Name: 癌細胞浸潤への応用による腫瘍間質微小環境の組織工学 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 48 s
Description: 学ぶ 線維芽細胞由来の天然マトリックスを用いた3D培養法で、腫瘍細胞の浸潤挙動を評価する手法。組織学的解析により腫瘍微小環境における細胞間相互作用を詳細に解明できます。

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APSは、デブラ·インターナショナルと英国のスキン財団によってサポートされています。ダンディーパートナーシップ博士号プログラムの大学 - YZNはA * STARはサポートされています。

本研究は、ヘルシンキ原則宣言に従って実施し、適切な倫理委員会によって承認された。 1。培地および試薬の調製<ol><li> L-アスコルビン酸2 - リン酸原液の200倍の調製<ol><li>ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）溶液5mlあたりL-アスコルビン酸2 - リン酸を29mg溶解し、0.22μmのメンブランフィルターを通して濾過する。ストア-20℃の中0.25ミリリットルの滅菌アリコートとして</li><li> Lの0.1 mMの最終濃度のために、必要な日には、線維芽細胞培地（1％L-グルタミンおよび10％ウシ胎児血清を含むDMEM）毎に50mlに200倍のL-アスコルビン酸-2 - リン酸原液0.25mlのアリコートを追加-アスコルビン酸2 - リン酸。 </li></ol></li><li>ケラチノサイト増殖培地の調製<ol><li>原発SCCケラチノサイトの単離および培養は、以前に21に記載されている。ケラチノサイト増殖培地の調製が記載されているそこにも。 </li><li>以下のように簡単に説明すると、メディアを準備します。 300mlのDMEMおよび10％FBSを補充したHamのF-12を100ml 0.4 mg / mlのヒドロコルチゾン 5 mg / mlのインスリン 10 ng / mlのEGF 5 mg / mlのトランスフェリン 8.4 ng / mlのコレラ毒素 13 ng / mlのチロニン 1×ペニシリン - ストレプトマイシン溶液</li></ol></li></ol> 2。L-アスコルビン酸2リン酸添加培地での線維芽細胞由来のネイティブマトリックスのインビトロ建設に <ol><li> L-アスコルビン酸2 -リン酸を補充した線維芽細胞培地中の種子6ウェルプレート中のウェル200,000線維芽細胞（20,000細胞/ cm 2）。メディア2-5 mlで2〜3日ごとに再給。 （注：再給頻度とボリュームは、異なるセルの個々のニーズに合わせて調整することができる「ディスカッション」を参照してください）​​。 </li><li>細胞外マトリックスに埋め込まれた細胞の厚い層は、（肉眼で見える、6週間の終わりに形成する<stroNG&gt;図1）。組織培養プレートから、この層を解放するために、穏やかに1ミリリットルマイクロピペットチップを用いてマトリックスの周囲をこすり、次いでウェルの中心に向かって行列の縁を押してください。この細胞の層とマトリックス（天然のマトリックス）をプレート表面から容易に着脱可能であるべきであり、今媒体中に浮遊する。それはそれ自体の上に折り畳む避けるために、媒体中でのネイティブ行列を広げる。 </li><li>ネイティブ行列フロートを聞かせて2〜3日ごとにメディアを変更し、5日間、改造。による引張強度及びマトリクス内の内因性リモデリングは、マトリックスは急激に収縮し、より小さな、より厚い天然のマトリックスに還元なり、浸潤アッセイのために利用される準備ができているであろう。 </li></ol> 3。腫瘍SCCケラチノサイトと浸潤アッセイ<ol><li>鈍ピンセットでそっとネイティブ行列をピックアップし、ナイロンネットに転送します。一度ナイロンネット上で、1ミリリットルマイクロピペットを用いて可能な限り平坦に位置するように優しく行列を広げる先端と鈍鉗子。 </li><li>一端に無菌ワセリンを少量塗りつけによって無菌クローン性シリンダーを準備します。 </li><li>ワセリン側を下にして、ネイティブのマトリックス上に、クローンシリンダーを配置します。これは、ネイティブの行列と、クローンリング間の緊密なシールを確保することである。 </li><li>クローン性シリンダー（ケラチノサイト増殖培地100μl中250,000細胞）にCSCCセルを追加します。 </li><li> CSCC細胞が本来のマトリックス上に落ち着いたときに6時間後に、クローンシリンダーを取り外します。 </li><li>曲がったステンレス製のワイヤメッシュ支持体上に気液界面へのネイティブ行列とCSCC細胞とナイロンネットを持ち上げます。 </li><li>メディアレベルは、天然のマトリックスの底部に接触するまでのアスコルビン酸を補充したケラチノサイト増殖培地を加える。 </li><li> CSCC細胞の播種後7日および14日に2〜3日ごとに、収穫のメディアを変更します。 </li></ol> 4。 3D培養物の収穫と組織学のための準備<ol><li> 4％のパーで修正室温で一晩aformaldehyde。 </li><li>サンプルを二等分し、切断面が外側に向けた状態で、ホルマリン固定パラフィン包埋ブロックのためのワックスに埋め込む。 </li><li>代わりに、10月に二等分サンプルを埋め込み、スナップ凍結を直ちに液体窒素中で新鮮凍結組織ブロックのために。 </li><li>ミクロトームと脱ワックス（必要な場合）に4μmの切片を切った。標準ヘマトキシリン​​およびエオシンを使用して染色する。 CSCC細胞を可視化するために、ケラチン14に対するマウスモノクローナル抗体（インハウスLL001は）免疫組織染色に使用することができる。 </li></ol>

