濃縮細胞集団を生成し、細胞間コミュニケーションを調べるための簡単​​な方法：腫瘍微小環境のミミック

このシンプルなin vitro共培養モデルの全体的な目標は、in vivo腫瘍微小環境の特性を模倣し、個々の細胞集団を濃縮し、細胞間コミュニケーションのさまざまなモードを調査することです。この方法は、がんおよび放射線生物学の分野、特にがん関連線維芽細胞の生成の根底にある要因と治療薬への応答に関する重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、ストレスを誘発する蛍光標識や細胞選別なしに、混合細胞培養から個々の細胞集団を作製できることです。

まず、目的の細胞培養物を5ミリリットルのPBSで2回洗浄します。2回目の洗浄後、室温で2分間、室温のトリプシン-EDTA1ミリリットルで細胞を剥離します。次に、9ミリリットルの完全増殖培地で反応を急冷し、フラスコの表面上で培地を10回静かにピペッティングして細胞を解離します。

カウント後、細胞を新鮮な培地で1ミリリットルあたり5番目の細胞濃度の2.5倍に希釈し、細胞を滅菌した15ミリリットルの遠心分離チューブに移します。遠心分離により細胞をスピンダウンし、中濃度70マイクロリットルあたり10〜5番目の細胞の2.5倍で50%ウシ胎児血清を添加した新鮮な増殖培地にペレットを再懸濁します。次に、適切な実験用細孔サイズのインサートをパッケージからマルチウェルディッシュの個々のウェルに移し、ディッシュを覆います。

次に、皿を両手で持ち、インサートの底が上を向くまで皿を静かに反転させます。皿の底を取り外します。片手で滅菌鉗子を使用して、片方のインサートを所定の位置に保持し、もう一方の手で70マイクロリットルの細胞をマイクロピペットチップにゆっくりと吸引します。

次に、インサートの上面であるものの表面全体に細胞をゆっくりと分配します。各インサートを播種した後、皿の底を慎重に交換し、逆さにした皿を摂氏37度と二酸化炭素5%で湿度30〜45分間インキュベートします。インキュベーションの終わりに、層流の生物学的安全キャビネットで、インサートの底が下を向くように皿を慎重に反転させます。

次に、各インサートの底を2ミリリットルの予熱した完全な培地にゆっくりと慎重に浸し、皿を加湿インキュベーターに戻します。48時間後、各ウェルの底にある培地を2ミリリットルの新鮮な成長培地と交換します。すべての培地がリフレッシュされたら、1ミリリットルの新鮮な培地でインサートの上部に、2番目の対象集団の5番目の細胞に10の2.5倍の種をまき、皿をインキュベーターに戻します。

24時間後、48時間後、96時間後、各インサートの上部にあるメディウムを1ミリリットルの新鮮な完全なメディウムと交換します。そして、各ウェルの底にある培地には、2ミリリットルの新鮮な完全な培地が含まれています。120時間の共培養後、1ミリリットルのPBSを含む個々の35mm細胞培養皿に一度に1つのインサートを移します。

そして、インサートの底面と上面を1ミリリットルのPBSで洗います。インサートの底部で増殖した細胞を回収するには、インサートの底面を下にして200マイクロリットルの室温トリプシン-EDTAに入れます。室温で2分後、800マイクロリットルの完全増殖培地で反応を停止します。

次に、インサートをわずかな角度で保持し、上清を細胞の表面に10回静かにピペットで移動させ、皿に細胞を集めます。すべてのインサートを剥がし終えたら、細胞を増殖培地1ミリリットル当たりの細胞の10倍から5番目の細胞の2倍の濃度で再懸濁する。そして、250マイクロリットルの細胞を滅菌済みの個々のガラスカバースリップに加えます。

カバースリップを加湿インキュベーターに1時間入れます。インキュベーションの終わりに、層流の生物学的安全キャビネットで、2ミリリットルの完全な成長培地を皿に慎重に加え、摂氏37度と二酸化炭素5%の湿度で48時間インキュベートします。次に、PBSで細胞を3回洗浄します。

3回目の洗浄後、細胞をPBS中の4%ホルムアルデヒドに室温で10分間固定し、続いてトリス緩衝生理食塩水で5回洗浄します。最後の洗浄後、0.1サポニンを添加した0.25%Triton X-100を室温で5分間細胞に浸透させ、続いてブロッキング溶液で室温で1時間インキュベートします。次に、目的の一次抗体でサンプルを標識し、摂氏4度で一晩中ブロッキング溶液を投与します。

翌朝、未結合の抗体を洗浄液中で3分間洗浄して取り出し、続いてブロッキング溶液中の適切な二次抗体で1時間の室温インキュベーションを行います。インキュベーションの終了時に、示したように未結合の二次抗体を洗浄し、DAPIを含む退色防止封入剤を使用してカバーガラスを個々のスライドにマウントします。カバーガラスの端を透明なマニキュアで密封します。

次に、蛍光励起用の外部光源を備えた倒立顕微鏡で、63倍の油倍率で細胞を画像化します。このシステムでは、0.4または1ミクロンの細孔を持つインサートを使用した場合、細胞培養インサートの多孔質膜の両側で2つの異なる細胞集団を少なくとも120時間増殖させることができ、膜の両側の細胞集団の純度を99%以上維持することができます。しかし、3ミクロンの細孔を持つインサートは、GFP陽性ヒト乳がん細胞株を用いたこの実験で観察されたように、細胞が膜を横切って移動するのに十分な大きさです。

また、0.4ミクロンのポアインサートは、インサートの両側の細胞培養物間の機能的ギャップジャンクションの形成を制限し、分泌因子への伝達を制限します。しかし、1ミクロンと3ミクロンの細孔を持つインサートは、これらの共培養で蛍光標識がメンブレンを横切って移動することによって示されるように、ギャップ結合を介した細胞の機能的結合を可能にします。重要なことに、このシステムは、ヒト乳がん細胞と共培養した線維芽細胞に対するカベオリン-1の発現が減少することによって証明されるように、正常なヒト二倍体線維芽細胞と乳がん細胞との共培養後に、正常なヒト二倍体線維芽細胞からがん関連線維芽細胞を効果的に生成するために使用することができます。

この手順を試行する際は、調査対象の問題に適した細孔サイズのインサートを選択することが重要です。そして、インサートの底面にある最初の細胞集団を、それらの接着を容易にする培地で確認します。この手順に続いて、イムノブロッティング、in-situ免疫蛍光法、または他のほとんどの細胞ベースのアッセイなどの他の方法を実行して、タンパク質発現の変化、浸潤と移動の変化、または治療薬に対する応答の違いに関する追加の質問に答えることができます。

その開発後、この技術は、癌生物学および放射線生物学の分野の研究者が、腫瘍微小環境の発展、そして私たちの場合は放射線による標的細胞からの電離放射線の有害な影響の広がりに寄与する要因を探求するための道を開きました放射線による標的細胞から近くの傍観細胞へ。このビデオを見れば、混合細胞共培養の調製方法、共培養の維持方法、および共培養から高純度に富んだ細胞集団を採取してさらに分析する方法について十分に理解できるはずです。ヒト細胞株や細胞株を扱う作業は危険な場合があり、この手順を実行する際には適切な個人用保護具を着用し、適切なバイオセーフティ規制を遵守する必要があることを忘れないでください。

ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。