癌細胞浸潤への応用による腫瘍間質微小環境の組織工学

次の手順の全体的な目標は、腫瘍細胞の浸潤を評価するための線維芽細胞からネイティブマトリックスを生成することです。これは、まず、ソルビン酸が豊富な培地でプラスチック上に線維芽細胞を成長させ、ネイティブマトリックスを生成することによって達成されます。第2ステップでは、天然マトリックスをプラスチック成長面から剥離して放出し、次にこのマトリックスに腫瘍細胞を播種し、一定期間後に空気液体界面に持ち上げます。

これらの3D培養物は、腫瘍細胞浸潤の組織学的分析のために採取されます。最終的に、腫瘍細胞の浸潤に対する天然の線維芽細胞マトリックスの影響は、免疫組織学的分析によって評価できます。したがって、3D典型培養物を生成するためのこの技術の利点は、我々は、合成または異種1型コラーゲンのような合成または異種基質の不在下で線維芽細胞自体によって産生される天然マトリックスを評価できることである繊維芽細胞培地中の6ウェルプレートにウェルあたり200, 000線維芽細胞を播種することから始め、新たに調製されたIC酸を補充する。

2つのリン酸は、2〜5ミリリットルの新鮮な培地で2〜3日ごとに細胞を補充します。肉眼で見える細胞外マトリックスに埋め込まれた細胞の厚い層は、6週間の終わりに形成されます。使用する細胞によっては、目に見えるマトリックスが遅かれ早かれ形成され、ここで見られるように皿から分離し始める可能性があります。

この層を組織培養プレートから放出するには、1ミリリットルのマイクロピペットチップでマトリックスの周囲を静かにこすり落とし、マトリックスの端をウェルの中心に向かって押します。細胞とネイティブマトリックスはプレート表面から容易に剥離し、メディアに浮遊しているはずです。ネイティブマトリックスをメディア内に広げて、それ自体に折りたたまれないようにします。

ネイティブマトリックスを5日間浮かせてリモデリングし、引張強度と固有のリモデリングにより、2〜3日ごとにメディアを交換し続けます。マトリックスは大幅に収縮し、より小さいがより厚いネイティブマトリックスに縮小され、その時点で利用できるようになります。インベージョンアッセイ用。

インベージョンアッセイ用。まず、鈍い鉗子を使用して、ネイティブマトリックスをナイロンネットに優しく移します。ネットに取り付けたら、1ミリリットルのマイクロピペットチップと鈍い鉗子を使用して、マトリックスをできるだけ平らになるように優しく広げます。

次に、マトリックスごとに1つの滅菌クローンシリンダーの一端に少量のワセリンを塗ります。次に、シリンダーをネイティブマトリックスのワセリン側を下にして配置し、ネイティブマトリックスとクローンリングとの間にしっかりと密閉されるようにします。次に、250, 000個の皮膚扁平上皮癌またはカラットサイト成長培地中のSCC細胞をシリンダーに追加します。

皮膚SCC細胞が天然マトリックスに落ち着いたら、シリンダーを取り外し、ナイロンネットネイティブマトリックスと皮膚SEC細胞を空気液体界面に持ち上げ、曲げたステンレス鋼の金網サポートに取り付けます。最後に、培地レベルが天然マトリックスの底部に触れるまでソルビン酸として添加したケラチノサイト増殖培地を添加し、2〜3日ごとに培地を交換し、皮膚SCC細胞の播種後7日および14日で収穫します。この手法は、異なる3D間質環境下での腫瘍細胞の侵襲性挙動を調査および比較する可能性を開きます。

これらの画像に見られるように、RDEB皮膚SCCケラチノサイトへの浸潤は、C 7で発現する天然マトリックスよりも右のパネルで有意に遅延していました。この技術の開発により、研究者は、線維芽細胞によって産生されるネイティブマトリックスが浸潤などの腫瘍細胞プロセスに与える影響を直接評価できるようになりました。