癌細胞浸潤への応用による腫瘍間質微小環境の組織工学

本手順の目的は、腫瘍細胞の浸潤を評価するために、線維芽細胞から天然マトリックスを作製することである。まず、ソルビン酸を添加した培地を用いてプラスチック上で線維芽細胞を培養し、天然マトリックスを形成させる。次に、この天然マトリックスをプラスチックの培養面から剥離・回収し、腫瘍細胞を播種した後、一定時間を経て気液界面まで上昇させる。

これらの3D培養物は、腫瘍細胞浸潤の組織学的解析のために回収されます。最終的に、天然の線維芽細胞マトリックスが腫瘍細胞浸潤に及ぼす影響を免疫組織学的解析によって評価することができます。したがって、この手法を用いて3D典型的培養物を生成することの利点は、異種由来のI型コラーゲンなどの合成基質や外来基質が存在しない状態で、線維芽細胞自体によって産生された天然マトリックスを評価できる点にあります。まず、新鮮に調製したアスコルビン酸を添加した線維芽細胞用培地を用い、6ウェルプレートの1ウェルあたり200,000個の線維芽細胞を播種することから始めてください。

2〜3日ごとに、2〜5 mLの新鮮な培地で細胞を再リン酸化します。6週間後には、肉眼で確認できる細胞外マトリックスに埋め込まれた厚い細胞層が形成されます。使用する細胞によって、可視的なマトリックスが形成される時期は早まったり遅れたりすることがあり、ここで見られるようにディッシュから剥離し始める場合があります。

この層を組織培養プレートから剥離させるため、1 mLマイクロピペットチップを用いてマトリックスの周囲をそっと掻き出し、次にマトリックスの端をウェルの中心に向かって押し込みます。細胞と天然マトリックスはプレート表面から容易に剥離し、培地中に浮遊します。天然マトリックスが内側に折りたたまれるのを防ぐため、培地の中で広げてください。

天然のマトリックスを5日間浮遊させ、再構築させます。引張強度と内在的な再構築が起こるため、2〜3日ごとに培地交換を継続してください。マトリックスは劇的に収縮し、サイズは小さくなりますが厚みのある天然マトリックスとなり、この時点で浸潤アッセイに使用可能な状態になります。

浸潤アッセイの手順です。まず、鈍端鉗子を用いて、天然マトリックスをナイロンネット上にそっと転移させます。ネットに配置した後、1 mLマイクロピペットチップと鈍端鉗子を使用して、マトリックスをできるだけ平らに広げます。

次に、マトリックス1つにつき、滅菌済みクローナルシリンダー1本の端に少量のワセリンを塗布します。その後、ネイティブマトリックスとクローナルリングの間を密閉するため、シリンダーのワセリンを塗った面を下にしてネイティブマトリックス上に配置します。ここで、carat site growth mediaで調製した250,000個の皮膚扁平上皮癌（SCC）細胞をシリンダーに加えます。

皮膚SCC細胞が天然マトリックス上に定着した後、シリンダーを取り除き、ナイロンネット天然マトリックスと皮膚SEC細胞を気液界面まで持ち上げ、曲げたステンレス製のワイヤーメッシュサポートの上に載せます。最後に、ソルビン酸を添加した角化細胞増殖培地を、培地レベルが天然マトリックスの底に触れるまで加えます。培地は2～3日ごとに交換し、皮膚SCC細胞の播種後7日および14日に回収します。この手法により、異なる3Dストローマ環境における腫瘍細胞の浸潤挙動の検討および比較が可能になります。

これらの画像に見られるように、右パネルのネイティブマトリックスを過剰発現させたC7細胞では、左パネルのC7欠損RDEBコントロールと比較して、RDEB皮膚SCC角化細胞の浸潤が著しく抑制されました。この手法の開発により、線維芽細胞によって産生されるネイティブマトリックスが、浸潤などの腫瘍細胞のプロセスに及ぼす影響を直接評価することが可能になりました。