><li>ポリスチレンcalibrを選択してくださいステップ1.1.2で選択されたナノ細孔を補完ation粒子。 NP100、NP150とNP200ナノ細孔の場合はそれぞれ、CPC100、CP100とCPC200粒子を使用する。正確なサイズの推定には、キャリブレーション粒子は未知の粒子のような同じような大きさを持っていることを確認してください。 </li><li>キャ粒子、渦短時間（30秒）の均質性を確保するために。必要に応じて、凝集物を除去するために超音波処理を適用します。 </li><li>少なくとも40μlの容量で標的濃度にPBS中のキャリブレーションの粒子を希釈する。注：目標濃度は、ステップ1.1.2で選択されたナノ細孔によって異なります。標的濃度は、ナノ細孔が供給される。 </li><li>適用し、直接下流体セルにPBSを78μlの削除;ナノポア位置にあるときに下側流体セルに電解液を適用するときに下側流体セルのこの濡れは、ナノポアの下に気泡形成のリスクを減少させる。 </li><li>楽器の4腕上にナノ細孔を置きます。使用デジタルノギスは、2つの反対のアーム間の距離を測定し、「ストレッチ」入力フィールドにmm単位の距離を入力して、ナノ細孔のストレッチを校正するために「ストレッチを校正」をクリックします。 </li><li>低い流体セルに78μlのPBSを再適用する前に、サイドホイールを回すので、楽器の対向するアームとの間の距離を増加させることにより、47ミリメートルに、ナノポアを伸ばす。 注：電気的干渉が実質的測定の質に影響を与えることができる。 IZONコントロールSuiteソフトウェアを実行するためにラップトップを使用する場合は、ノートパソコンが接地ソケットとプラグを使用して、電力網に接続されていることを確認してください。携帯電話はまた、電気的干渉の原因になる可能性があり、機器の近くに保った。電気的な干渉は、多くの場合、ルートを持つ平方根（RMS）ノイズ&gt; 10 pAの平均、ベースライン電流の絶えず繰り返さピークとして観測される。 注：ほとんどすべてのバッファがTRPS characteriための校正粒子やEVを希釈するために使用することができzation。塩の存在は、電流の確立のための前提条件である。 EV測定ではバッファーとしてPBSを使用しています。較正粒子が常に正確な測定を保証するために、電気自動車と同様の緩衝液で希釈されるべきである。 </li></ol> 1.2。測定のための最適な設定を決定します注：記録する前に、最適な測定設定を確立することが重要である。ナノ細孔を通過する粒子によって引き起こされる封鎖大きさが適用され、ストレッチと印加電圧に依存する。信頼性の高い測定のために、RMSノイズは0.1 nAの&lt;10 Paとモードブロッケード大きさでなければなりません&gt;でなければなりません。 <ol><li>ナノ細孔に上限流体セル遮蔽ケージを置き、上部流体セル内に希釈された校正用粒子40μlのをご紹介します。 ≥0.8キロパスカル陽圧を適用するためにVPMを使用してください。 </li><li>キャリブレーションによって引き起こされる封鎖イベントを分析しながら、ゆっくりと44ミリメートルに向かって適用されるストレッチを削減粒子。注：細孔径を小さくするとナノポアを通る粒子の移動性が低くなり、したがって、粒子速度が低下する。しかし、細孔の相対的な増加遮断に大きな封鎖イベントが改善された信号対雑音比が得発生する。電圧を増加させると、さらに封鎖大きさを増加させることができるだけでなく、RMSノイズを増加させることができる。 </li><li>適切な封鎖イベント（ 図1c）は 「信号トレース」パネルで観察されるまで、ストレッチを減らします。 （モード&gt; 0.1 nAの）と対応する粒子の速度は&gt; 100 /分である。注：粒子速度がそれほど厳しくカットオフで、少なくとも500個の粒子の測定が理想的であるように、しかし、&lt;100 /分の粒子速度は、少なくとも5分の持続時間を記録する原因となる。 （現在、サンプル希釈が行われるべき場合）2,000 /分よりも高い粒子速度はより正確な測定をもたらすことができる。 </li></ol>キャリブレーションの1.3測定粒子、のスーパー流体セルの洗浄とサンプル測定<ol><li>多形神経膠芽腫細胞株U87-MG / EGFRvIIIの細胞培養上清からのこのセクションのEVを特徴とする。これらの電気自動車の単離および調製は、先に説明し18を可視化されている。 </li><li>上部流体セル内の校正粒子を配置します。 VPMとレコード&gt; 500粒子を用いた（例えば、0.8キロパスカルのための）圧力を適用します。 </li><li>マルチ圧力測定を行う場合には、（1.0キロパスカルまでなど）に加えられる圧力を増加させ、第2の較正ファイルを記録する。注：0.2キロパスカル差の最小値が必要になります。 </li><li>上部流体セルからのキャリブレーションサンプルを削除します。残留粒子を除去し、100μlのPBSで上部流体細胞を3回洗浄する。上部流体細胞内への試料の導入の前に、上部流体セルから残留PBSを除去するために、糸くずの出ないティッシュを使用しています。 </li><li>上部流体セルにサンプルを紹介。ベースライン電流が較正粒子を測定する場合に観察されたベースライン電流の3％以内であることを確認します。そうでない場合には3％以内、ベースライン電流を安定化するために、以下に説明戦略を適用します。キャ粒子に適用されるような正確な圧力を適用し、サンプルファイルを記録します。 注：パーティクル率プロットは、一定の粒子検出（ 図2a）を表示する必要があります。粒子検出の突然の中断、ベースライン電流の急激な低下、またはRMSノイズの急激な増加の場合には、細孔が目詰まりすることができる。このようにして、録音を一時停止。ベースライン、タップを復元するか、シールドキャップをひねり、プランジャーを適用するか、完全にナノ細孔を除去し、脱イオン水で洗浄し、楽器でそれを交換するために。 注：または、約5分間VPMから最大圧力との組み合わせで47ミリメートルにナノ細孔のストレッチを増加させる。 </li></ol> 1.4データ解析<ol><li>をクリックして「;ソフトウェアの分析セクションに入るために、データ &quot;タブを分析します。 「未処理のファイル」と選択する「プロセスファイル」を右クリックすることでキャリブレーションし、サンプルファイルを処理します。 </li><li>キャリブレーションの録音に結合するために「校正済み」欄にサンプルの横にあるサンプルファイルをチェックボックスをクリックします。対応するサンプルと較正ファイルを選択し、「OK」をクリックします。注：マルチ圧力校正オプションは、複数のキャリブレーション·ファイルに結合する複数のサンプルを左の「マルチ圧力キャリブレーション」タブを選択し使用した場合。 </li><li>一度成功した結合された、IZONコントロールSuiteソフトウェアは、このようなサイズ分布（ 図2b）、ベースラインの持続時間、半値幅（FWHM）と濃度分析などの異なるサンプルの特性を表示します。オプション：各サンプルについて、個別のデータポイントは、カンマ区切りのファイルとしてエクスポートすることができます。 </li></ol> 2 Alternativeプロトコル - キャリブレーションビーズでサンプルをスパイク注：単離された電気自動車を操作する場合、一般に、標準的な操作手順を使用することができる。生物学的サンプル、または大規模なタンパク質凝集物で汚染された孤立したEVの製剤中の非絶縁電気自動車を操作する場合、機器を操作することは困難な場合があります。これらの課題は、主にナノ細孔ブロッキング（ベースライン電流の急激な低下）、キャリブレーション測定または同一のサンプル（ 図3a）の間の粒子率の有意差の3％以内にベースライン電流を回復することができない率の高さで構成されています。電気自動車を定量化するための代替プロトコルこれらの問題を表示するサンプルについては17を開発した。この方法は、目的のサンプル（ 図3b）に大きなポリスチレンキャリブレーションビーズの導入に依存している。この代替プロトコルの詳細な手順については後述する。 2.1。サンプル準備注意：代替方法を使用してサンプルを調製する、それはまた、周囲の1のEV対ビーズ比を確立することが望まれる場合には、サンプル」のみのキャリブレーションビーズ」を含めることが不可欠である、正確な「ゲーティング」を可能にするために緩衝液中に存在する（例えば、タンパク質凝集のため）バックグラウンド粒子の数を決定するためのキャリブレーションビーズ。 <ol><li> 300×gで7分間、細胞培養上清の遠心100μlの</li><li> 20μlのPBSに20μlの上清を加え、75回の10μlの335 nmのポリスチレンビーズ（在庫7e10 / ml）で希釈。 </li></ol> 2.2。サンプルの測定<ol><li>最適な計測器の設定を決定するために、1.2節で説明した戦略を使用してください。 </li><li>最初のサンプル &#39;のみのキャリブレーションビーズ」を測定します。小さな非ビーズ粒子のバックグラウンドの検出が可能な限り低くなっていることを確認し（ビーズの&lt;10％）。 </li><li>各個別のSAを測定しますmple一度均等に異なるサンプルにわたってナノポア条件の変動を分配するために、反復を記録する前に。各サンプルの少なくとも3回の反復を測定する。 </li><li>全てのサンプルの記録が終了した後に「キャリブレーションビーズのみを &#39;サンプルを再測定。 </li></ol> 2.3。データ分析注：代替プロトコルを使用する場合は、IZONコントロールSuiteソフトウェアを排他的に使用が濃度計算のために十分ではない。付加的な表計算ソフトが必要となる。 表1は、図3に示すサンプルの濃度計算の例を示している。 <ol><li> 「キャリブレーションビーズのみ」のサンプルと1つ以上のサンプルファイルを開きます。 </li><li> （nAの中で）イベントサイズがEVやポリスチレンビーズとを区別するためのカットオフとして使用することができる封鎖決定する。ポリスチレンビーズ集団の左ベースに対応する封鎖値（NA）を決定する（ <st栄&gt; 図3b）。注：すべての測定値のビンのサイズの等しい設定を確認します（「個人ブロッケード·トレース」下の「ポップアップ」ボタンをクリックしてアクセスされる「ViewSettings」で調整することができます）。 </li><li>試料の「粒子解析の概要」タブをクリックすることで各サンプルの総粒子数の値を取得します。 </li><li>ステップ2.3.2で決定したカットオフレベルを使用してデータセットをフィルタ処理する。 「データのフィルタリング」ポップアップを選択することによって。表示のみのカットオフよりも小さい粒子。 </li><li> 「粒子解析の概要」から各サンプルについて、EV·カウントの値を取得します。 </li><li>キャリブレーションビーズの量を決定するために、総粒子からEVの量を引きます。 </li><li>キャリブレーションビーズカウントでEV数を割ることによって、EV対ビーズ比を決定します。 </li><li>各＆について決定比率を平均して平均バックグラウンド比を決定する＃8220;唯一の &quot;キャリブレーションサンプルをビーズ。各個別のサンプルからこの値を引きます。 </li><li>各サンプルの電気自動車の濃度を決定するためのキャリブレーションビーズの濃度によって調整されたEV対ビーズ比を乗算する。 </li><li> EVサンプルにキャリブレーションビーズを添加することによって導入されたEV希釈係数によってステップ2.3.9に見られる濃度を掛ける。注：例サンプルセットアップでは、PBSおよびキャリブレーションビーズ中の試料の全希釈は2.5倍であり、従って、ステップ2.3.9に見られる濃度は、生のEVの試料濃度を決定するために2.5を乗じれるべきである。 </li><li>そのような平均、標準偏差およびレプリケートの各グループの平均値の標準誤差などの統計を計算します。 注：いくつかのケースではEVやスパイクポリスチレンビーズ間で重複が観察される。 EV濃度の過小評価のための補正が必要な場合、スパイクされたポリスチレンビーズなしの試料は、測定されるべきである。同じカットを使用してくださいスパイクされたポリスチレンビーズの範囲内EVの比を計算するために、「ビーズ対EV」比を決定するステップ2.3.2で決定されるようにオフ。このビーズ対EV比率はステップ2.3.8で決定し、EV対ビーズ比に追加する必要があります。 </li></ol> 2.4。オプション：別の方法を使用して、EV径分布。 <ol><li>コントロールSuiteソフトウェアで二度記録したサンプルを開きます。 </li><li>上記決定されるカットオフよりも大きいだけ表示粒子への試料の一つのフィルタオプションを設定します。これは、キャリブレーション粒子が表示されます。 </li><li> 「キャリブレーションファイル」を濾過した試料を設定し、キャリブレーションビーズのモードサイズを入力してください。 </li><li>カップルサンプルファイルおよび1.4.2で説明したようにステップ2.4​​.3で作成した「キャリブレーションファイル」。サンプルファイルは現在、スパイクされたキャリブレーションビーズに基づいてEVやキャリブレーションビーズの両方のサイズ分布が表示されます。 注：標準のオペラティンプロトコルは、ほとんどの場合、EVのサイズ分布を決定するために十分であろう。時には、しかし、正確な緩衝液成分は不可能興味のある電気自動車と同じ緩衝液中にキャリブレーションビーズのサンプルを調製することを可能にするどの（血漿または尿中など）未知である。較正粒子でスパイクEVサンプルは、これらの特定の条件でEVサイズ推定のために使用することができる。 </li></ol>

