Name: 濃縮細胞集団を生成し、細胞間コミュニケーションを調べるための簡単な方法：腫瘍微小環境のミミック (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-20T08:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: 学ぶ 腫瘍微小環境を模倣するin vitro共培養モデルで、細胞集団を濃縮し細胞間コミュニケーションを調べる方法。蛍光標識や細胞分選を用いずに高純度の細胞集団を取得でき、がん関連線維芽細胞の生成や治療薬応答の研究に有用です。

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この研究は、ニュージャージー州がん研究委員会（Pre-Doctoral Fellowship DFHS13PPCO17)、国立衛生研究所（CA049062）、および米国航空宇宙局（NNX15AD62G）からの助成金によって支援されました。

著者は、彼らは、競合や利害の対立がないことを宣言します。

ここで説明するプロトコルは、透過性の微多孔膜インサートが異細胞の共培養物から高度に濃縮された個々の細胞集団を生成するために利用する、単純なインビトロ手順の適合（ 図1）です。重要なことは、このモデルは細胞間コミュニケーションの様々なモードを調査するのに適しています。重要なステップは、上面側の第2の細胞集団を播種し、50％FBSを補充した培地中でインサートの下側​​の第1の細胞集団を播種し、特定の実験的な関心（複数可）に適切な細孔サイズのインサートを選択することを含みます挿入、および時間の適切な期間のための2つの異なる細胞集団の共培養。我々は、主要な開発に対処しており、従って、分子表現型を理解するための大きな機会を提供し、および潜在変化が早いTME進化中に発生する、このシステムは、インビボでの種々の特性を模倣することが可能であることを示し多くの確立されたTME のin vitroモデルのisadvantage（ 図2）。 モデルは、簡単に、癌間質...