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</ol>

著者らは、開示することは何もありません。

これにより、実験の性質のために、完了のために必要な総時間は2ヶ月までとすることができる。この時間を通して、細心の注意と、無菌組織培養の実践は、微生物汚染を防止するために使用しなければならない。 脇コラーゲンのヒドロキシプロリンとヒドロキシリシンの合成における補因子としての役割から、アスコルビン酸は、線維芽細胞22のコラーゲン特異的なmRNA発現を刺激する。ここで選択されたアスコルビン酸はより安定なL-アスコルビン酸2 -リン酸23である。再給紙は、週に三回をお勧めしますが、これは常に研究された細胞に依存することになる。週間通過する初期の線維芽細胞培養は、より多くの栄養素を消費して、より大きなメディアボリュームとより頻繁に再給紙が賢明であるかもしれません。それは、変化するメディアやケアはネイティブのマトリックス産生の間に細胞層への障害を最小限に抑えるよう注意する必要があるとき、穏やかなことが重要です。 <p class="...

三次元組織培養における生体材料の使用は、2D接着性プラスチック基板とで要約のものよりインビボ環境により類似の生理学的条件下で、実験室における細胞の挙動を研究する研究者を有効にしている。特に、長足の進歩が前方気液界面1-4における3次元培養法を採用することで重層上皮のモデル化がなされている。このような技術は忠実にケラチノサイトの分化およびこれらのプロセスを研究する研究者のための柔軟性と忠実度を可能にする腫瘍細胞の浸潤を模倣する。間質環境を模倣する生体材料の基板の選択は、主にI型コラーゲン、Engelbreth-Holm-Swarmマウス肉腫行列およびデepidermized真皮の使用を伴っています。例えば、癌関連線維芽細胞が癌の浸潤5に寄与することが示されている、開始、および進行間質上皮相互作用を介して、6,7 WHENこのような基板で栽培。 皮膚内の間質環境を模倣するためのゴールドスタンダードは、このような技術を用いて、最大かつ最も広く研究されている重層上皮は、人間の真皮（DED）を解除epidermizedされるように考えられている。 DEDの調製は、人間の死体皮膚3,4からトリプシン処理または物理的解離を介した表皮の除去を含む。しかしながら、このような皮膚へのアクセスは、医療機関に関連付けられていない研究室のために非常に困難であることができ、病気の真皮を得ることが近くに不可能である。別の方法として、研究室は頻繁にI型コラーゲン（ラット尾から分離）および/またはEngelbreth-Holm-Swarmマウス肉腫マトリックスタイプを組み合わせて使用​​します。 コラーゲンは容易酢酸および塩沈殿を用いて単離することができることNageotte 8 1927年の発見後、組織培養への適用は、その後Huzelによって開拓されたLAや同僚9。コラーゲンコーティングはアマンとをゲイ9によって問い合わせなど29株および組織外植片の細胞培養用のガラスよりも優れていることが判明した。