Name: 軸索変性と白質神経生物学の研究のための皮質下白質ストロークの多彩なマウスモデル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 36 s
Description: 学ぶ マウス皮質下白質ストロークモデル。ステレオタクティック注射でL-Nioを局所投与し、軸索変性とミクログリア活性化を誘導する手法です。神経科学と脳卒中研究のメカニズム解明に有用です。

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SNとMDDは、NIH K08 NS083740と神経のUCLA省から支援を受けました。 AJG博士ミリアムとシェルドン・G・アデルソン医学研究財団とラリーL. Hillblom基金による支援を認めます。 KLNは感謝アメリカ心臓協会14BFSC17760005 ASA-Bugher脳卒中センターから支援を認めています。 ILL、EGSとSTCは、NIH R01 NS071481によってサポートされていました。 JDHは、NIH K08 NS083740からの支援を認めています。

このプロトコルでの動物の使用は、カリフォルニア州ロサンゼルス動物実験委員会の大学によって承認された手順に従って行われています。 注：ターゲットマウスの人口を識別することによって開始します。以前の研究では、唯一の雄の野生型C57 / BL6マウスが使用されている、しかし、様々なトランスジェニックまたはノックアウトマウスを使用することもできます。定位座標はC57 / BL6の解剖学に基づいていることに注意してください。各ユーザーが最初に白質へのストロークの局在を確認することをお勧めします。 1.白質ストロークの誘導 - 内側側斜めのアプローチ<ol><li>先端径が15~25ミクロン11との間にあるようには0.5mmのキャピラリーチューブを用いて引っ張らガラスピペットを調製することによって開始します。 </li><li> 0.9％滅菌生理食塩水中27.4 mg / mlで（130μM）で - L-仁王の滅菌10μlのアリコート（（1）-iminoethyl-L-オルニチン塩酸N（5））を準備します。 </li><li>引っ張られたガラスピペットをプレフィルガラスピペットを固定することによりL-仁王（2-5μL）の小容量の真空ラインに接続されたチューブにします。作業台の上に平らにピペットを置き、L-仁王溶液中に引き込まの端を挿入します。 <ol><li>ピペットの0.5ミリメートル部の少なくとも2ミリメートルが満たされるまで真空を適用します。真空の電源をオフにし、ピペットを撤回。ステップ1.12になるまでそれを脇に置きます。 </li></ol></li><li>誘導チャンバー内にマウスを置き、標準の32％イソフルランを用いてマウスの麻酔を誘導し、1分間または深く麻酔されるまで（5 L /分5リットル/分の酸素と0.5 L / minのN 2と吸入）気化器を通って流れます。定位顕微鏡を備えた定位装置にマウスを転送します。気化器を通って流れ32％イソフルランを使用して、メンテナンス麻酔を提供し、ノーズコーン（2 L /分5リットル/分の酸素と0.5 L / minのN 2と吸入しました）。つま先のピンチで麻酔の深さを確認してください。 </li><li> 36°に注入アームを調整します。 </li><li>アッフィXAは、低容量の圧力噴射システムの先端にガラスピペットホルダーを引っ張り、定位セットアップの射出アームに取り付けます。 </li><li>コー​​ト両目の上にワセリンと場所人工涙軟膏で麻酔動物のウィスカー。頭の上に5〜10センチメートル開口部と、動物の頭の上に滅菌ドレープを配置することにより、無菌手術野を準備します。