腫瘍微小環境（TME）が共存するとホスト間質と一緒に進化する癌細胞で構成される非常に複雑なシステムです。この間質成分は、典型的には、線維芽細胞、筋線維芽細胞、内皮細胞、様々な免疫成分、ならびに細胞外マトリックス1で構成されています。重要な構成要素、この間質の、しばしば大部分は、活性化された線維芽細胞は、しばしば癌関連線維芽細胞または癌関連線維芽細胞（CAF）2,3と呼ばれています。通常、非活性化線維芽細胞とは異なり、CAFSは、乳房、前立腺、肺、膵臓、皮膚、結腸、食道癌などの多種多様な、腫瘍の開始、進行、血管新生、浸潤、転移、および再発4-11に寄与し、そして5,6,12-17卵巣。しかし、がんの病因全体でCAFSの寄与の正確な性質は、定義が不十分のまま。さらに、臨床的証拠は、CAFSの予後値を実証してきました、高品位の悪性疾患、治療の失敗、および全体的な予後不良10,18,19にその存在を関連付けます。 明らかに、CAF開発の開始イベントと同様に、TME内での役割を媒介する細胞間コミュニケーションの我々の理解を高め、患者の転帰を改善することができるエキサイティングな新しい治療標的と強化戦略を提供することができます。この目標に向かって、in vivoおよびin vitroモデルにおけるいくつかが開発されています。 in vivoでのアプローチで患者のTMEをより反映しているが、それらは腫瘍内との間の両方の巨大な複雑さと不均一性などの制限を、持っています。さらに、ヒト被験者からの腫瘍サンプルは、しばしば高度に発達したTMEを表し、TME開始イベントの理解を許可していません。実験動物研究は、しかし、ヒトへの動物のデータの一般化が原因でphysiの違いに注意して行う必要があります、いくつかの利点を提供しますこのような齧歯類（ 例えば、チオール化学20、 ​​代謝率21 などのストレス22、に対する耐性）などの人間と動物の間に学問。また、自然の中で遺伝的に不均質である人間集団とは異なり、実験動物は、一般的に均一になるまで飼育されています。また、一過性の生理的変動および細胞表現型の変化を調べるために、ならびにげっ歯類などの動物を使用して、特定の実験パラメータを制御することがしばしば困難です。したがって、 インビトロ 2-および3次元（2Dおよび3D）組織培養モデルで頻繁TME開発の基本的な理解を進めるために利用されます。 インビボでのシステムの複雑さの正確な描写の欠如にもかかわらず、これらのモデルは、非常に機械的調査を容易にする利点を提供する。 インビトロモデルは、TMEのより単純化着目し、費用対効果の分析のために、それによって統計学的に有意な可能データを、生成することができます動物で起こる全身ばらつきのない細胞。 インビトロ系のいくつかの種類があります。 2つの最も一般的に使用TME in vitroモデルは、混合単層又はスフェロイド細胞培養物で構成されています。両方の培養方法は、細胞間の相互作用の基本的な研究（腫瘍細胞と、例えば、正常細胞）および種々のTME特定の細胞表現型の変化（正常線維芽細胞からの癌関連線維芽細胞の、例えば 、出現）の分析のために有利です。加えて、スフェロイドはTMEをより反映組織様構造を作成することができ、腫瘍異質23を表すことができます。しかし、スフェロイドは、多くの場合、実験の結論24を複雑にする可能性がある層全体で幅広く変化する酸素張力勾配を作り出します。残念ながら、両方のモデルは非常に共同以下のさらなる特性評価および研究のために純粋な細胞集団を分離する能力が制限されています文化。これを行うには、蛍光タグ付きまたは特定メーカーで標識するために少なくとも1つの細胞型を必要とし、その後、細胞集団を分離するために仕分け広範な処理し、細胞に混合共培養を施すことになります。セルソーターではなく、純粋な細胞集団を単離することができるが、1は、細胞ストレスと潜在的な微生物汚染25を危険を認識しなければなりません。 細胞間コミュニケーションの理解を容易にするため、多大な努力を開発し、簡単なアプローチを可能にしながら密接に、 生体内環境を模倣するインビトロシステムに最適化に向けて専念してきました。そのようなツールの一つは、透過性の微多孔性インサート、最初の1953年に26を開発し、その後、多様なアプリケーションとの研究（ 例えば 、細胞極性27、エンドサイトーシス28、薬物輸送29、組織モデリング30に適合された膜基材、FERTですilization 31、バイスタンダー効果32,33、 など ）。このシステムは、34,35、インビボマーカーの インビボ様の解剖学的および機能的分化、ならびに多くの発現を有する細胞の増殖を可能にするときに不浸透性のプラスチック容器で培養観察されません。また、非常に薄い多孔質膜（厚さ10μm）は、 生体内環境をシミュレートし、両方の頂端および側底細胞ドメインで独立した細胞機能を可能にする分子と平衡時間の急速な普及を可能にします。 TMEシステムなどの挿入物の有用性のさらなる利点は、膜の孔を通って細胞間コミュニケーションの様々なモードを維持しながら、同じ環境条件で膜の両側に成長させた2異型細胞集団の物理的な分離です。物理的に分離されているが、2つの細胞集団は、代謝的にデとして、分泌された要素を介して結合され、また、ギャップジャンクショ​​ンチャネルを介して、ここにスクライビング。さらに、in vivoでの部分的な酸素分圧（PO 2）で挿入を維持することによって、モデルは、他のシステムで観察された酸素と化学的勾配の合併症を減らすことができます。むしろ、それはTMEを制御する自然のメカニズムの理解を向上させます。注目すべきことに、2つの細胞集団を容易に共培養の長期間以下の蛍光タグ付けおよび/または細胞選別せずに、高純度で単離することができます。 ここでは、膜の孔を通って連続的な双方向通信ではまだヒト乳癌細胞透過性微孔質膜インサートの両側に、それぞれ、成長したヒト線維芽細胞からなるインビトロ TMEプロトコルを説明するが、。我々は、開発に異なる孔径を有する膜を使用することによって、細胞間コミュニケーションの特定のタイプの寄与（ 例えば 、ギャップ結合対因子を分泌した）ことを示していますTMEの調査することができます。