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概説したプロトコルと、この原稿の執筆の開発は、財政的にオランダの脳財団、シューマッハクレイマー財団、Bohnenn基金によって、部分的にサポートされています。このビデオ記事の生産は、部分的にIZONによってsponsortedた。

定量化とのTRPを使用して、電気自動車の大きさの特徴付けのためにこの原稿募集の方法論に記載されているプロトコルを。のTRPプラットフォームの主な利点は、小さなサンプルサイズ、比較的短い測定時間と必要なサンプル操作の欠如である。 正確なのTRP測定のための前提条件は、校正とサンプルの測定値の間で同一の条件を維持することです。これは、同一のバッファの使用方法ならびにそのようなナノ細孔の大きさ、電圧、印加された圧力と同一の機器の設定を包含する。オリジナルのVPMは、それによって、サンプル間の印加圧力のわずかな違いを引き起こし、加えられた圧力の正確な設定のためのメカニズムを欠いている。異なる時点で測定したときにも、VPMにおけるプライミング液の蒸発はわずかな圧力差を誘発することができ、VPMは、したがって、多くの場合、再プライミングされるべきである。これらの制限は、潜在的にVPM2の導入によって解決されているクリックベースのスケーリングを有し、空気圧基づいている。 この原稿に記載されて代替プロトコルは、非精製された生物学的サンプル中17 EVの測定に特に適している。私たちは、例えば、糖、脂質、タンパク質および他の大きな破片などの緩衝成分は、いくつかの場合に適用可能にする標準プロトコルのためのあまり測定条件に影響を与えることができると考えている。 2個別の測定値を比較するサンプルにキャリブレーションビーズを添加するというよりは、「リアルタイム·キャリブレーション」を紹介します。異なるおよび/ ​​または未知の流体背景含量を有するサンプル（異なるドナーの、例えば血漿）を比較する場合は、この方法が特に適している。違いはEVやポリスチレン粒子（ 例えば、粒子密度及び表面電荷）との間に存在するが、理論モデルならびに実験データは、EVの定量化およびサイズプロファイリングのためのポリスチレンビーズの有用性を強調するかなりの圧力が15,19適用されていることを前提条件の下で。動電力の影響を最小限に抑えるために、比較的大きなNP150 / NP200のナノ細孔と有意な正の圧力の使用が推奨されます。 EVやキャリブレーションビーズは大きさによって区別される。したがって、ナノポアは、EVや大きな校正粒子の両方の検出が観察される直径に、ストレッチを適用することによって開かれなければならない。気孔の開口部が、より小さい粒子に対する感受性が減少するので（335 nmのキャリブレーションビーズを使用する場合&gt;しばしば電気自動車120 nm）を、特定のサイズよりも大きいのみ電気自動車が記録される。電気自動車の最小検出限界は、NP150のナノ細孔に203 nmのキャリブレーションビーズを用いて、90nm程度まで小さくすることができる。より大きな電気自動車のナノ細孔を頻繁に目詰まりを誘発しかし、このセットアップは実行不可能かもしれません。これらの妨害EVの存在はどこにレアには小さすぎるEVの人口、セットアップの利用を強制することが検出閾値をCHであり、検出されません。 サイズが100nm未満の粒子を測定しようとすると、システムを操作する困難さは増大する。このような場合において、検出は、電解質の塩濃度を増加させることによって改善することができる。増大したイオン濃度は、小さな粒子（より大きな信号対雑音比）が相対的に増加封鎖大きさを誘導する。 EVの測定のためのこの技術の実行可能性が増加塩濃度は、EVの容積に影響を与える可能性がある、しかし、検証されなければならない。 結論として、TRPをプラットフォームは、EVの直接定量およびサイズ​​特徴付けのために使用することができる。全く隔離またはEV操作（抗体結合または蛍光標識）が必要ないので、プラットフォームは生物学的液体中の直接のEV定量化に適しています。代替プロトコルは、緩衝液成分が有意な細孔clogginを誘導サンプルのために有益であり得るが提供される実行不可能な標準プロトコルの信頼性の高い使用率を作るグラムイベント。