頭蓋骨を覆う毛を剃ることによってaspetic手術用表面を準備します。ベタジンおよび70％アルコール綿棒を交互に頭皮をきれいにしてください。 </li><li>頭蓋骨の表面を露出させる滅菌細かいハサミ1.5センチ正中頭皮切開を行います。滅菌綿棒で頭蓋骨を乾燥さ1-3X倍率で定位顕微鏡を用いて、滅菌マイクロポイントツールを使用して、任意の上に重なる骨膜組織を除去します。 </li><li>細かい点マーカーを使用して、基準点としてマークブレグマ。 </li><li>滅菌細かいSTIP手術用ドリルビットを使用して、2ミリメートルellipitical開頭術をドリル0;ブレグマで後方に始まり、ちょうど正中線の左前方に延びています。骨片を取り外し、大脳皮質を可視化することができるように、軟組織の上に重なります。 </li><li>断続的に滅菌生理食塩水の滴を適用することによって、手術野と湿った皮質表面を保管してください。 </li><li>定位装置のインジェクタアームに引っ張らガラスピペットを貼り付けます。ブレグマとピペットの先端の位置を合わせ、定位座標をゼロ。 </li><li>最初の前方/後方（A / P）にピペットを進め、（M / L）内側/外側の表1に調整します。 </li><li>皮質表面にピペットを進め、背/腹側（D / V）測定をゼロ。 </li><li>ゆっくりと第1のD / V、表1の座標に達するまで脳内にピペットを渡します。 </li><li> 20ミリ秒パルスの20 psiで設定された低容量圧力噴射システムを使用して、脳内にL-仁王の100 NLを注入し、逆流を防止するために、5分を待ちますピペットトラックアップ。 <ol><li>定位顕微鏡の接眼レンズと3Xの倍率で校正レチクルを使用してください。 </li><li>したがって、座標のセットごとに引っ張らガラスピペットから（100 NLに対応し、直径0.5mmのピペットで0.5ミリメートルの長さ）0.100ミリメートル3の合計を変位。レチクルを使用することにより、それぞれが使用倍率とスケールに依存して変化する設定以来測定し、標準化します。 </li><li>空気流体メニスカスがサジタルビューを持っているように、各注入時の正確な体積測定のために、側から顕微鏡で角度の付いたピペットに近づきます。メニスカスは、ピペットの内側と外側の壁の両方の同じ焦点面に表示されます。 </li></ol></li><li>ゆっくりピペットを撤回し、手順を繰り返し1.13-1.16.3 表1に提供された座標の2番目と3番目のセットで。 </li><li>最後の注射の後、ピペットを削除し、開頭術部位を満たすのに十分な骨ワックスを配置します。 A頭皮の傷の縁をpproximateと皮膚接着剤で結合します。 </li><li>頭皮切開に関連した局所疼痛を防止するために予防するために無菌の30 G針を使用して、創傷縁に0.5％マーカインを0.1mlを注入。 </li><li> 5日間飲料水中ハウジングと供給術後の抗生物質（0.48 mg / mlでトリメトプリム・スルファメトキサゾール、または0.5 mg / mlとレボフロキサシン）に動物を返します。 </li></ol> 2.白質ストロークの誘導 - 後方斜めアプローチ<ol><li>後部に前方を指向45度に定位セットアップの注入アームを調整する以外は、内側斜めのアプローチプロトコルのように、手順1.1から1.12を実行します。 </li><li>第1のA / Pにピペットを進め、M / Lは、 表2に提供さ座標。 </li><li>横方向の角度の付いたアプローチプロトコルのように、残りのステップ1.14から1.20までは完了。 </li></ol> 3.逆行性神経ラベリング<ol><li>滅菌10を準備します0.9％の生理食塩水で54.8 mg / mlでのL-仁王μlのアリコート。 </li><li> 0.9％の生理食塩水で20％Fluororuby（または20％ビオチン化デキストランアミンまたは2％フルオロゴールド）の無菌アリコートを準備します。 </li><li> 27.4 mg / mlでL-NiO及び10％Fluororubyの最終濃度のために1：一緒に1を希釈します。 </li><li>ステップ1.3から1.23に上記のようにストロークプロトコルを実行します。 </li><li>以前に8を説明したように灌流固定、凍結切片および顕微鏡により組織切片でネイティブに蛍光トレーサーを可視化します。 </li></ol>免疫蛍光4.組織処理<ol><li>脳卒中後の14日に3時間の範囲の適切な脳卒中後の間隔で、イソフルラン過剰摂取またはローカルIACUC承認手続きを経て、マウスを安楽死させます。 </li><li>角度のついたハサミを使用して胸腔を開き、左心室に23 Gの翼状針を挿入します。 </li><li>灌流液のための流出トラックを可能にするために、微細なハサミを使用して右心房に小さなカットを配置します。 </li><li>経RTで10 ml /分の速度で冷4％パラホルムアルデヒド30〜40 MLにより、その後の冷リン酸緩衝化生理食塩水30〜40 mlの灌流。 </li><li>マウスを刎ねると後方頭蓋骨を開くために、滅菌ハサミを使って脳を除去した後、静かに24時間の冷4％PFAに脳を、スパチュラで覆って頭蓋骨を削除置き、その後、48時間、PBS中30％スクロースに転送。 </li><li>クライオスタットを用いて、40ミクロンの浮遊切片を作製し、以前6-8に記載されているように 、抗体処理を行います。本研究では、以下の抗体を使用します：ウサギ抗ニューロフィラメント200（1：500希釈）。ウサギ抗ビメンチン（1：500）。ヤギ抗GFAP（1：500）。ウサギ抗伊庭-1（1：1,000）。 </li></ol>タンパク質またはRNA分析5.組織処理<ol><li>脳卒中後の14日に3時間の範囲の適切な脳卒中後の間隔で、イソフルラン過剰摂取またはローカルIACUC承認手続きを経て安楽死させます。 </li><li>首をはねます後方頭蓋骨を開き、静かにスパチュラで上層の頭蓋骨を削除するには、滅菌ハサミを使って脳をマウスおよび削除します。 </li><li>嗅球と視神経を切断するために、脳の前部に滅菌4ミリメートルのへらを挿入します。ゆっくり頭蓋冠から脳を持ち上げ、氷冷解剖バッファー（1×ハンクス液、25mMのHEPES-KOH、pHが7.4、35 mMグルコース、4 mMの重炭酸ナトリウム、および0.01 mg / mlでシクロヘキ）に配置します。 </li><li>脳ブロックおよび滅菌新しいかみそりの刃を使用して、冷たい解剖バッファにストロークと場所を含む2〜3ミリメートルのスラブを準備します。 </li><li>解剖顕微鏡下で、注入された半球に運動皮質の基礎となる白質を識別します。長い脳卒中後の間隔で、領域を視覚的巣状壊死およびミエリン蒼白によって同定することができます。 注：以前の脳卒中後の間隔で、10％ファストグリーン1μlのと混合し、L-仁王の注射は、脳卒中の視覚的な識別を可能にすることができます（ <strong&gt;図4A）。 </li><li>解剖顕微鏡の指導の下、新鮮なメスを使用して、慎重にファストグリーンラベル付けや組織損失のいずれかによって識別さストロークを含む白質領域を解剖。所望のように上に重なる皮質と下にある線条体を削除します。 </li></ol>

