軸索変性と白質神経生物学の研究のための皮質下白質ストロークの多彩なマウスモデル

この手順の全体的な目標は、マウスの白質内の小さなストロークを正確に特定して、この一般的な形態の皮質下白質ストロークをモデル化することです。この方法は、軸索損傷のメカニズム、皮質下脳卒中に対するニューロンの応答、脳卒中の急性期と修復期の両方で白質の細胞要素がどのように応答するかなど、脳卒中分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、ストロークを白質に正確に局在化するために使用でき、さまざまなマウスモデルで使用できることです。

一般に、この方法に不慣れな個人は、脳卒中の誤局在につながる少量の白質のために苦労します。マウスの各系統の注入角度や定位座標の微調整、または定位設定が必要になる場合があります。まず、引っ張ったガラスピペットをバキュームラインに取り付けられたチューブに取り付けます。

引っ張った端をL-Nio溶液、またはL-Nioと蛍光トレーサーの両方に挿入します。真空を開始し、ピペットの直径0.5ミリメートル部分の少なくとも2ミリメートルが満たされるまで吸引を加えます。充填されたピペットを片側に置きます。

次に、マウスを定位顕微鏡を備えた定位装置に入れます。承認された手順に従ってマウスに麻酔をかけ、手術の準備をした後、つま先をつまんで麻酔の深さを確認します。応答はないはずです。

次に、インジェクションアームを36度に調整します。引っ張ったガラスピペットホルダーを低容量圧力注入システムの遠位端に取り付け、注入アームに取り付けます。頭蓋骨を露出させるために頭皮の正中線を1.5センチメートル切開した後、綿棒で表面の頭蓋骨を乾かします。

次に、定位顕微鏡を覗きながら、1〜3倍の倍率でマイクロポイントツールを使用して、上にある骨膜組織をすべて除去します。ブレグマを細かいポイントマーカーでマークします。次に、先端の細い外科用ドリルビットを備えた外科用ドリルを使用して、ブレグマから後方から始まり、正中線のすぐ左前方に伸びる2ミリメートルの楕円形開頭術をドリルします。

骨片とその上にある軟部組織を取り除き、大脳皮質を視覚化できるようにします。滅菌生理食塩水を断続的に滴下することにより、皮質表面を湿らせます。.次に、充填したピペットをインジェクターアームに取り付けます。

ピペットの遠位端をブレグマに合わせ、定位座標をゼロにします。表1に記載されている前方、後方、および内側外側の座標を使用して、ピペットを最初の注入ポイントまで進めます。次に、ピペットを皮質表面に進め、背腹測定をゼロにします。

ピペットをゆっくりと背腹側座標まで下げます。定位顕微鏡の倍率が3つのXに設定されていること、およびキャリブレーションされたレチクルがはっきりと見えることを確認してください。角度のついたピペットを横から見て、空気流体のメニスカスが矢状に見えるようにします。

メニスカスは、ピペットの内壁と外壁の両方の同じ焦点面に現れる必要があります。次に、20 PSIに設定された局所圧力注入システムを使用して、20ミリ秒のパルスで、100ナノリットルのL-Nioを脳に注入します。総量を注入した後、ピペットトラックの逆流を防ぐために5分間待ちます。

次に、ピペットを引き出し、表1に示す2番目と3番目の座標セットで注入手順を繰り返します。最終注射後、ピペットを取り外し、開頭術部位を埋めるのに十分な骨ワックスを置きます。最後に、頭皮の傷の端を近似し、皮膚接着剤で結合します。

術後鎮痛剤を投与した後、動物を清潔なケージに入れます。術後抗生物質を飲料水に5日間、または5日未満の場合は犠牲になるまで供給します。承認された手順に従ってマウスを犠牲にして斬首した後、滅菌ハサミを使用して頭蓋骨を後方に開き、次にへらを使用して上にある頭蓋骨をそっと取り除きます。

次に、脳の前部に滅菌した4ミリメートルのヘラを挿入して、嗅球と視神経を切断します。次に、脳をカルバリウムからそっと持ち上げ、氷冷解剖バッファーに入れます。ブレインブロックと滅菌カミソリの刃を使用して、患部を含む2〜3ミリメートルのスライスを切り取り、冷解剖緩衝液に入れます。

解剖顕微鏡下で、注入された半球の運動皮質の下にある白質を特定します。脳卒中後の早い段階で、L-Nioをファストグリーンなどの一般的な実験用色素と混合して注射すると、脳卒中の視覚的識別が可能になります。.脳卒中後の間隔が長いと、その領域は限局性壊死とミエリン蒼白によって視覚的に識別される可能性があります。.

特定されたら、メスを使用して、脳卒中を含む白質の領域を慎重に解剖します。必要に応じて、上にある皮質とその下にある線条体を取り除きます。ここに示すように、神経フィラメントの免疫蛍光標識(赤で示されている)は、脳卒中7日後の軸索喪失の程度を内側アプローチを用いて示しています。

後方角度アプローチを使用すると、白質脳卒中病変は側脳室のすぐ上を標的とされ、IBA-1 の免疫標識によって検出されるように、強いミクログリア反応性を示します。2つのアストロサイト中間フィラメントマーカーであるビメンチン(赤)とグリア線維性酸性タンパク質(緑)は、脳卒中後の白質アストロサイトの形態の変化を明らかにしています。脳卒中誘発時に蛍光デキストランアミンを同時注入することで、脳卒中により損傷した軸索を有する個々のニューロンを同定することができる。

標識の大部分は、脳卒中を覆う一次感覚運動皮質の第5層および第6層ニューロン内の軸索で発生します。この画像は脳卒中後7日を表しています。このテクニックを習得すると、適切に実行すれば、45分で完了します。

このビデオを見た後、マウスで限局性白質脳卒中を生成する方法を十分に理解し、脳卒中や神経修復の重要な質問に答えるのに役立つさまざまな下流処理のために脳を準備する必要があります。