細胞起源からの小胞は、体液1において非常に豊富である。これらのいわゆる細胞外小胞（電気自動車）（50 - サイズ1,000 nm）を細胞膜と多小胞状体のいずれかの融合によって、または細胞膜の外側に直接出芽により形成されている。近年では、電気自動車での科学的関心が大幅にEVの新たな機能や特性を1に記載されているEVに焦点を当てた出版物の過多で、その結果、増加している。電気自動車は、現在、シグナル伝達、免疫調節、および血液凝固1-4のような生理学的および病理学的プロセスの広い配列に関与すると考えられている。癌では、電気自動車はpremetastaticニッチ5,6、血管新生8のプロ癌コンテンツ7,8の移転や刺激の形成に役割を果たしているようだ。このほか、電気自動車は、治療剤9の送達剤として検討されている。 これらのデにもかかわらずvelopments、EVの信頼性の高い定量が困難なままである。伝統的に、間接的な定量法は、全タンパク質含有量または特定のタンパク質の定量化に依存している、使用されている。広く用いられているが、これらの技術は、タンパク質あたりのEVの違いを考慮していないし、電気自動車におけるタンパク質凝集体および混入タンパク質を区別しません。さらに、これらの技術は、多くの場合、生物学的サンプル中のEV濃度の比較を不可能にする電気自動車の単離を必要とする。 したがって、努力がより正確で直接的なEV測定10を可能にする新規な方法を開発するために行われている。このレポートは、信頼性の高い定量化やEVのサイズのプロファイリングのための調整可能な抵抗パルス検出（TRPS）の使用が記載されている。 現在、qNano装置（ 図1a）は、TRPSのための唯一の商業的に入手可能なプラットフォームです。 TRPSでは、非導電性弾性膜は、Wiを中断ナノサイズの細孔番目の二つの流体細胞を分離している。他の細胞は、粒子を含まない電解質で満たされ、一方、流体セルの一つは、目的の試料が充填されている。電圧を印加して、イオン流/電流が細孔（ 図1b）を介して粒子の移動時に変更される、確立される。この電流の遮断（「抵抗パルス&#39;）の大きさは、粒子11（ 図1c）の体積に比例する。封鎖持続時間は、電荷または12形状の粒子の特性に依存して、粒子のゼータ電位を評価するために用いることができる。未知の粒子の大きさプロファイリングは、既知の直径を有する較正粒子による抵抗パルスで未知の粒子による抵抗パルスを比較することによって行うことができる。封鎖事象の大きさに加えて、これらが生じるの速度が測定される。この計数率reli粒子濃度でのES。封鎖の濃度および割合は、13直線的に比例しているので、既知の濃度および粒子サイズの粒子を有する単一の較正サンプルを用いて、濃度14および未知試料のサイズ分布11の測定を可能にする。 ナノポアを通る粒子の移動は、電気キネティック（電気泳動および電気浸透）と流体力15によって決定される。可変圧力モジュール（VPM）流体セル間の圧力差を使用して、追加の力として誘導することができる。正の圧力を適用すると、粒子濃度が低い場合に有益であり得る粒子の流量を増加させる。また、圧力は、動電学的な力の影響を低減するために適用することができる。としてしばしば電気自動車を検出するために使用される相対小さな孔径（NP100、NP150およびNP200おそらく）でナノ細孔を使用する場合に特に重要である。これらのナノ細孔のために、かなりの圧力を加える場合であっても、動電学的力は、粒子の表面電荷に依存して、16無視できないままであり得る。複数の圧力での粒子速度を測定することにより、電気を動力学的に補正し、より正確な、EV濃度を算出することができる。 ここでは、詳細なプロトコルはEVのサイズ分布および濃度を決定するために提供される。サンプルは既知のサイズ及び濃度17のポリスチレンビーズでスパイクされた場合、通常動作プロトコルの隣には、別のアプローチが記載されている。このリアルタイムの較正技術は、尿、血漿および細胞培養上清のような生物学的流体、直接電気自動車を測定するときに遭遇する技術的課題のいくつかを克服するために使用することができ、または測定長期間にわたってナノポアの安定性であることができない場合確実にした。