<ol><li>Go, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+disease+and+stroke+statistics--2014+update%3A+a+report+from+the+American+Heart+Association%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Heart disease and stroke statistics--2014 update: a report from the American Heart Association.</a> Circulation. 129, 28-292 (2014).</li>
<li>Saini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silent+stroke%3A+not+listened+to+rather+than+silent%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Silent stroke: not listened to rather than silent.</a> Stroke. 43, 3102-3104 (2012).</li>
<li>Koton, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Burden+and+outcome+of+prevalent+ischemic+brain+disease+in+a+national+acute+stroke+registry%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Burden and outcome of prevalent ischemic brain disease in a national acute stroke registry.</a> Stroke. 44, 3293-3297 (2013).</li>
<li>Jiwa, N. S., Garrard, P., Hainsworth, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+models+of+vascular+dementia+and+vascular+cognitive+impairment%3A+a+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Experimental models of vascular dementia and vascular cognitive impairment: a systematic review.</a> J Neurochem. 115, 814-828 (2010).</li>
<li>Sozmen, E. G., Hinman, J. D., Carmichael, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models+that+matter%3A+white+matter+stroke+models%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotherapeutics%22%5BJournal%5D)">Models that matter: white matter stroke models.</a> Neurotherapeutics. 9, 349-358 (2012).</li>
<li>Sozmen, E. G., Kolekar, A., Havton, L. A., Carmichael, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+white+matter+stroke+model+in+the+mouse%3A+axonal+damage%2C+progenitor+responses+and+MRI+correlates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A white matter stroke model in the mouse: axonal damage, progenitor responses and MRI correlates.</a> J Neurosci Methods. 180, 261-272 (2009).</li>
<li>Rosenzweig, S., Carmichael, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-dependent+exacerbation+of+white+matter+stroke+outcomes%3A+a+role+for+oxidative+damage+and+inflammatory+mediators%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Age-dependent exacerbation of white matter stroke outcomes: a role for oxidative damage and inflammatory mediators.</a> Stroke. 44, 2579-2586 (2013).</li>
<li>Hinman, J. D., Rasband, M. N., Carmichael, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remodeling+of+the+axon+initial+segment+after+focal+cortical+and+white+matter+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Remodeling of the axon initial segment after focal cortical and white matter stroke.</a> Stroke. 44, 182-189 (2013).</li>
<li>McCall, T. B., Feelisch, M., Palmer, R. M., Moncada, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+N-iminoethyl-L-ornithine+as+an+irreversible+inhibitor+of+nitric+oxide+synthase+in+phagocytic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Brit+j+pharmacol%22%5BJournal%5D)">Identification of N-iminoethyl-L-ornithine as an irreversible inhibitor of nitric oxide synthase in phagocytic cells.</a> Brit j pharmacol. 102, 234-238 (1991).</li>
<li>Gadea, A., Aguirre, A., Haydar, T. F., Gallo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelin-1+regulates+oligodendrocyte+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Endothelin-1 regulates oligodendrocyte development.</a> J Neurosci. 29, 10047-10062 (2009).</li>
<li>Dean, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+%28pulling%29+of+needles+for+gene+delivery+by+microinjection%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+prot%22%5BJournal%5D)">Preparation (pulling) of needles for gene delivery by microinjection.</a> CSH prot. , (2006).</li>
<li>Hughes, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focal+lesions+in+the+rat+central+nervous+system+induced+by+endothelin-1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuropathol.+Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Focal lesions in the rat central nervous system induced by endothelin-1.</a> J. Neuropathol. Exp. Neurol. 62, 1276-1286 (2003).</li>
<li>Whitehead, S. N., Hachinski, V. C., Cechetto, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+between+a+rat+model+of+cerebral+ischemia+and+beta-amyloid+toxicity%3A+inflammatory+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Interaction between a rat model of cerebral ischemia and beta-amyloid toxicity: inflammatory responses.</a> Stroke. 36, 107-112 (2005).</li>
<li>Frost, S. B., Barbay, S., Mumert, M. L., Stowe, A. M., Nudo, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+animal+model+of+capsular+infarct%3A+endothelin-1+injections+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Behav+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">An animal model of capsular infarct: endothelin-1 injections in the rat.</a> Behav Brain Res. 169, 206-211 (2006).</li>
<li>Horie, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+model+of+focal+cerebral+ischemia+using+endothelin-1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Mouse model of focal cerebral ischemia using endothelin-1.</a> J Neurosci Methods. 173, 286-290 (2008).</li>
<li>Wang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cognitive+deficits+and+delayed+neuronal+loss+in+a+mouse+model+of+multiple+microinfarcts%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Cognitive deficits and delayed neuronal loss in a mouse model of multiple microinfarcts.</a> Neuroscience. 32, 17948-17960 (2012).</li>
<li>Shih, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+smallest+stroke%3A+occlusion+of+one+penetrating+vessel+leads+to+infarction+and+a+cognitive+deficit%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The smallest stroke: occlusion of one penetrating vessel leads to infarction and a cognitive deficit.</a> Nat Neurosci. 16, 55-63 (2013).</li>
<li>Jung, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+endothelin+receptor+A+during+myelination+of+developing+oligodendrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Korean+Med+Sci%22%5BJournal%5D)">The role of endothelin receptor A during myelination of developing oligodendrocytes.</a> J Korean Med Sci. 26, 92-99 (2011).</li>
</ol>