現在、組織培養に用いられるコラーゲンの主要なタイプは、ラット尾の腱から単離され、通常の商業的供給源から購入される。しかし、忠実な基板要約のための欠点は、ラット尾部コラーゲンI型およびIII型コラーゲンは、主要な成分として存在し、単離されたラット尾部コラーゲンは、常に断片化されたヒトコラーゲン、またはヒト真皮、同一ではないということである。 エンゲルブレス-ホルム-スウォームマウス肉腫マトリックスは、培養されたエンゲルブレス-ホルム-スウォームマウス肉腫細胞から分泌される10ゼラチン状のタンパク質混合物である。主要成分は、ラミニン、IV型コラーゲン、ヘパリン硫酸プロテオグリカン、エンタクチンおよびニドゲンであり、これらのタンパク質の正確な比率は、バッチからバッチに変化します。さておき、構造プロからteins、このマトリックスはまた、増殖因子β、上皮成長因子、インスリン様成長因子1、ウシ線維芽細胞成長因子、および細胞挙動11,12を変化させるであろう血小板由来成長因子の形質転換のような成長因子の有意なレベルを含有する。エンゲルブレス-ホルム-スウォームマウス肉腫行列の複雑性の方を向いて、1851のタンパク質の総量は、最近のプロテオミクス研究13で同定された。解釈し、その11を利用して様々な実験を比較するとき、この行列の豊かで複雑 ​​な性質に照らして、十分に注意が知らされていた。 私たちの研究室では、遺伝性皮膚疾患、皮膚扁平上皮癌（CSCC）14を発症する素因を持つ特に強い関心を持っている。 COL7A1遺伝子に劣性栄養障害性表皮水疱症（RDEB）、生殖細胞変異を伴う重度の水疱性疾患の場合<s&gt; 15〜17まで、我々は、これらの患者における皮膚微小環境18を促進する腫瘍であることを決定した。この研究の過程で、我々は、コラーゲン内のI / Engelbreth-Holm-Swarmマウス肉腫行列を組み込み、細胞自身の、ネイティブの行列を評価する方法を検討した皮膚線維芽細胞の性質を促進する腫瘍を評価することができませんでした。これを達成するために、我々はヒト皮膚同等物19,20に取り組んでルーシー·ジェルマンの研究室から以前の手法を変更しました。サンジェルマンの技術は、合成または死体足場がない状態で初代ヒトケラチノサイトおよび線維芽細胞培養を用いてよく組織基底膜をヒトの皮膚を再構築することができました。 本研究では、皮膚の腫瘍間質微小環境（ネイティブ行列）反復するために使用する手順は、in vitroでの一次間質性線維芽細胞に直接由来は18に記載されている。ネイティブの行列をP線維芽細胞の長期培養によりroducedはCSCC細胞浸潤についてアッセイするために真皮同等物として使用した。私たちは、RDEB線維芽細胞（VII型コラーゲン（C7）が欠損した）が分泌する細胞外マトリックスのいずれかから、またはレトロウイルス腫瘍上の単一のコラーゲンの絶大な効果を構築し、実証する表現VII型コラーゲンを用いて形質導入RDEB線維芽細胞から誘導されたネイティブの行列を使用してデータを提示細胞浸潤。