<table><tbody><tr><td><a href="http://www.izon.com/trps-with-qnano/">qNano instrument</a></td><td>Izon Science Ltd.</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td><a href="http://www.izon.com/products/components-and-consumables/vpm/">可変圧力モジュール</a></td><td>Izon Science Ltd.</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td><a href="http://www.izon.com/products/components-and-consumables/nanopores/">Nanopore</a></td><td>Izon Science Ltd.</td><td>NP100、NP200</td><td>ナノポアの選択肢は、ターゲット粒子によって異なります。さまざまなターゲットサイズに対して、さまざまなナノポアが利用可能です。</td></tr><tr><td>キャリブレーション粒子</td><td>Izon Science Ltd.</td><td>CPC100、CPC200、CPC400</td><td>キャリブレーション粒子は、さまざまなサイズで利用できます。</td></tr><tr><td>超音波処理槽</td><td>複数利用可能</td><td></td><td>基本的な超音波処理槽で十分です</td></tr><tr><td>(ミニ) ボルテクサー</td><td>複数の利用可能な</td><td></td><td></td></tr><tr><td>リフトフリーティッシュ</td><td>複数の利用可能な</td><td></td><td></td></tr><tr><td>リン酸塩緩衝生理食塩水(PBS)</td><td>複数の利用可能な</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Windowsベースのコンピュータ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Izon Control Suite 2.2</td><td>アイゾンサイエンス(株)</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>スプレッドシートソフト</td><td>複数可</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

調整可能な抵抗パルスセンシングを使用して定量化し、細胞外小胞の大きさ、プロファイリング

Quantification and Size-profiling of Extracellular Vesicles Using Tunable Resistive Pulse Sensing

「微小胞」と「エキソソーム」を含む細胞外小胞（電気自動車）は、体液中の非常に豊富である。近年、電気自動車への関心が驚異的な増加を目撃した。電気自動車は、凝固、免疫応答、および癌を含む、さまざまな生理学的および病理学的プロセスにおいて重要な役割を果たすことが示されている。また、電気自動車は、治療薬として、例えば、薬物送達ビヒクルとして、又は再生医療などの可能性を有する。サイズが小さいため（50〜1,000 nm）でのEVの正確な定量とサイズプロファイリングが技術的に困難である。 このプロトコルがどのように調整可能な抵抗パルス検出（のTRP）技術について説明し、qNanoシステムを使用して、電気自動車の濃度とサイズを決定するために用いることができる。ナノサイズの細孔を通じて転送するとEVの検出に依存する方法では、比較的高速であり、少量の試料を使用することで十分とPURを必要としませんificationやEVの濃度。次の別のアプローチは、サンプルを使用して記述されている通常動作プロトコルに既知のサイズおよび濃度のポリスチレンビーズでスパイクした。このリアルタイムの較正技術は、生物学的液体中の直接電気自動車を測定するときに遭遇する技術的ハードルを克服するために使用することができる。