皮質下脳卒中の前モデルの数は、ラット12-14とマウス6,15における内部のカプセルへのエンドセリン-1の焦点注射、皮質下白質と線条体を含む、記載されています。小焦点脳卒中のより最近のモデルは、頸動脈16と、単一の貫通動脈17の光血栓閉塞中のコレステロール微小塞栓注射を利用してきました。これらのモデルのそれぞれが長所と短所5の両方を持っています。現在説明したモデルは、軸索の異常や損失、ミエリン分解、焦点壊死性コアと最小であり、7歳に依存して、かなり急速な回復を示している臨床赤字を含むヒトラクナ梗塞を模倣する多くの特性を持つ病変を生成します。ネズミ白質を標的とすることは機構研究をサポートすることができる遺伝子操作のさまざまなことができます。 クリティカルプロトコルのステップは、正確な定位座標を利用することが含まれます。マウスの白質のサイズが小さく、株からの歪みに変化するので、定位座標の改正は、使用したマウスの年齢および株に依存必要な場合があります。これは...

皮質下白質に影響を与える脳卒中は一般的な臨床実体であり、米国では年間臨床脳卒中の最大25%を占めています1。白質への虚血性損傷も有意に高い割合で静かに発生し、血管性認知症の発症に寄与します2,3。現在、この形態の脳虚血の患者は、治療の選択肢があったとしてもほとんどありません。この疾患の臨床的重要性にもかかわらず、臨床的に関連する動物モデルはほとんど存在しません4,5。
このプロトコルの目標は、マウスの白質内に限局性虚血性病変を生じさせることです。このヒト疾患のマウスモデルにより、脳卒中に対する軸索損傷反応と、白質の細胞要素、すなわちオリゴデンドロサイトとアストロサイト、および軸索が脳卒中にどのように反応し、脳卒中後に修復するかについての特定の研究が可能になります。
以前の報告では、ここで記述されているものと同様のエンドセリン-1(ET-1)6を使用した皮質下白質脳卒中のモデルについて説明しています。実験プロトコルにいくつかの重要な変更が加えられ、それにより、このモデルの潜在的な使用が拡大しました7,8。このプロトコルは、マウスの脳白質内で限局性脳卒中を生じさせるための信頼性と変更可能な戦略を提供します。
このモデルの主な利点は、エンドセリン-1 10を使用したモデルの合併症であった白質の細胞要素に対する既知のパラクリン効果を持たない、化学的な内皮一酸化窒素合成酵素(eNOS)阻害剤N(5)-(1)-イミノエチル-L-オルニチンHCl（L-Nio）9の使用です。さらに、マウスの白質の定位標的化により、あらゆる種類のトランスジェニック株またはノックアウト株の使用が可能になり、脳卒中が脳の白質に及ぼす影響を決定するための利用可能なツールが大幅に拡大します。ここでは、この技術の 2 つのバリエーションについて説明し、脳卒中後の軸索および白質の損傷と修復の理解を深めるために利用できる追加のバリエーションのいくつかを示します。