<table><tbody><tr><td>For Cell Culture</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AG01522 (すなわち, AG1522) ヒト二倍体線維芽細胞</td><td>Coriell</td><td>107661</td><td>Passage 8-13</td></tr><tr><td>MDA-MB-231-luc-D3H1 乳房腺癌細胞株</td><td>PerkinElmer</td><td>119261</td><td>親株: ATCC (#HTB-26)</td></tr><tr><td>MDA-MB-231/GFP 乳房腺癌細胞株</td><td>Cell Biolabs</td><td>AKR-201</td><td></td></tr><tr><td>Eagle's minimal essential medium (MEM)</td><td>Corning Cellgro</td><td>15-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清 (FBS)、認定</td><td>Sigma</td><td>F6178-500mL</td><td></td></tr><tr><td>Corning グルタグロサプリメント (200 mM L-アラニル-L-グルタミン)</td><td>Corning Cellgro</td><td>25-015-Cl</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリンストレプトマイシン溶液、100x</td><td>Corning Cellgro</td><td>30-002-Cl</td><td></td></tr><tr><td>トランズウェルインサート (すなわち、透過性微多孔質メンブレンインサート) (0.4 &mu;m pore)</td><td>Costar</td><td>3450</td><td></td></tr><tr><td>トランズウェルインサート (すなわち、透過性微多孔質膜インサート) (1 &mu;m pore)</td><td>Greiner bio-one</td><td>657610</td><td></td></tr><tr><td>トランズウェルインサート (すなわち、透過性微多孔質膜インサート) (3 &mu;</td><td>Costar</td><td>3452</td><td></td></tr><tr><td>6-well Culture</td><td>Plate Greiner Bio-One Cellstar</td><td>657160-01</td><td></td></tr><tr><td>75 cm2 細胞培養フラスコ</td><td>CellStar</td><td>658 170</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS), 1x</td><td>Corning Cellgro</td><td>21-040-CV</td><td>カルシウム & マグネシウムなし</td></tr><tr><td>0.25% (vol/vol) トリプシン, 2.21 mM EDTA, 1x</td><td>Corning Cellgro</td><td>25-053-CL</td><td></td></tr><tr><td>15 ml 遠心分離チューブ</td><td>CellTreat</td><td>229411</td><td></td></tr><tr><td>35 mm x 10 mm Cell Culture Dish</td><td>Greiner bio-one</td><td>627 160</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>企業名</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</strong</td></tr><tr><td>>免疫蛍光顕微鏡用</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-Caveolin 1</td><td>BD Transduction Laboratories</td><td>610406</td><td>In situ 免疫蛍光 - 1:5,000</td></tr><tr><td>ヤギ抗マウスIgG(H+L)二次抗体、Alexa Fluor 488 コンジュゲート</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11029</td><td>In situ 免疫蛍光 - 1:2,000</td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン - フラクション V</td><td>Rockland</td><td>BSA-50</td><td>免疫グロブリンおよびプロテアーゼフリー</td></tr><tr><td>16% (wt/vol) ホルムアルデヒド溶液</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>28908</td> 1x PBS プレミアムカバーガラス (22 mm x 22 mm No.1) で <td>4% に希釈 1x PBS</td></tr><tr><td>プレミアムカバーガラス (22 mm x 22 mm No.1)</td> <td>Fisher</td><td>12548B</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787-50ML</td><td></td></tr><tr><td>SlowFade Gold 退色防止試薬と DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>S36938</td><td></td></tr><tr><td>名前</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>フローサイトメトリー分析用</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Calcein、AM</td><td>分子プローブC3100MP</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ハンクス平衡塩溶液(HBSS)</td><td>Gibco</td><td>14025-076</td><td></td></tr><tr><td>名前</td><td>会社</td><td>カタログ番号<</td><td>strong>コメント</td></tr><tr><td>ウェスタンブロット分析用</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-Caveolin 1</td><td>BD Transduction Laboratories</td><td>610406</td><td>Western Blot - 1:1,000</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>BioRad</td><td>170-6531</td><td></td></tr><tr><td>ニトロセルロースメンブレン (0.2 &mu;m)</td><td>BioRad</td><td>162-0112</td><td></td></tr><tr><td>Western Lightning Plus-ECL</td><td>PerkinElmer</td><td>NEL104001EA</td><td></td></tr><tr><td>BioRad DC Protein Assay</td><td>BioRad</td><td>500-0116</td><td></td></tr><tr><td>ドデシル硫酸ナトリウム (SDS)</td><td>BioRad</td><td>161-0302</td><td></td></tr><tr><td>デオキシコール酸ナトリウム一水和物 (DOC)</td><td>Sigma</td><td>D5670</td><td></td></tr><tr><td>IGEPAL CA-630 (NP40)</td><td>Sigma</td><td>I8896</td><td></td></tr><tr><td>30% アクリルアミド/Bis 溶液、37.5:1</td><td>BioRad</td><td>161-0158</td><td></td></tr></tbody></table>

