癌細胞浸潤への応用による腫瘍間質微小環境の組織工学
March 18th, 2014
組織操作された線維芽細胞由来の天然のマトリックスは、上皮細胞の増殖および分化を支持する間質基質を生成するための新興のツールである。ここでは、腫瘍細胞の生物学上の異なる間質細胞タイプの影響を評価するためにこの方法を適用するプロトコルが提示される。
次の手順の全体的な目標は、腫瘍細胞の浸潤を評価するための線維芽細胞からネイティブマトリックスを生成することです。これは、まず、ソルビン酸が豊富な培地でプラスチック上に線維芽細胞を成長させ、ネイティブマトリックスを生成することによって達成されます。第2ステップでは、天然マトリックスをプラスチック成長面から剥離して放出し、次にこのマトリックスに腫瘍細胞を播種し、一定期間後に空気液体界面に持ち上げます。
これらの3D培養物は、腫瘍細胞浸潤の組織学的分析のために採取されます。最終的に、腫瘍細胞の浸潤に対する天然の線維芽細胞マトリックスの影響は、免疫組織学的分析によって評価できます。したがって、3D典型培養物を生成するためのこの技術の利点は、我々は、合成または異種1型コラーゲンのような合成または異種基質の不在下で線維芽細胞自体によって産生される天然マトリックスを評価できることである繊維芽細胞培地中の6ウェルプレートにウェルあたり200, 000線維芽細胞を播種することから始め、新たに調製されたIC酸を補充する。
2つのリン酸は、2〜5ミリリットルの新鮮な培地で2〜3日ごとに細胞を補充します。肉眼で見える細胞外マトリックスに埋め込まれた細胞の厚い層は、6週間の終わりに形成されます。使用する細胞によっては、目に見えるマトリックスが遅かれ早かれ形成され、ここで見られるように皿から分離し始める可能性があります。
この層を組織培養プレートから放出するには、1ミリリットルのマイクロピペットチップでマトリックスの周囲を静かにこすり落とし、マトリックスの端をウェルの中心に向かって押します。細胞とネイティブマトリックスはプレート表面から容易に剥離し、メディアに浮遊しているはずです。ネイティブマトリックスをメディア内に広げて、それ自体に折りたたまれないようにします。
ネイティブマトリックスを5日間浮かせてリモデリングし、引張強度と固有のリモデリングにより、2〜3日ごとにメディアを交換し続けます。マトリックスは大幅に収縮し、より小さいがより厚いネイティブマトリックスに縮小され、その時点で利用できるようになります。インベージョンアッセイ用。
インベージョンアッセイ用。まず、鈍い鉗子を使用して、ネイティブマトリックスをナイロンネットに優しく移します。ネットに取り付けたら、1ミリリットルのマイクロピペットチップと鈍い鉗子を使用して、マトリックスをできるだけ平らになるように優しく広げます。
次に、マトリックスごとに1つの滅菌クローンシリンダーの一端に少量のワセリンを塗ります。次に、シリンダーをネイティブマトリックスのワセリン側を下にして配置し、ネイティブマトリックスとクローンリングとの間にしっかりと密閉されるようにします。次に、250, 000個の皮膚扁平上皮癌またはカラットサイト成長培地中のSCC細胞をシリンダーに追加します。
皮膚SCC細胞が天然マトリックスに落ち着いたら、シリンダーを取り外し、ナイロンネットネイティブマトリックスと皮膚SEC細胞を空気液体界面に持ち上げ、曲げたステンレス鋼の金網サポートに取り付けます。最後に、培地レベルが天然マトリックスの底部に触れるまでソルビン酸として添加したケラチノサイト増殖培地を添加し、2〜3日ごとに培地を交換し、皮膚SCC細胞の播種後7日および14日で収穫します。この手法は、異なる3D間質環境下での腫瘍細胞の侵襲性挙動を調査および比較する可能性を開きます。
これらの画像に見られるように、RDEB皮膚SCCケラチノサイトへの浸潤は、C 7で発現する天然マトリックスよりも右のパネルで有意に遅延していました。この技術の開発により、研究者は、線維芽細胞によって産生されるネイティブマトリックスが浸潤などの腫瘍細胞プロセスに与える影響を直接評価できるようになりました。
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概要
この記事では、線維芽細胞から腫瘍細胞の浸潤を研究するためのネイティブマトリックスを生成するためのプロトコルを提示します。この方法論により、異なる間質細胞タイプが腫瘍細胞の生物学に与える影響を評価することができます。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 組織工学
- 細胞生物学
- 腫瘍学
背景
- 線維芽細胞由来のマトリックスは、細胞成長のための自然な環境を提供します。
- 腫瘍細胞の浸潤を理解することは、がん研究にとって重要です。
- 3D培養は、2D培養よりも生体内条件を正確に模倣することができます。
- ネイティブマトリックスは、合成基質の複雑さを避けます。
研究の目的
- 線維芽細胞由来のネイティブマトリックスを生成すること。
- このマトリックスが腫瘍細胞の挙動に与える影響を評価すること。
- 腫瘍-間質相互作用についての理解を深めること。
使用される方法
- 線維芽細胞は、ソルビン酸が豊富な培地で培養されます。
- ネイティブマトリックスをプラスチック表面から剥離します。
- 腫瘍細胞をマトリックスに播種します。
- 3D培養を組織学的に分析して腫瘍浸潤を評価します。
主な結果
- ネイティブマトリックスは腫瘍細胞の増殖をサポートします。
- 組織学的分析により、腫瘍浸潤パターンについての洞察が得られます。
- 異なる間質細胞タイプが腫瘍細胞の挙動に影響を与えます。
- この方法は、研究により生理学的に関連性の高いモデルを提供します。
結論
- 線維芽細胞由来のマトリックスは、がん研究の貴重なツールです。
- それは腫瘍微小環境の理解を深めます。
- このアプローチは、より良い治療戦略につながる可能性があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