<table><tbody><tr><td>L-アスコルビン酸 2-リン酸</td><td>Sigma</td><td>A8960</td><td></td></tr><tr><td>DMEM と L-グルタミン、4,500 mg/L D-グルコース、110 mg/L ピルビン酸ナトリウム</td><td>Life Technologies</td><td>11995-073</td><td></td></tr><tr><td>100x ペニシリン-ストレプトマイシン</td><td>Life Technologies</td><td>15070</td><td></td></tr><tr><td>ワセリン</td><td>VWR</td><td>PROL28908.290</td><td></td></tr><tr><td>クローナル シリンダー</td><td>Sigma</td><td>Z370789</td><td></td></tr><tr><td>ナイロンネットフィルターディスク親水性100 &#956;メートル25 &#956;m直径100 / pk</td><td>ミリポア</td><td>NY1H02500</td><td></td></tr><tr><td>曲がったステンレス鋼の金網サポート</td><td></td><td></td>自家製<td>寸法メッシュメッシュは、メッシュが6ウェルプレートに収まるように作られました</td></tr></tbody></table>

癌細胞浸潤への応用による腫瘍間質微小環境の組織工学

Tissue Engineering of Tumor Stromal Microenvironment with Application to Cancer Cell Invasion

間葉系細胞が埋め込まれたマトリクス上の上皮細胞の3次元器官型培養物は、広く上皮細胞分化および浸潤を研究するために使用される。 Engelbreth-Holm-Swarmマウス肉腫細胞由来のラット尾I型コラーゲンおよび/またはマトリックスは、伝統的に、間葉細胞（通常、線維芽細胞）が移入されその中にマトリックスまたは間質微小環境をモデル化するために基板として用いられてきた。このようなマトリックスを用いた実験は非常に有益ですが、それはその原因なマウス由来の行列のように、単一のタンパク質（たとえば、I型コラーゲンのように）か、基底膜成分と成長因子の含有量が高い（最優先の存在に主張することができます肉腫細胞）、これらの基板は、最高の間質細胞自身によって行われたマトリックス組成への貢献度を反映していない。腫瘍を起こしやすい、遺伝水疱性障害（劣性ジストロフィーの患者から単離された初代皮膚線維芽細胞によって産生さネイティブ行列を研究するために、表皮水疱症）、我々は、腫瘍細胞の浸潤を研究するために、既存のネイティブ行列プロトコルを適応している。線維芽細胞は、培養中の長期間独自のマトリックスを産生するように誘導される。この天然のマトリックスは次いで、培養皿から剥離され、全体の共培養は、空気 - 液体界面まで上昇させる前に、上皮細胞はその上に播種する。細胞分化および/または浸潤、次いで経時的に評価することができる。この技術は、唯一の欠点は、天然のマトリックスを生成するために必要な長期間である、合成または外来マトリックスを必要とせずに、3次元設定における上皮 - 間葉細胞の相互作用を評価する能力を提供する。ここでは、腫瘍細胞浸潤を阻害するために、VII型コラーゲン、線維芽細胞によって発現される単一分子の能力を評価するためにこの技術の適用を記載している。

<html>この技術は、異なる次元間質環境下で腫瘍細胞（この場合はCSCC）の侵襲的挙動を調べ、比較する可能性を開く。この技術を使用して、RDEBの皮膚環境をで要約C7-欠損ネイティブ行列だけではなく、生成するだけでなく、遺伝的に過剰発現するC 7 18ように操作された追加的な行列することができます。 図2に見られるように、CSCC RDEBケラチノサイトの浸潤は、C7-欠損RDEB対照と比較して過剰発現するC7-ネイティブマトリックス中に有意に遅らせた。この侵攻は、ゲルは、固定パラフィンブロックに包埋した後、切断して免疫染色した標準的な組織学的な方法を介して可視化される。染色のために使用することが示唆抗体がCSCC細胞と線維芽細胞のための抗ビメンチン（V9）のための抗ケラチン14（LL001）である。 p_upload/51321/51321fig1highres.jpg &quot;幅=&quot; 500 &quot;/&gt; <...

組織操作された線維芽細胞由来の天然のマトリックスは、上皮細胞の増殖および分化を支持する間質基質を生成するための新興のツールである。ここでは、腫瘍細胞の生物学上の異なる間質細胞タイプの影響を評価するためにこの方法を適用するプロトコルが提示される。

3D organotypic cultures of epithelial cells on a matrix embedded with mesenchymal cells are widely used to study epithelial cell differentiation and ...