濃縮細胞集団を生成し、細胞間コミュニケーションを調べるための簡単​​な方法：腫瘍微小環境のミミック

A Mimic of the Tumor Microenvironment: A Simple Method for Generating Enriched Cell Populations and Investigating Intercellular Communication

癌細胞と周囲の非癌性間質との間の早期の異な相互作用を理解することは、間質の活性化と腫瘍の微小環境（TME）の設立をもたらす事象を解明する上で重要です。 インビトロおよびTMEのインビボモデルにおけるいくつかが開発されています。しかし、一般的にこれらのモデルは、容易にさらなる研究のために、非摂動条件の下で、個々の細胞集団の単離を許可していません。この問題を回避するために、我々は、拡張共同用挿入物の膜の両側に、別々に密接成長高度に濃縮された細胞集団の簡単な生成を可能にする、まだ透過性微多孔膜インサートからなる細胞成長用基板を用いたin vitro TMEモデルを採用しています-culture回。このモデルを使用することによって、我々は以下の正常な二倍体のヒト線維芽細胞から大きく富化癌関連線維芽細胞（CAF）の集団を生成することができます蛍光タグ及び/又は細胞選別を使用せずに高転移性ヒト乳癌細胞との共培養（120時間）。さらに、インサートの細孔サイズを調節することによって、我々は開発の根底にあるメカニズムの調査を可能にする2異細胞集団間の細胞間コミュニケーション（ 例えば 、ギャップ結合コミュニケーション、分泌因子）のモード、のために制御することができますギャップ結合透過性の役割を含むTME、。このモデルは、癌間質開始、TMEの初期進化、および治療薬に対する癌細胞の応答に対する間質の調節作用につながる初期のイベントの我々の理解を高める上で貴重なツ​​ールとして機能します。

ここでは、in vivoでの腫瘍微小環境（ 図1）を模倣するインビトロ異細胞共培養システムを開発するために透過性の微多孔膜インサートを適応しました。このシステムは、（私達の使用中の120時間まで、）長時間のインサートの多孔質膜の両側に成長させることには、2つの異なる細胞集団を可能にします。 0.4〜1-または3 M-細孔インサートの上側にGFPタグ付きMDA-MB-231細胞をプレーティングし、それらの中で成長させることによって決定される重要なシステムでは、細胞集団の純度を維持することができますAG1522細胞が120時間、インサートの底面側に成長しているとの共培養。この時間の後、細胞を、インサートの下側​​から回収し、細胞集団の純度の損失を示すであろう任意のGFP陽性のMDA-MB-231細胞の存在を同定するためにフローサイトメトリーによって分析しました。分析は、99.9％と99.8％のPUを明らかにしましたそれぞれ0.4及び1μmの細孔挿入、から集団の再;細孔が膜を横切って移行するGFP陽性MDA-...