<table><tbody><tr><td>L-N5-(1-イミノエチル)オルニチン、二塩酸塩</td><td>カルビオケム</td><td>400600-20MG</td><td></td></tr><tr><td>イソフルラン</td><td>フェニックス製薬(株)</td><td>NDC 57319-559-06</td><td></td></tr><tr><td>毛細管</td><td>世界の精密機器</td><td>50-821-807</td><td></td></tr><tr><td>ピコスプリッツァー</td><td>パーカー計装</td><td>ピコスプリッツァーII</td><td></td></tr><tr><td>定位設定</td><td>ケントサイエンティフィック</td><td>KSC51725</td><td></td></tr><tr><td>ピペットプーラー</td><td>KOPF</td><td>モデル720</td><td></td></tr><tr><td>実体顕微鏡 SZ51</td><td>オリンパス</td><td>88-124</td><td></td></tr><tr><td>ファインハサミ</td><td>ファインサイエンティフィックツール</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>鉗子</td><td>ハーバード装置</td><td>PY2 72-8547</td><td></td></tr><tr><td>湾曲鉗子</td><td>ハーバード装置</td><td>PY2 72-8598</td><td></td></tr><tr><td>鈍い解剖ツール</td><td>ファインサイエンティフィックツール</td><td>10066-15</td><td></td></tr><tr><td>ドリル</td><td>ドレメル</td><td>8220-1 / 28</td><td></td></tr><tr><td>ドリルビット</td><td>ファインサイエンティフィックツール</td><td>19007-05</td><td></td></tr><tr><td>ベトボンド</td><td>3M</td><td>1469SB&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Marcaine</td><td>HOSPIRA</td><td>NDC 0409-1610-50</td><td></td></tr><tr><td>Trimethoprim-Sulfamethaxole</td><td>STI Pharmacy</td><td>NDC 54879-007-16</td><td></td></tr><tr><td>Fluororuby</td><td>Fluorochrome Inc</td><td>30 mg</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>Fisher</td><td>O4042-500</td><td></td></tr><tr><td>ショ糖</td><td></td><td>Fisher BP220-10</td><td></td></tr><tr><td>クライオスタット</td><td>ライカ CM3050 S</td><td></td><td></td>14047033518</tr><tr><td>スライドガラスフィ</td><td></td><td>ッシャー12-544-7</td><td></td></tr><tr><td>ファストグリーン&nbsp;</td><td>シグマ</td><td>F7252-5G</td><td></td></tr><tr><td>解剖顕微鏡</td><td>ニコン</td><td>SMZ1500</td><td></td></tr><tr><td>23 G バタフライニードル</td><td>フィッシャー</td><td>14-840-35</td><td></td></tr><tr><td>10x ハンクス バランス塩溶液</td><td>ライフテクノロジー</td><td>14065056</td><td></td></tr><tr><td>1 M HEPES-KOH, pH 7.4</td><td>Affymetrix</td><td>16924</td><td></td></tr><tr><td>D-グルコース</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>重炭酸ナトリウム</td><td>Σ</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>シクロヘキサミド</td><td>Σ</td><td>01810</td><td></td></tr></tbody></table>

軸索変性と白質神経生物学の研究のための皮質下白質ストロークの多彩なマウスモデル

A Versatile Murine Model of Subcortical White Matter Stroke for the Study of Axonal Degeneration and White Matter Neurobiology

ストローク臨床ストロークプレゼンテーションの最大25％を白質アカウントに影響を与え、5〜10倍大きくすることができる速度で静かに発生し、血管性認知症の発展に大きく貢献しています。焦点白質ストロークのいくつかのモデルが存在し、適切なモデルの欠如は、脳卒中のこのタイプの後に損傷応答と修復に関与する神経生物学のメカニズムの理解を妨げています。他の皮質下脳卒中モデルの主な制限は、彼らが限局的に白質に梗塞を制限しないか、主に非マウス種で確認されていることです。これは、白質ストロークの神経生物学を研究するために、マウス研究ツールを幅広く適用する能力を制限します。ここでは、不可逆的なeNOSの阻害剤の局所注射を使用して、マウスの白質における焦点脳卒中の信頼性の高い生産のための方法論を提示します。また、2つのユニークな定位を含む一般的なプロトコルにいくつかのバリエーションを提示しますバリエーション、大幅にこの技術の潜在的な用途を拡大する逆行性神経のトレースだけでなく、新鮮な組織標識および解剖。これらの変化は、脳卒中のこの共通とunderstudied形の神経生物学的効果を分析するための複数のアプローチを可能にします。