本手順の目的は、腫瘍細胞の浸潤を評価するために、線維芽細胞から天然マトリックスを作製することである。まず、ソルビン酸を添加した培地を用いてプラスチック上で線維芽細胞を培養し、天然マトリックスを形成させる。次に、この天然マトリックスをプラスチックの培養面から剥離・回収し、腫瘍細胞を播種した後、一定時間を経て気液界面まで上昇させる。これらの3D培養物は、腫瘍細胞浸潤の組織学的解析のために回収されます。最終的に、天然の線維芽細胞マトリックスが腫瘍細胞浸潤に及ぼす影響を免疫組織学的解析によって評価することができます。したがって、この手法を用いて3D典型的培養物を生成することの利点は、異種由来のI型コラーゲンなどの合成基質や外来基質が存在しない状態で、線維芽細胞自体によって産生された天然マトリックスを評価できる点にあります。まず、新鮮に調製したアスコルビン酸を添加した線維芽細胞用培地を用い、6ウェルプレートの1ウェルあたり200,000個の線維芽細胞を播種することから始めてください。2〜3日ごとに、2〜5 mLの新鮮な培地で細胞を再リン酸化します。6週間後には、肉眼で確認できる細胞外マトリックスに埋め込まれた厚い細胞層が形成されます。使用する細胞によって、可視的なマトリックスが形成される時期は早まったり遅れたりすることがあり、ここで見られるようにディッシュから剥離し始める場合があります。この層を組織培養プレートから剥離させるため、1 mLマイクロピペットチップを用いてマトリックスの周囲をそっと掻き出し、次にマトリックスの端をウェルの中心に向かって押し込みます。細胞と天然マトリックスはプレート表面から容易に剥離し、培地中に浮遊します。天然マトリックスが内側に折りたたまれるのを防ぐため、培地の中で広げてください。天然のマトリックスを5日間浮遊させ、再構築させます。引張強度と内在的な再構築が起こるため、2〜3日ごとに培地交換を継続してください。マトリックスは劇的に収縮し、サイズは小さくなりますが厚みのある天然マトリックスとなり、この時点で浸潤アッセイに使用可能な状態になります。浸潤アッセイの手順です。まず、鈍端鉗子を用いて、天然マトリックスをナイロンネット上にそっと転移させます。ネットに配置した後、1 mLマイクロピペットチップと鈍端鉗子を使用して、マトリックスをできるだけ平らに広げます。次に、マトリックス1つにつき、滅菌済みクローナルシリンダー1本の端に少量のワセリンを塗布します。その後、ネイティブマトリックスとクローナルリングの間を密閉するため、シリンダーのワセリンを塗った面を下にしてネイティブマトリックス上に配置します。ここで、carat site growth mediaで調製した250,000個の皮膚扁平上皮癌（SCC）細胞をシリンダーに加えます。皮膚SCC細胞が天然マトリックス上に定着した後、シリンダーを取り除き、ナイロンネット天然マトリックスと皮膚SEC細胞を気液界面まで持ち上げ、曲げたステンレス製のワイヤーメッシュサポートの上に載せます。最後に、ソルビン酸を添加した角化細胞増殖培地を、培地レベルが天然マトリックスの底に触れるまで加えます。培地は2～3日ごとに交換し、皮膚SCC細胞の播種後7日および14日に回収します。この手法により、異なる3Dストローマ環境における腫瘍細胞の浸潤挙動の検討および比較が可能になります。これらの画像に見られるように、右パネルのネイティブマトリックスを過剰発現させたC7細胞では、左パネルのC7欠損RDEBコントロールと比較して、RDEB皮膚SCC角化細胞の浸潤が著しく抑制されました。この手法の開発により、線維芽細胞によって産生されるネイティブマトリックスが、浸潤などの腫瘍細胞のプロセスに及ぼす影響を直接評価することが可能になりました。

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

簡単な方法は、関連付けられている上皮細胞上の組織線維芽細胞に及ぼす影響を分析するために記述されています。このメソッドは、三次元組織培養の組み合わせにより、3Dから分離後の細胞の分析を容易にすることができます。技術は、腫瘍細胞上の腫瘍関連間質の効果の系統的な研究を可能にする、悪性度を変化させるセルに適用されます。...