のTRP器具を使用するには、非導電性ナノ細孔は、マシン（ 図1a）の4腕の上に配置する必要があり、電圧（ 図1b）が適用されなければならない。電気ベースライン電流が確立されると、図1cに示されるように、細孔を通過する粒子に起因する抵抗のパルスが検出される。 電気自動車は、超遠心分離による神経膠芽腫細胞株U87-MG / EGFRvIIIの細胞培養上清から精製した。 NP100のナノ細孔に孤立した電気自動車（ 図2a）を測定する際に安定な粒子速度プロットが観察される。この安定した粒子速度プロットは、信頼性のEV濃度測定のために必要とされる。 115nmのポリスチレンキャリブレーションビーズの記録への録音EV-サンプルのペアリングした後、粒度分布（ 図2b）とEV-サンプルの濃度の推定値を得ることができる（データは示さず）。 （Figrue 3aの ）変動をもたらす。これは、不正確なEV濃度の推定をもたらす。既知の濃度およびサイズのポリスチレンビーズでサンプルをスパイクすることによって、EV対ビーズ比を決定することができる。 図3bは、サイズが 335ナノメートルのポリスチレンビーズを細胞培養上清をスパイクした後に得られた結果を示している。二つの明確な集団が観察される。少ないし、0.46 nAの体の遮断を誘発する粒子はより大きな粒子は、ポリスチレンビーズを決定し、決定した電気自動車である。ポリスチレンビーズに対するEVの比は、電気自動車（ 表1）の原料濃度を計算するために使用される。 図3cは、スパイクされたポリスチレンビーズに基づく2つの集団のサイズ推定を示す図である。再使用されるナノ細孔のセットアップサイズの電気自動車&gt; 140nmの検出においてsulted。これは、ナノポア開口部を減少させることによって低下させることができるが、これはまた、より詰まり事象をもたらすであろう。 <img alt="図1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51623/51623fig1highres.jpg" width="600" /> 図1：qNano機器と動作モード。 （A）装置の写真。ナノポアは、上部流体セルから低い流体セルを分離する、器具上に位置決めされる。流体セルは、遮蔽キャップによる環境の電気的干渉から保護されています。（B）イラストチューナブル抵抗パルス検出（TRPS）を概説する。非導電性弾性ナノ細孔は、2つの流体細胞を分離します。電圧を印加して電流がナノポアにパンクチャ細孔を介して確立される。細胞外小胞がナノポアを移動すると、イオンの流れが変更され、抵抗性のパルスとして検出される。のTRPにナノポアの開口寸法は、器具の対向するアームの間の距離を増大するか、この距離を減少させることにより、ナノポアを延伸することにより（減少または増加）を調整することができる。（C）、抵抗パルスの具体例。単一の抵抗パルスの大きさは、粒子の体積に比例する：より大きなパルスが大きな粒子を示している。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51623/51623fig1highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51623/51623fig2highres.jpg" width="600" /> 図2：粒子カウントプロットとU87-MG / EGFRvIIIの細胞培養上清から分離された電気自動車の測定から得られたサイズ分布全体の一定の粒子検出を示す（A）粒子カウントプロット。粒子フィルタの簡単な減少ルの検出は、記録の80と100秒の間で観察された。録音を一時停止し、シールドキャップをタッピングした後、粒子速度は、記録が再開された。（B）単離されたEVのサイズ分布は、115 nmのポリスチレン較正ビーズに未知試料（電気自動車）を校正した後にプロットした後に安定化した。 （5nmのビンサイズ）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51623/51623fig2highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51623/51623fig3highres.jpg" width="600" /> 図3：代替プロトコルを用いて細胞培養上清中のEVのTRPを定量化。 （A）生物学的流体中に直接電気自動車を測定したときに得られる典型的な粒子速度のプロット。細孔の目詰まりは、粒子検出率の短い中断や変動の原因となる。それぞれプロットは、同じサンプルの複製の測定値を表す。（B）335 nmのポリスチレン較正ビーズを細胞培養上清をスパイクした後に得られる3つの複製のサイズ分布のグラフ。 0.46未満の抵抗nAのパルスを誘導する全ての粒子が電気自動車として選択される。（C）スパイクされたポリスチレンビーズは、サンプルのサイズ分布を得るために用いることができる。 （5nmのビンサイズ）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51623/51623fig3highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> 測定 </td><td> キャリブレーションのみで第1位 </td><td> キャリブレーションのみ＃2 </td><td> 上清＃1 </td><td> 上清＃2 </td><td> 上清＃3 </td></tr><tr><td>平均電流（NA） </td><td> 117 </td><td> 120 </td> &lt;TD&gt; 116 </td><td> 118 </td><td> 120 </td></tr><tr><td>粒子速度</td><td> 172 </td><td> 194 </td><td> 250 </td><td> 246 </td><td> 196 </td></tr><tr><td>カットオフ使用（NA） </td><td> 0.46 </td><td> 0.46 </td><td> 0.46 </td><td> 0.46 </td><td> 0.46 </td></tr><tr><td>総粒子</td><td> 303 </td><td> 317 </td><td> 489 </td><td> 488 </td><td> 454 </td></tr><tr><td>細胞外小胞</td><td> 3 </td><td> 1 </td><td> 213 </td><td> 215 </td><td> 213 </td></tr><tr><td>スパイクのキャリブレーションビーズ</td><td> 300 </td><td> 316 </td><td> 276 </td><td> 273 </td><td> 241 </td></tr><tr><td>電気自動車/キャリブレーションビーズ</td><td> 0.01 </td><td> 0.003 </td><td> 0.772 </td><td> 0.788 </td><td> 0.884 </td></tr><tr><td>サンプル - バックグラウンド</td><td></td><td></td><td> 0.765 </td><td> 0.781 </td><td> 0.877 </td></tr><tr><td> Extracelullar小胞（10 7）/ mlの</td><td></td><td></td><td> 7.14 </td><td> 7.29 </td><td> 8.18 </td></tr><tr><td>サンプル2.5倍に希釈</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>生の濃度電気自動車（10 7）/ mlの</td><td></td><td></td><td> 17.85 </td><td> 18.22 </td><td> 20.46 </td></tr></tbody></table> 表1：代替プロトコルを用いてEV濃度の計算例カットオフ値は、キャリブレーションビーズから電気自動車を区別することが決定される。続いて、EVやビーズの総数は、検索することができる。測定毎にEV対ビーズ比を算出する。 （例えば、タンパク質凝集のため）、電解質中のバックグラウンド粒子の量は、「キャリブレーションビーズのみ」試料の個別の測定のためのEV対ビーズ比を平均することによって計算される。各サンプルについてバックグラウンド比が得られる比から減算される。このadjuste（：9.33e7 / mlのこの例では）d比は、サンプル中のキャリブレーションビーズの濃度が乗算される。 EVの生の濃度を決定するために、得られた濃度は、（：2.5この例では）総電気自動車の希釈率を掛けている。

細胞外小胞は、凝固、免疫応答、および癌または薬物送達又は再生医療のような潜在的な治療剤を含む生理学的および病理学的プロセスにおいて重要な役割を果たしている。このプロトコルは、調整可能な抵抗パルスセンシングを用いた各種流体中の絶縁および非単離された細胞外小胞の定量化とサイズ特性評価のための方法を提示します。

Extracellular vesicles (EVs), including &#8216;microvesicles&#8217; and &#8216;exosomes&#8217;, are highly abundant in bodily fluids. Recent years have ...