私たちは、腫瘍微小環境（TME）を模倣するために透過性の微多孔質膜インサートを適応させました。このモデルは混合細胞培養で構成されており、蛍光標識や細胞選別を使用せずに、高度に濃縮された個々の細胞集団の簡易な生成を可能にし、正常またはストレス条件下でTME内の細胞間コミュニケーションを研究することができます。

Understanding the early heterotypic interactions between cancer cells and the surrounding non-cancerous stroma is important in elucidating the events ...

このシンプルなin vitro共培養モデルの全体的な目的は、in vivoの腫瘍微小環境の特性を模倣し、個々の細胞集団を濃縮させ、細胞間コミュニケーションのさまざまな様式を調査することです。この手法は、がんおよび放射線生物学分野における重要な疑問、特にがん関連線維芽細胞の生成の根底にある要因や治療薬への反応に関する疑問を解決するのに役立ちます。この技術の主な利点は、ストレスを誘発する蛍光タグ付けや細胞ソーティングを行うことなく、混合細胞培養から個々の細胞集団を生成できることです。まず、目的の細胞培養物を5 mLのPBSで2回洗浄します。2回目の洗浄後、室温のtrypsin-EDTA 1 mLを用いて、室温で2分間細胞を剥離させます。次に、完全増殖培地9 mLを加えて反応を停止させ、培地をフラスコの表面に10回ゆっくりとピペッティングして細胞を解離させます。計数後、新鮮な培地を用いて細胞濃度を2.5 × 10⁵ cells/mLに希釈し、滅菌済みの15 mL遠心チューブに移します。遠心分離によって細胞を沈殿させ、50%胎児牛血清を添加した新鮮な増殖培地を用いて、培地70 µLあたり2.5 × 10⁵ cellsの濃度でペレットを再懸濁します。次に、適切な実験用孔径のインサートをパッケージから取り出し、マルチウェルディッシュの各ウェルに配置して、ディッシュに蓋をします。次に、両手でディッシュを持ち、インサートの底が上を向くまでゆっくりと反転させます。ディッシュの底面を取り除きます。片手の滅菌鉗子でインサート1つを固定し、もう一方の手で細胞 70 µL をマイクロピペットチップでゆっくりと吸引します。次に、インサートの上面（現在は上側になっている部分）の表面全体に、ゆっくりと細胞を分注します。各インサートへの播種後、慎重にディッシュの底蓋を戻し、倒置したディッシュを37 °C、5% CO₂、高湿度条件下で30〜45分間インキュベートします。インキュベーション終了後、ラミナーフロー生物学的安全キャビネット内で、インサートの底部が下を向くように慎重にディッシュを元に戻します。その後、各インサートの底部を、あらかじめ温めておいた2 mLの完全培地にゆっくりと注意深く浸し、ディッシュを加湿インキュベーターに戻します。48時間後、各ウェルの底にある培地を2 mLの新鮮な増殖培地と交換します。すべての培地を交換した後、関心のある2番目の細胞集団を2.5 × 10⁵個、1 mLの新鮮な培地とともにインサートの上部に播種し、ディッシュをインキュベーターに戻します。24、48、および96時間後に、各インサート上部の培地を1 mLの新鮮な完全培地で交換します。また、各ウェル底部の培地を2 mLの新鮮な完全培地で交換します。120時間の共作培養後、インサートを1つずつ、1 mLのPBSを含む個別の35 mm細胞培養ディッシュに移動させます。インサートの底面と上面を1 mLのPBSで洗浄します。インサートの底面で培養した細胞を回収するため、インサートを底面を下にして200 µLの室温trypsin-EDTAに入れます。室温で2分後に、800 µLの完全増殖培地を加えて反応を停止させます。次に、インサートをわずかに傾けて保持し、上清を細胞の表面に10回静かにピペッティングして、ディッシュに細胞を回収します。すべてのインサートからの回収が完了したら、成長培地を用いて、細胞濃度が2×10⁵ cells/mLになるように再懸濁します。そして、滅菌済みの個別のガラスカバースリップ上に細胞懸濁液を250 µLずつ分注します。