軸索変性と白質神経生物学の研究のための皮質下白質ストロークの多彩なマウスモデル

本手順の全体的な目的は、マウスの白質内において小さな梗塞部位を正確に特定し、この一般的な皮質下白質梗塞の形態をモデル化することです。この手法は、軸索損傷のメカニズム、皮質下梗塞に対する神経細胞の反応、および梗塞の急性期と修復期の両方における白質の細胞成分の反応など、脳梗塞研究における重要な疑問を解決するのに役立ちます。この技術の主な利点は、白質に梗塞を精密に局在化でき、かつ多種多様なマウスモデルに適用可能である点にあります。

一般的に、この手法に不慣れな方は、白質の量が少ないために脳卒中の局在化を誤りやすく、苦労することがあります。マウスの系統ごとに、注入角度や立体定位座標、あるいは立体定位装置の設定を微調整する必要があるかもしれません。まず、引き伸ばしたガラスピペットを真空ラインに接続されたチューブに固定することから始めてください。

引き抜いた端をL-Nio溶液、または蛍光トレーサーを加えたL-Nio溶液に浸します。真空ポンプを始動させ、ピペットの直径0.5 mmの部分が少なくとも2 mm充填されるまで吸引します。充填したピペットを脇に置いておきます。

次に、マウスを立体定位顕微鏡を備えた立体定位固定装置に設置します。承認された手順に従ってマウスを麻酔し、手術の準備を整えた後、足指をつねって麻酔深度を確認します。反応がないことを確認してください。

次に、注入アームを36度に調整します。低容量圧力注入システムの遠位端に、引き伸ばしたガラスピペットホルダーを取り付け、それを注入アームに装着します。頭蓋骨を露出させるために正中線に沿って頭皮を1.5 centimeter切開した後、綿棒で頭蓋骨の表面を拭き取ります。

次に、実体顕微鏡下で1〜3倍の倍率に設定し、マイクロポイントツールを使用して、上層にある骨膜組織を除去します。細筆マーカーでブレグマに印を付けます。その後、先端の細い外科用ドリルビットを装着した外科用ドリルを用い、ブレグマから後方を起点とし、正中線のわずか左側の前方へ向かって、2 mmの楕円形の開頭術を行います。

大脳皮質が視認できるように、骨片と表面の軟組織を除去します。滅菌生理食塩水を断続的に滴下し、皮質表面を湿らせた状態に保ちます。次に、充填したピペットをインジェクターアームに固定します。

ピペットの先端をブレグマに合わせ、ステレオタキシスの座標をゼロに設定します。表1に記載されている前後および内外側の座標に従い、ピペットを最初の注入点まで移動させます。次に、ピペットを皮質表面まで進め、背腹方向の測定値をゼロに設定します。

ピペットを背腹座標までゆっくりと下げます。ステレオ顕微鏡の倍率が3倍に設定されており、校正済みのレチクルがはっきりと見えていることを確認してください。気液界面が矢状方向に見えるように、角度をつけたピペットを側面から観察します。

メニスカスが、ピペットの内壁と外壁の両方で同じ焦点面に現れている必要があります。次に、20 PSIで20ミリ秒のパルスに設定した局所圧注入システムを用い、100ナノリットルのL-Nioを脳内に注入します。全量を注入した後、ピペットの経路を 통한逆流を防ぐため、5分間待ちます。

次に、ピペットを引き抜き、表1に記載されている2番目および3番目の座標セットで注入手順を繰り返します。最後の注入後、ピペットを取り除き、開頭部位を埋めるのに十分な量のボーンワックスを充填します。最後に、頭皮の創傷端を接近させ、皮膚用接着剤で固定します。

術後の鎮痛処置後、動物を清潔なケージに入れてください。術後抗生物質を飲料水に混ぜて5日間、あるいは5日未満で安楽死させる場合は安楽死まで投与します。承認された手順に従ってマウスを安楽死させ、頸椎脱臼させた後、滅菌鋏を用いて後頭部から頭蓋骨を開き、スパチュラで上層の頭蓋骨を慎重に取り除きます。

次に、滅菌済みの4 mmスパチュラを脳の前方に挿入し、嗅球と視神経を切断します。その後、脳を緩やかに頭蓋骨から取り出し、氷冷した解剖バッファーに入れます。脳ブロックと滅菌済みカミソリブレードを用いて、患部を含む2〜3 mmのスライスを作成し、冷解剖バッファーに入れます。

解剖顕微鏡下で、注入した側の半球における運動皮質下の白質を特定します。脳卒中後の早い段階では、fast greenなどの一般的な実験室用色素と混合したL-Nioを注入することで、脳卒中部位を視覚的に特定することが可能です。脳卒中後しばらく時間が経過している場合は、局所的な壊死と髄鞘の蒼白化によってその領域を視覚的に特定できる場合があります。

部位を特定後、メスを用いて脳卒中が発生した白質領域を注意深く摘出します。必要に応じて、上層の皮質および下層の線条体を切除してください。ここで示すように、神経フィラメントの免疫蛍光染色（赤色）により、内側アプローチを用いた脳卒中7日後の軸索脱落の程度が示されています。

後方角度アプローチを用いて、側脳室の直上の白質梗塞病変を標的としており、IBA-1の免疫ラベル化によって検出される強力なミクログリア反応が認められます。2つのアストロサイト中間フィラメントマーカーであるvimentin（赤色）とglial fibrillary acidic protein（緑色）により、脳梗塞後の白質アストロサイトの形態変化が明らかになります。梗塞誘導時に蛍光デキストランアミンを共注入することで、梗塞により軸索が損傷した個々のニューロンを同定することが可能です。

標識の大部分は、脳卒中部位の上層にある一次感覚運動野の第5層および第6層ニューロン内の軸索で認められます。この画像は、脳卒中後7日目の状態を示しています。習熟すれば、適切に実施することでこの手法を45分で完了させることができます。

このビデオを視聴することで、マウスにおいて局所的な白質脳卒中を誘発する方法と、脳卒中および神経修復に関する重要な疑問を解明するために有用な、さまざまなダウンストリーム処理に向けた脳の準備方法について、十分に理解することができます。