本実験の全体的な目的は、調整可能な抵抗パルスセンシングを用いて、細胞外小胞の定量およびサイズプロファイリングを行うことです。標準的な手法は、精製された細胞外小胞から得られた電流遮断測定値と、ポリスチレンビーズ標準試料から得られた測定値を比較することです。細胞外小胞を特性評価するもう一つの手法として、サンプルにポリスチレンビーズをスパイクする方法があり、これは未精製の細胞外小胞のような複雑なサンプルを扱う際に用いられます。細胞培養培地において、得られたデータは、精製済みか未精製かに関わらず、細胞外小胞のサイズと数を特徴付けます。ウェスタンブロッティングやラテックスビーズに結合させた細胞外小胞のフローサイトメトリーなどの既存の手法に対する本手法の主な利点は、物理的な分離や標識を必要とせず、生物学的流体中の粒子を直接的に特徴付けられる点にあります。一般的に、この手法に慣れていない人は、細胞外小胞のサイズが不均一であるため、解析に苦慮することがあります。より小さな小胞を検出しようとする際、大きな小胞がナノポアを閉塞させることがあります。迅速に動作可能な状態に戻すための実用的なヒントとコツをプロトコルに追加しました。我々は細胞外小胞の産生を抑制することを試み、細胞培養液中の小胞濃度を定量する方法を必要としました。Snet。ナノ粒子の特性評価手法を探索した結果、我々はTRPSに着目し、SLE（全身性エリテマトーデス）の細胞培養上清およびその他の生物学的流体の特性評価により適するようにプロトコルを修正しました。まず、nProbeコントロールスイートソフトウェアがインストールされたコンピュータにTRPS装置を接続します。テキストプロトコルで述べている通り、電気的干渉を最小限に抑えるようにしてください。次に、ナノポアのサイズを選択します。70から200 nmの小胞にはNP 100が最適であり、85から300 nmのサイズの小胞にはNP 150を使用できます。100から400 nmの小胞を測定する場合は、NP 200がより適しています。次に、NP 100およびNP 150には対応するポリスチレン校正粒子を選択し、NP 200にはCPC 100校正粒子を選択します。CPC 200校正粒子を使用してください。校正粒子を30秒間ボルテックスします。依然として凝集している場合は、超音波処理を行い、その後、校正用粒子をPBSで目的の濃度まで希釈します。ナノポアのサイズに基づき、最終容量は少なくとも40 microlitersである必要があります。次に、78 microlitersのPBSを注入して直ちに除去することで、装置の下部流路セルを湿らせます。これにより、ナノポアの下に気泡が生じるリスクを低減できます。次に、ナノポアを装置の4本のアームに配置します。デジタル calipers を使用して、向かい合う2つのアーム間の距離を測定してください。この値をソフトウェアのstretchというフィールドに入力し、入力後、対向アーム間の距離を制御するサイドホイールを使用してcalibrate stretchをクリックします。ナノポアを47 millimetersまで伸長させます。規定のサイズまで伸長させた後、下部の流体セルに78 µLのPBSを再度添加します。ナノポア上に上部流体セルを配置し、遮蔽ケージを取り付けて校正プロセスを開始します。次に、希釈した校正用粒子 40 µL を上部流体セルに注入します。その後、少なくとも 0.8 kPa の正圧を印加します。可変圧力モジュール（VPM）を使用して、正の電圧を選択し、「Turn on」をクリックします。次に、ブロッキングを分析しながら、ゆっくりとストレッチを減少させます。キャリブレーション粒子によって生じるイベントを確認します。ストレッチを減少させると、ブロッケードの高さが徐々に増加し、その結果、信号対雑音比（S/N比）が向上します。電圧を上げることでブロッケードの高さを高めることも可能ですが、RMSノイズが増加する場合もあります。信号トレースパネルで確認し、観察されるブロッケードがバックグラウンドレベルを適切に上回った時点で、ストレッチの減少を停止してください。次に、パーティクルレートを確認します。ただし、これについてはカットオフ値がそれほど厳格ではありません。パーティクルレートは、理想的には1分あたり少なくとも100個である必要があります。ただし、粒子数が毎分2000個を超える場合は、サンプルを希釈し、装置を再校正してください。これほど高い粒子数では、本デモンストレーションにおいて不正確な測定結果となる可能性があります。ここでは、あらかじめ精製された脳腫瘍細胞株由来の細胞外小胞の特性評価を行います。まず、校正用粒子を上部流体セルプレスにロードします。電源を入れ、VPMを用いて圧力を加え、ここで少なくとも500個の粒子のデータを記録します。圧力は0.8 kilopascalを印加します。オプションとして、これを実現するために多点圧力測定を行うこともできます。印加圧力を上げ、2つ目のキャリブレーションファイルを記録してください。圧力の増分は少なくとも0.2 kilopascalsである必要があります。ここで、上部セルからサンプルを取り出し、1回あたり100 microlitersのPBSを用いてセルを3回洗浄します。洗浄後、糸くずの出ないペーパーで上部流体セルを拭き取ってください。次に実験サンプルを添加します。ベースライン電流が、キャリブレーション粒子測定時に観察された電流の3%以内である必要があります。