提示されたモデルを用いて、白質下地前肢感覚皮質を確実に標的とすることができます。典型的にはヒトラクナ梗塞に見られるように、この化学的に誘発された脳卒中モデルは、焦点軸索およびミエリン損失、星状細胞、および小膠（ 図1）を生成します。 3回の注射を使用することにより、臨床的に有用なモデルは、前肢の運動課題7に早期障害を確立し、脳組織の経験の小さいが重要な部分は、免疫組織化学、免疫蛍光、および生化学的手法を虚血される定量的レベルでの実現可能性と信頼性です。卒中誘導後早期の時点（時間）で、軸索分子の組織の変化は（ 図2）を検出することができます。 7日目に、ストロークが軸索損失（ 図1a）の外接領域に、その成熟を ​​完了します。私たちの手で、この方法は、焦点白質病変を生成approximately800μmの水平直径と脳梁の前後軸に沿って約1ミリメートルを延長します。 7日までに、平均総梗塞サイズはおよそ0.200ミリメ...

ここでは、不可逆的な内皮一酸化窒素合成酵素(eNOS)阻害剤(L-Nio)の局所注射によるマウス白質の病巣性脳卒中の生成方法を紹介します。この技術の潜在的な応用を拡大する2つの定位バリエーション、逆行性ニューロントレーシング、および新鮮な組織の標識と解剖が提示されます。

Stroke affecting white matter accounts for up to 25% of clinical stroke presentations, occurs silently at rates that may be 5-10 fold greater, and ...