三次元混合細胞スフェロイド共培養から乳腺上皮細胞の分離

間質液の流れが固形腫瘍で上昇し、腫瘍細胞の浸潤を調節することができる。ここでは、マトリックス中に埋め込まれた細胞に間質液の流れを適用し、細胞浸潤に及ぼす影響を測定する手法を説明します。このテクニックは簡単に他のシステムを研究するために適応させることができます。...

腫瘍細胞の浸潤を間質液流れに及ぼす影響を測定するための三次元細胞培養モデル

このビデオでは、腫瘍細胞の浸潤を研究するためにネイティブマトリックスを利用する技術について説明しています。このアッセイで使用される技術は、合成マトリックスや外来マトリックスを必要とせずに、3D設定で上皮-間葉系細胞の相互作用を評価する能力を提供します。...

腫瘍細胞浸潤アッセイ:上皮間葉系細胞の相互作用を評価するための3D In Vitroネイティブマトリックスベースの方法

試験系として、ヒトの3D腫瘍組織を作成するための方法が記載されている。これらの技術は、脱細胞化生体血管柄足場（BioVaSc）、初代ヒト細胞およびフローバイオリアクターにおける動的条件下で、ならびに、静的条件下で培養することができる腫瘍細胞株に基づいている。...

人間の3次元の組織工学<em&gt; in vitroで</em&gt;腫瘍テストシステム

ここでは、多細胞相互作用やがん細胞の挙動の細胞外マトリックス依存性調節を調査するのに役立つ、3次元での共培養のプロトコールを紹介します。この実験モデルでは、ヒトのがん関連線維芽細胞を包埋したコラーゲンゲル上でがん細胞を培養します。...

腫瘍間質相互作用のための三次元共培養モデル

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3Dの設定で侵略を評価するために、癌細胞スフェロイドアッセイ

私たちは、腫瘍微小環境（TME）を模倣するために透過性の微多孔質膜インサートを適応させました。このモデルは混合細胞培養で構成されており、蛍光標識や細胞選別を使用せずに、高度に濃縮された個々の細胞集団の簡易な生成を可能にし、正常またはストレス条件下でTME内の細胞間コミュニケーションを研究することができます。...

濃縮細胞集団を生成し、細胞間コミュニケーションを調べるための簡単​​な方法：腫瘍微小環境のミミック

このプロトコルの目的は、免疫蛍光、転写などの異なる分析システムで対処することができる腫瘍バルク状環境における癌関連線維芽細胞(CAF)の分化を研究するために、インビトロモデルで3Dを確立することです。分析および生命細胞のイメージ投射。...

がん関連線維芽細胞分化とインビトロ研究における侵入のためのより生理学的システムとしての3Dスフェロイドモデル

提示されたアプローチは、3DスフェロイドアッセイおよびT細胞細胞毒性における癌細胞浸潤を同時に評価する。スフェロイドは、足場のないアガロースマルチマイクロウェルキャストで生成されます。I型コラーゲンマトリックスにおける共培養および埋め込みは、同じ装置内で行われ、癌細胞浸潤およびT細胞媒介性細胞傷害をモニタリングすることができる。...

3D培養におけるがん細胞浸潤とT細胞毒性のモニタリング

がんの転移を研究するためには、ヘテロセルのクロストークを捉える3Dがんモデルが急務となっています。私たちの研究は、侵入と細胞空間分布の研究に使用できる足場および足場のない環境でのヘテロ多細胞間質-上皮の生成を示しています。...

上皮癌細胞のスキャフォールドフリー3D培養におけるヘテロ多細胞間質細胞による浸潤の促進

学ぶ 線維芽細胞由来の天然マトリックスを用いた3D培養法で、腫瘍細胞の浸潤挙動を評価する手法。組織学的解析により腫瘍微小環境における細胞間相互作用を詳細に解明できます。

癌細胞浸潤への応用による腫瘍間質微小環境の組織工学

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