そうでない場合は、遮蔽キャップを軽く叩くか回すか、プランジャーを操作するか、あるいはナノポアを完全に除去してDI waterで洗浄してください。観測される電流が良好な場合は、校正粒子に適用したのと全く同じ圧力を適用します。その後、少なくとも500個の粒子を記録し、データファイルを保存してください。粒子の検出が突然中断されたり、ベースライン電流の低下やRMSノイズの急増が見られた場合は、記録を一時停止し、ナノポアの詰まりを解消してください。前述と同様に、サンプルをピペッティングします。遮蔽キャップを軽く叩くか回し、プランジャーを押し込むか、あるいはナノポアを完全に除去してDI waterで洗浄します。別の戦略としては、ナノポアの伸長を最大47 millimetersまで伸ばし、VPMからの圧力を約5分間最大に高める方法があります。これにより、ソフトウェア内でNPOを解除することも可能です。「データ解析」タブに移動し、「未処理ファイル」オプションを右クリックして「ファイルの処理」オプションを選択し、データの処理を開始します。次に、サンプルファイルと校正ファイルを結合させるため、サンプルの隣にあるチェックボックスをクリックします。キャリブレーション済みカラムで、対応するファイルを選択してOKをクリックします。ソフトウェアに、サイズ、分布、ベースライン期間、半値幅、濃度分析などの異なるサンプル特性が表示されます。標準的な方法による調製で目詰まりが激しくなる生物学的流体などの試料には、次のアプローチを用います。細胞培養上清（細胞外小胞を含む）を少なくとも50 µL取り、300 Gで7分間遠心分離します。試料とコントロールの両方について、同様の方法で培地のみのコントロールも調製します。上清を20 µL新しいチューブに移し、20 µLのPBSおよび10 million beads/mLに希釈した335 nmポリスチレンビーズストック液を10 µL加えます。前述と同様に装置をセットアップし、NP 200 Nanoporeを使用して、培地中のビーズのみを含むコントロールサンプルを測定します。まず、正確性を期すため、非ビーズ微小粒子の背景検出がビーズ検出数の10%未満になるまで最小限に抑える必要があります。その後、繰り返し測定を記録する前に、各サンプルを一度ずつ測定します。これにより、変動するナノポアの状態を各サンプルに分散させることができます。最終的に、キャリブレーションビーズのみのサンプルを再測定することで、各サンプルを合計3回ずつ測定してください。その後、データ解析時に表計算ソフトを使用して濃度計算を行います。計算例は記述プロトコルに含まれています。U 87 M-G-E-G-F-R-V 3細胞培養上清から超遠心分離により細胞外小胞を精製し、115 nanometerのキャリブレーションビーズを用いて、記載されたプロトコルに従って測定しました。これにより、細胞外小胞のサイズ分布が得られました。また、サンプルに標準物質を添加する代替アプローチを用い、膠芽腫細胞培養上清から細胞外小胞を直接定量しました。その結果、2つのナノ粒子集団が観察されました。より小さい細胞外小胞と、より大きい既知の標準物質であり、既知の標準物質に基づいたこれら2つの集団のサイズ推定により、小胞集団は140 nanometers超であることが特定されました。より小さなナノポア開口部を使用することで、より小型の細胞外小胞を検出できた可能性がありますが、その場合は目詰まりが多く発生したと考えられます。習熟すれば、この手法は分析するサンプル数に応じて1時間から4時間で完了できます。本手順を実施する際は、サンプルによってプロトコルのセプタム調整が必要になる場合があることに留意することが重要です。例えば、より大きな小胞を含むサンプルの場合は、相対的に大きなストレッチ状態で、より大きなナノポアを使用する必要があるかもしれません。また、ナノポアを詰まらせる原因となる細胞残渣を除去するために、サンプルのろ過や遠心分離を行うことで測定がスムーズになります。このビデオを視聴することで、TRPSを用いた細胞外小胞の特性評価方法について十分に理解できたはずです。細胞外小胞サンプルの性質に応じて、標準プロトコルを適用するか、調整済みのスパイクイン法を使用してください。

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

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ここでは、ラベルフリー表面強化ラマン分光法(SERS)を用いて個々の小さな細胞外小胞(sEV)を解析するプロトコルを提示し、低侵襲疾患の診断と治療的投与手段としてのsEVの評価を可能にします。...

個々のsEVの表面強化ラマン散乱に基づくバイオセンシングの疾患診断および治療への応用を探る

ラマン分光法は、生きた細胞、組織工学の構造とネイティブの組織の非接触、ラベルフリー解析に適した手法です。ソース固有のスペクトル指紋が生成され、多変量解析を用いて分析することができます。...

ラマン分光法を用いた細胞と細胞外マトリックスの非接触、ラベルフリーの監視

学ぶ調整可能な抵抗パルスセンシング（TRPS）による細胞外小胞の定量化とサイズプロファイリング手法。標準法とスパイクイン法を用いて、生体液中のEVを直接測定し、神経科学・細胞生物学研究に応用する。

調整可能な抵抗パルスセンシングを使用して定量化し、細胞外小胞の大きさ、プロファイリング

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