カバースリップを湿潤させたインキュベーター内に1時間置きます。インキュベーション終了後、ラミナーフロー生物学的安全キャビネット内で、ディッシュに完全増殖培地を2 mL慎重に加え、37 °C、5% 二酸化炭素、および湿度条件下で48時間インキュベートします。その後、細胞をPBSで3回洗浄します。3回目の洗浄後、PBSに含まれる4% formaldehydeで細胞を室温で10分間固定し、続いてTris緩衝生理食塩水で5回洗浄します。最後の洗浄後、0.1 saponinを添加した0.25% Triton X-100を用いて細胞を室温で5分間透過処理し、その後、ブロッキング溶液中で室温で1時間インキュベートします。次に、ブロッキング溶液中の目的の一次抗体を用いて、サンプルを4°Cで一晩ラベルします。翌朝、洗浄液を用いて3分間の洗浄を3回行い、未結合の抗体を除去します。続いて、ブロッキング液で希釈した適切な二次抗体を用いて、室温で1時間インキュベートします。インキュベーション終了後、先ほどと同様に未結合の二次抗体を洗浄し、DAPIを含む退色防止封入剤を用いてカバーガラスを個別のスライドガラスに封入します。最後に、カバーガラスの縁を透明なマニキュアで封止します。次に、蛍光励起用の外部光源を備えた倒立顕微鏡を用い、63倍の油浸対物レンズで細胞をイメージングします。このシステムでは、孔径 0.4 µm または 1 µm のインサートを使用した場合、細胞培養インサートの多孔質膜の両側で2つの異なる細胞集団を少なくとも 120 時間培養することができ、膜の両側の細胞集団において 99% 以上の純度を維持することが可能です。しかし、孔径 3 µm のインサートは、本実験で使用した GFP 陽性のヒト乳がん細胞株で観察されたように、細胞が膜を越えて遊走するのに十分な大きさです。0.4 micronの孔径を持つインサートは、インサートの両側の細胞培養間における機能的なギャップ結合の形成を制限し、細胞間コミュニケーションを分泌因子のみに限定します。一方、1 micronおよび3 micronの孔径を持つインサートでは、これらの共培養における膜を介した蛍光標識の移行によって示されるように、ギャップ結合を介した細胞の機能的結合が可能です。重要な点として、このシステムを用いることで、正常ヒト二倍体線維芽細胞を乳がん細胞と共培養し、がん関連線維芽細胞を効果的に誘導できることが、ヒト乳がん細胞と共培養した線維芽細胞におけるcaveolin-1の発現低下により証明されています。この手順を行う際は、検討している課題に適した孔径のインサートを選択することが重要です。また、インサートの底面において、細胞の接着を促進する培地を用いて最初の細胞集団を確認してください。本手順の後、タンパク質発現の変化、浸潤および遊走の変化、あるいは治療薬に対する反応性の違いなど、さらなる課題を解決するために、免疫ブロッティング、in-situ 免疫蛍光染色、またはその他のほとんどの細胞ベースのアッセイなどの手法を実施することが可能です。本手法の開発により、がん生物学および放射線生物学の分野の研究者は、腫瘍の発生や腫瘍微小環境の進展に寄与する因子、そして今回のケースでは、放射線照射を受けた標的細胞から近傍のバイスタンダー細胞へと伝播する電離放射線の有害な影響について探索することが可能となりました。このビデオを視聴することで、混合細胞共培養の調製方法、共培養の維持方法、およびさらなる解析のために共培養から高純度に濃縮された細胞集団を回収する方法について、十分に理解できるはずです。ヒト細胞株や細胞ラインの取り扱いは危険を伴う可能性があるため、本手順を実施する際は、適切な個人用保護具を着用し、適切なバイオセーフティー規定を遵守することを忘れないでください。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。

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濃縮細胞集団を生成し、細胞間コミュニケーションを調べるための簡単​​な方法：腫瘍微小環境のミミック

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