This technique enables direct assessment of fibroblast-derived extracellular matrix on tumor cell invasion, providing a physiologically relevant model for stromal-tumor interactions. By eliminating synthetic substrates, it improves predictive confidence in preclinical target validation and mechanistic de-risking of stroma-modulating therapies. The approach supports early discovery workflows focused on stromal contribution to cancer progression.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of stromal-derived matrix components in tumor invasion assays.
- Operational Value: Provides a human-relevant 3D culture system to de-risk stromal targets.
- Scientific Value: Supports functional validation of stromal molecules like type VII collagen in modulating tumor behavior.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized native matrices for reproducible tumor cell invasion readouts.
- Operational Value: Enables quantitative histological assessment of invasion depth and pattern over time.
- Scientific Value: Facilitates comparison of invasion across genetically defined stromal conditions.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Models human tumor-stroma continuity using patient-derived fibroblasts.
- Operational Value: Supports longitudinal invasion analysis at 7 and 14 days post-seeding.
- Scientific Value: Links stromal matrix composition to invasive phenotype in squamous cell carcinoma.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from stromal target identification to functional validation in 3D invasion assays, informing lead selection for stroma-modulating agents.
- Discovery Biology: Tests hypotheses about stromal matrix influence on epithelial invasion pathways.
- Screening: Delivers invasion assays with standardized, fibroblast-generated matrices for compound or genetic screening.
- Analytics: Provides histological endpoints for quantifying invasion under defined stromal conditions.
- Translational Research: Uses patient-derived fibroblasts to model disease-relevant stromal contributions.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for stromal biology across tumor types.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by isolating stromal matrix effects from exogenous substrates.
- Operational Value: Enables standardized matrix production and assay setup across laboratories.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by revealing stromal dependencies in tumor invasion.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of stroma-targeted candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary fibroblast culture and 3D tissue engineering.
- Depends on long-term culture (up to six weeks) for native matrix deposition.
- Necessitates sterile handling for matrix detachment, tumor cell seeding, and air-liquid interface culture.
- Involves histological processing and imaging for invasion analysis.
- Limited by the extended timeline for matrix maturation, affecting throughput.