本手順の全体的な目的は、マウスの白質内において小さな梗塞部位を正確に特定し、この一般的な皮質下白質梗塞の形態をモデル化することです。この手法は、軸索損傷のメカニズム、皮質下梗塞に対する神経細胞の反応、および梗塞の急性期と修復期の両方における白質の細胞成分の反応など、脳梗塞研究における重要な疑問を解決するのに役立ちます。この技術の主な利点は、白質に梗塞を精密に局在化でき、かつ多種多様なマウスモデルに適用可能である点にあります。一般的に、この手法に不慣れな方は、白質の量が少ないために脳卒中の局在化を誤りやすく、苦労することがあります。マウスの系統ごとに、注入角度や立体定位座標、あるいは立体定位装置の設定を微調整する必要があるかもしれません。まず、引き伸ばしたガラスピペットを真空ラインに接続されたチューブに固定することから始めてください。引き抜いた端をL-Nio溶液、または蛍光トレーサーを加えたL-Nio溶液に浸します。真空ポンプを始動させ、ピペットの直径0.5 mmの部分が少なくとも2 mm充填されるまで吸引します。充填したピペットを脇に置いておきます。次に、マウスを立体定位顕微鏡を備えた立体定位固定装置に設置します。承認された手順に従ってマウスを麻酔し、手術の準備を整えた後、足指をつねって麻酔深度を確認します。反応がないことを確認してください。次に、注入アームを36度に調整します。低容量圧力注入システムの遠位端に、引き伸ばしたガラスピペットホルダーを取り付け、それを注入アームに装着します。頭蓋骨を露出させるために正中線に沿って頭皮を1.5 centimeter切開した後、綿棒で頭蓋骨の表面を拭き取ります。次に、実体顕微鏡下で1〜3倍の倍率に設定し、マイクロポイントツールを使用して、上層にある骨膜組織を除去します。細筆マーカーでブレグマに印を付けます。その後、先端の細い外科用ドリルビットを装着した外科用ドリルを用い、ブレグマから後方を起点とし、正中線のわずか左側の前方へ向かって、2 mmの楕円形の開頭術を行います。大脳皮質が視認できるように、骨片と表面の軟組織を除去します。滅菌生理食塩水を断続的に滴下し、皮質表面を湿らせた状態に保ちます。次に、充填したピペットをインジェクターアームに固定します。ピペットの先端をブレグマに合わせ、ステレオタキシスの座標をゼロに設定します。表1に記載されている前後および内外側の座標に従い、ピペットを最初の注入点まで移動させます。次に、ピペットを皮質表面まで進め、背腹方向の測定値をゼロに設定します。ピペットを背腹座標までゆっくりと下げます。ステレオ顕微鏡の倍率が3倍に設定されており、校正済みのレチクルがはっきりと見えていることを確認してください。気液界面が矢状方向に見えるように、角度をつけたピペットを側面から観察します。メニスカスが、ピペットの内壁と外壁の両方で同じ焦点面に現れている必要があります。次に、20 PSIで20ミリ秒のパルスに設定した局所圧注入システムを用い、100ナノリットルのL-Nioを脳内に注入します。全量を注入した後、ピペットの経路を 통한逆流を防ぐため、5分間待ちます。次に、ピペットを引き抜き、表1に記載されている2番目および3番目の座標セットで注入手順を繰り返します。最後の注入後、ピペットを取り除き、開頭部位を埋めるのに十分な量のボーンワックスを充填します。最後に、頭皮の創傷端を接近させ、皮膚用接着剤で固定します。術後の鎮痛処置後、動物を清潔なケージに入れてください。術後抗生物質を飲料水に混ぜて5日間、あるいは5日未満で安楽死させる場合は安楽死まで投与します。承認された手順に従ってマウスを安楽死させ、頸椎脱臼させた後、滅菌鋏を用いて後頭部から頭蓋骨を開き、スパチュラで上層の頭蓋骨を慎重に取り除きます。次に、滅菌済みの4 mmスパチュラを脳の前方に挿入し、嗅球と視神経を切断します。その後、脳を緩やかに頭蓋骨から取り出し、氷冷した解剖バッファーに入れます。脳ブロックと滅菌済みカミソリブレードを用いて、患部を含む2〜3 mmのスライスを作成し、冷解剖バッファーに入れます。解剖顕微鏡下で、注入した側の半球における運動皮質下の白質を特定します。脳卒中後の早い段階では、fast greenなどの一般的な実験室用色素と混合したL-Nioを注入することで、脳卒中部位を視覚的に特定することが可能です。脳卒中後しばらく時間が経過している場合は、局所的な壊死と髄鞘の蒼白化によってその領域を視覚的に特定できる場合があります。部位を特定後、メスを用いて脳卒中が発生した白質領域を注意深く摘出します。必要に応じて、上層の皮質および下層の線条体を切除してください。ここで示すように、神経フィラメントの免疫蛍光染色（赤色）により、内側アプローチを用いた脳卒中7日後の軸索脱落の程度が示されています。後方角度アプローチを用いて、側脳室の直上の白質梗塞病変を標的としており、IBA-1の免疫ラベル化によって検出される強力なミクログリア反応が認められます。2つのアストロサイト中間フィラメントマーカーであるvimentin（赤色）とglial fibrillary acidic protein（緑色）により、脳梗塞後の白質アストロサイトの形態変化が明らかになります。梗塞誘導時に蛍光デキストランアミンを共注入することで、梗塞により軸索が損傷した個々のニューロンを同定することが可能です。標識の大部分は、脳卒中部位の上層にある一次感覚運動野の第5層および第6層ニューロン内の軸索で認められます。この画像は、脳卒中後7日目の状態を示しています。習熟すれば、適切に実施することでこの手法を45分で完了させることができます。このビデオを視聴することで、マウスにおいて局所的な白質脳卒中を誘発する方法と、脳卒中および神経修復に関する重要な疑問を解明するために有用な、さまざまなダウンストリーム処理に向けた脳の準備方法について、十分に理解することができます。

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このビデオでは、麻酔をかけたマウスに、白質内の標的脳座標に一酸化窒素阻害剤を注入することにより、白質脳卒中を誘発する正確な技術を示しています。これにより、血管が収縮し、血液供給が阻害され、ニューロンの損傷や脳卒中を引き起こします。...

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