軸索変性と白質神経生物学の研究のための皮質下白質ストロークの多彩なマウスモデル
2016年3月17日
ここでは、不可逆的な内皮一酸化窒素合成酵素(eNOS)阻害剤(L-Nio)の局所注射によるマウス白質の病巣性脳卒中の生成方法を紹介します。この技術の潜在的な応用を拡大する2つの定位バリエーション、逆行性ニューロントレーシング、および新鮮な組織の標識と解剖が提示されます。
この手順の全体的な目標は、マウスの白質内の小さなストロークを正確に特定して、この一般的な形態の皮質下白質ストロークをモデル化することです。この方法は、軸索損傷のメカニズム、皮質下脳卒中に対するニューロンの応答、脳卒中の急性期と修復期の両方で白質の細胞要素がどのように応答するかなど、脳卒中分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、ストロークを白質に正確に局在化するために使用でき、さまざまなマウスモデルで使用できることです。
一般に、この方法に不慣れな個人は、脳卒中の誤局在につながる少量の白質のために苦労します。マウスの各系統の注入角度や定位座標の微調整、または定位設定が必要になる場合があります。まず、引っ張ったガラスピペットをバキュームラインに取り付けられたチューブに取り付けます。
引っ張った端をL-Nio溶液、またはL-Nioと蛍光トレーサーの両方に挿入します。真空を開始し、ピペットの直径0.5ミリメートル部分の少なくとも2ミリメートルが満たされるまで吸引を加えます。充填されたピペットを片側に置きます。
次に、マウスを定位顕微鏡を備えた定位装置に入れます。承認された手順に従ってマウスに麻酔をかけ、手術の準備をした後、つま先をつまんで麻酔の深さを確認します。応答はないはずです。
次に、インジェクションアームを36度に調整します。引っ張ったガラスピペットホルダーを低容量圧力注入システムの遠位端に取り付け、注入アームに取り付けます。頭蓋骨を露出させるために頭皮の正中線を1.5センチメートル切開した後、綿棒で表面の頭蓋骨を乾かします。
次に、定位顕微鏡を覗きながら、1〜3倍の倍率でマイクロポイントツールを使用して、上にある骨膜組織をすべて除去します。ブレグマを細かいポイントマーカーでマークします。次に、先端の細い外科用ドリルビットを備えた外科用ドリルを使用して、ブレグマから後方から始まり、正中線のすぐ左前方に伸びる2ミリメートルの楕円形開頭術をドリルします。
骨片とその上にある軟部組織を取り除き、大脳皮質を視覚化できるようにします。滅菌生理食塩水を断続的に滴下することにより、皮質表面を湿らせます。.次に、充填したピペットをインジェクターアームに取り付けます。
ピペットの遠位端をブレグマに合わせ、定位座標をゼロにします。表1に記載されている前方、後方、および内側外側の座標を使用して、ピペットを最初の注入ポイントまで進めます。次に、ピペットを皮質表面に進め、背腹測定をゼロにします。
ピペットをゆっくりと背腹側座標まで下げます。定位顕微鏡の倍率が3つのXに設定されていること、およびキャリブレーションされたレチクルがはっきりと見えることを確認してください。角度のついたピペットを横から見て、空気流体のメニスカスが矢状に見えるようにします。
メニスカスは、ピペットの内壁と外壁の両方の同じ焦点面に現れる必要があります。次に、20 PSIに設定された局所圧力注入システムを使用して、20ミリ秒のパルスで、100ナノリットルのL-Nioを脳に注入します。総量を注入した後、ピペットトラックの逆流を防ぐために5分間待ちます。
次に、ピペットを引き出し、表1に示す2番目と3番目の座標セットで注入手順を繰り返します。最終注射後、ピペットを取り外し、開頭術部位を埋めるのに十分な骨ワックスを置きます。最後に、頭皮の傷の端を近似し、皮膚接着剤で結合します。
術後鎮痛剤を投与した後、動物を清潔なケージに入れます。術後抗生物質を飲料水に5日間、または5日未満の場合は犠牲になるまで供給します。承認された手順に従ってマウスを犠牲にして斬首した後、滅菌ハサミを使用して頭蓋骨を後方に開き、次にへらを使用して上にある頭蓋骨をそっと取り除きます。
次に、脳の前部に滅菌した4ミリメートルのヘラを挿入して、嗅球と視神経を切断します。次に、脳をカルバリウムからそっと持ち上げ、氷冷解剖バッファーに入れます。ブレインブロックと滅菌カミソリの刃を使用して、患部を含む2〜3ミリメートルのスライスを切り取り、冷解剖緩衝液に入れます。
解剖顕微鏡下で、注入された半球の運動皮質の下にある白質を特定します。脳卒中後の早い段階で、L-Nioをファストグリーンなどの一般的な実験用色素と混合して注射すると、脳卒中の視覚的識別が可能になります。.脳卒中後の間隔が長いと、その領域は限局性壊死とミエリン蒼白によって視覚的に識別される可能性があります。.
特定されたら、メスを使用して、脳卒中を含む白質の領域を慎重に解剖します。必要に応じて、上にある皮質とその下にある線条体を取り除きます。ここに示すように、神経フィラメントの免疫蛍光標識(赤で示されている)は、脳卒中7日後の軸索喪失の程度を内側アプローチを用いて示しています。
後方角度アプローチを使用すると、白質脳卒中病変は側脳室のすぐ上を標的とされ、IBA-1 の免疫標識によって検出されるように、強いミクログリア反応性を示します。2つのアストロサイト中間フィラメントマーカーであるビメンチン(赤)とグリア線維性酸性タンパク質(緑)は、脳卒中後の白質アストロサイトの形態の変化を明らかにしています。脳卒中誘発時に蛍光デキストランアミンを同時注入することで、脳卒中により損傷した軸索を有する個々のニューロンを同定することができる。
標識の大部分は、脳卒中を覆う一次感覚運動皮質の第5層および第6層ニューロン内の軸索で発生します。この画像は脳卒中後7日を表しています。このテクニックを習得すると、適切に実行すれば、45分で完了します。
このビデオを見た後、マウスで限局性白質脳卒中を生成する方法を十分に理解し、脳卒中や神経修復の重要な質問に答えるのに役立つさまざまな下流処理のために脳を準備する必要があります。
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概要
この記事では、不可逆的なeNOS阻害剤（L-Nio）の局所注射を通じて、マウスの白質に焦点性脳卒中を生じさせるための方法論を提示します。この技術には、脳卒中研究への応用を高めるための立体視覚的変異と新鮮組織のラベリングが含まれています。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 脳卒中研究
- マウスモデル
背景
- 白質の焦点性脳卒中は、皮質下脳卒中モデルでは一般的です。
- 軸索損傷と神経細胞反応の理解は、脳卒中研究において重要です。
- 脳卒中の正確な局在化は実験結果を改善する可能性があります。
- マウスの系統の違いにより、技術の調整が必要になる場合があります。
研究の目的
- マウスの皮質下白質脳卒中を正確にモデル化する。
- 軸索損傷と神経細胞反応のメカニズムを調査する。
- 脳卒中の急性期および修復期における細胞反応を探る。
使用された方法
- 立体視覚装置を用いたL-Nioの注射。
- 脳卒中誘発のためのマウスの準備と外科手術。
- 分析のための脳組織の解剖とラベリング。
- 軸索損失とミクログリア反応を評価するための免疫蛍光ラベリング。
主要な結果
- マウスの白質における脳卒中病変の成功的な局在化。
- 脳卒中後の軸索損傷とミクログリア活性の同定。
- 蛍光トレーサーを用いた脳卒中の視覚的同定。
- 脳卒中への反応におけるアストロサイトの変化の証明。
結論
- この技術により、白質脳卒中の精密なモデル化が可能になります。
- 脳卒中損傷の細胞メカニズムへの洞察を提供します。
- 将来の応用により、脳卒中回復プロセスの理解が深まる可能性があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Modeling focal white matter stroke in mice addresses a critical gap in preclinical stroke research, enabling mechanistic de-risking of axonal degeneration pathways. This model supports target validation by providing a disease-relevant system to study neuroinflammatory and repair responses relevant to vascular dementia and silent infarct burden. Precise lesion localization enhances predictive confidence in early discovery by reducing biological variability in downstream assay readouts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses related to axonal injury mechanisms in white matter pathology.
- Operational Value: Provides a murine-compatible platform for functional target validation using established neurobiological tools.
- Scientific Value: Supports biological de-risking by modeling silent infarct contributions to vascular dementia progression.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantifiable histological endpoints such as axonal loss and microglial reactivity for assay standardization.
- Operational Value: Facilitates preparation of validated tissue sections for reproducible immunofluorescence and tracer-based analyses.
- Scientific Value: Enables screening readiness through focal lesion induction compatible with retrograde neuronal tracing and fresh tissue labeling.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Aligns with disease-relevant systems by modeling subcortical white matter stroke contributing to vascular dementia.
- Operational Value: Ensures continuity from discovery through preclinical validation via standardized stereotactic delivery and tissue processing.
- Scientific Value: Supports risk-adjusted advancement decisions by linking lesion location to cellular response profiles in acute and repair phases.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by enabling hypothesis testing of white matter-specific stroke mechanisms prior to lead identification efforts.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification through targeted lesion induction in murine white matter tracts.
- Screening: Delivers assay-ready tissue with quantifiable outputs such as IBA-1+ microglial activation and axonal filament loss.
- Analytics: Provides measurable dependent variables including fluorescence intensity of neural filament and astrocytic markers for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity through modeling of stroke phases relevant to vascular cognitive impairment.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable stereotactic framework adaptable across mouse strains and tracer combinations for longitudinal studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in white matter injury models.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized coordinates, injection parameters, and tissue dissection protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early assessment of target engagement in axonal degeneration pathways.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted prioritization by modeling a highly prevalent yet understudied stroke subtype linked to dementia risk.
Implementation Considerations
- Requires expertise in stereotactic surgery and murine neuroanatomy for accurate white matter targeting.
- Dependent on calibrated pressure injection systems and sterile microsurgical tools for consistent lesion induction.
- Necessitates cross-team standardization of histological staining and imaging protocols for multi-site reproducibility.
- Involves adaptation considerations when applying the model across different murine genetic backgrounds or comorbid conditions.
- Practical limitations include small target size requiring strain-specific coordinate adjustments and meticulous postoperative care to ensure survival.
