Name: 敏感な、大規模定量的メタボロームのための戦略 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-27T13:45:00.000+00:00
Duration: 14 min 18 s
Description: 学ぶ、培養細胞からの極性代謝物抽出と高分解能質量分析を用いたメタボローム解析法。このプロトコルは、健康と疾患における代謝変化の研究に有用な枠組みを提供します。

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著者らは、質量キャリブレーションおよびデータ処理に関する貴重な議論のためにデトレフシューマン、ジェニファー·サットン（サーモフィッシャーサイエンティフィック）とナサニエル·スナイダー（ペンシルバニア大学）を承認したいと思います。この刊行物で報告された研究が受賞番号R00CA168997の下で国立衛生研究所の国立癌研究所によってサポートされていました。内容はもっぱら著者の責任であり、必ずしも国立衛生研究所の公式見解を示すものではありません。

1。LC-MS試薬、クロマトグラフィ法の確立の準備、計測器操作手順の確立<ol><li> LC溶媒の準備<ol><li> 500ミリリットルの移動相を準備します。 Aは、20mM酢酸アンモニウムおよび3％アセトニトリル/水中の15mMの水酸化アンモニウム、最終pHは9.0であり;そしてBは、100％アセトニトリルである。 </li><li>緩く、ボトルにキャップを水浴超音波処理に置き、そして余分な加熱せずに10分間超音波処理。 （このステップは、アンモニウム塩の全てが完全に溶解すること、および残存気泡がないことを保証することである。） </li><li> LC-MS用に250mlのガラスボトルに250mlの溶媒を移し、4℃で剰余を保つ</li></ol></li><li>低質量範囲のキャリブレーション溶液を調製する。正確な質量が、低分子量で検出されることを保証するメタボロミクスアプリケーション用にカスタマイズされた低質量範囲のキャリブレーション混合物を使用することが重要である。 <ol><li> SODI両方5mgを量るウムフルオロおよびホモバニリン酸および1 mg / mlの最終濃度を作るために5mlの水にそれらを溶解する。 10 mg / mlの終濃度を作るためにメタノールにダイアジノンを溶解する。 </li><li>負の低質量較正溶液1mlを調製し、ナトリウムfluoroaceateおよびホモバニリン酸溶液20mlで熱負の較正溶液960ミリリットルを混合する。正の低質量キャリブレーション溶液1mlを加えるには、サーモプラスの校正液の990ミリリットルと10ミリリットルダイアジノン溶液を混合。 （低質量​​キャリブレーション溶液は、4℃で保存されるべきであり、2ヶ月ごとに新しく調製する。） </li></ol></li><li>低質量範囲でのQE-MSのキャリブレーション<ol><li>低質量範囲のキャリブレーションを行う前に、製造者の指示に基づいて、正と負の両方のモードで標準的な質量較正た（m / z、150-2,000）を行う。 </li><li>定期的な質量キャリブレーションが経過すると、測定器のコントロールパネルで60〜900メートル/ Zとスキャン範囲を調整そしてポジティブモードとネガティブモード35 eVで25 eVでのソースCIDが適用される。 （これはカフェインのフラグメントイオンと硫酸イオンの強固な信号が得られます。ここでスキャン範囲が固定され、最後のm / zが始まるのm / zの15倍よりも大きくするべきではありませんので） </li><li>イオン源が安定すると、カスタマイズされた後、キャリブレーションを行う。注：安定したソースがポジティブモードで総イオン電流変化量の10％未満と定義し、ネガティブモードで15％未満れる。カスタマイズされたキャリブレーションイオンおよび対応するm / zが表1に列挙されている。 </li></ol></li><li>極性代謝物分析のためのLC-MS装置を確立します。 LCは、代謝産物の分離および検出のためのQE-MSに連結されている。 <ol><li>加熱されたエレクトロスプレーイオン化プローブ（H-ESI）とQE-MSを装備。記載されているプローブに関連するチューニングパラメータを設定します。ヒーターの温度、120℃;シースガス、30;補助ガス、10; 、スイープガス3; 、電圧をスプレーするため3.6 kVのポジティブモード及びネガティブモードのは2.5kV。 55で320℃、キャピラリー温度、およびS-レンズセット。 </li><li>フルスキャン範囲：次のようにフルスキャンの方法を構築する60から900（M / z）を;解像度70,000;最大射出時間：50ミリ秒の周りに典型的な噴射時間で200ミリ秒;自動利得制御（AGC）3,000,000イオン。これらの設定は、正と負の両方のモードでスキャンを実行するために周りの550ミリ秒のデューティサイクルをもたらす。 </li><li>クロマトグラフィー法を確立する。室温13,15での化合物の分離のために、アミドカラム（100×内径2.1 mm 3.5 mm）を使用する。上述したように、移動相Aであり、移動相Bはアセトニトリルである。以下のように線形グラデーションを使用します。0分85％のB; 1.5分間、85％B、5.5分、35％B; 10分、35％B、10.5分、0〜10分15〜35％B、14.5分、35％B、15分間、85％B、20分間、85％B.流速0.15ミリリットル/分20分、10.5〜14.5分で0.3ml /分である。 </li></ol></li></ol> 2。のPr代謝産物試料のeparation <ol><li>抽出溶媒を準備します。 50mlチューブ中の40 mlのメタノール（LC-MSグレード）および10 mlの水（LC-MSグレード）に混合し、使用前に少なくとも1時間、-80℃の冷凍庫に保管してください。注：この手順は、以下の手順とは、生体組織および体液試料を抽出するために修飾することができる。 <ol><li>完全な増殖培地で3 10cmの皿または6ウェルプレート中で培養大腸癌HCT 8細胞は、RPMI 1640 10％熱不活化ウシ胎児血清および100,000単位/ Lのペニシリンおよび100mg / Lのストレプトマイシンを補充した。 </li><li>細胞が80％コンフルエントに達したときに、すぐに培地を除去し、ドライアイス13,15の上に皿またはプレートを配置します。すぐに（80％メタノール/水）、溶媒1ミリリットル抽出を追加し、-80℃の冷凍庫にプレートを転送する。 10cmディッシュのために、各ウェルに抽出溶媒の3ミリリットルを追加します。 （中の媒体から残留塩によるイオン抑制の影響を避けるために可能な限り削除するようにしてください。）</li><li> 15分間のプレートのままにしておきます。冷凍庫から取り出し、ドライアイス上で溶媒中に細胞をこすり取る。 1.7ミリリットルエッペンドルフチュー​​ブに溶液を移し、10分間4℃で2万×gでの速度で遠心する。 （3反復サンプルを作るために3つの別々の皿から細胞代謝物を準備します。2のチューブを維持する目的は、バックアップとして1を持つことです。） </li><li> 2新しいエッペンドルフチュー​​ブに上清を移し、高速真空でそれらを乾燥させます。これは、使用高速真空に応じて約3-6時間かかります。 （サンプルはまた、窒素ガス下で一晩乾燥させることができる。） </li><li>乾燥後、-80℃の冷凍庫で各サンプルのストアのチューブ。準備ができたら、20mlの水（LC-MSグレード）に一つのサンプルを再構成し、分析のためにLC-MS QE-5ミリリットル注入する。 </li></ol></li></ol>サンプル·シーケンスの3。セットアップ<ol><li>較正が正しくQE-MS上で実施された後、流量で85％のAで5分間、LCカラムを平衡化LC勾配の開始条件は0.15 ml /分の速度。 </li><li>ランダムにサンプル·シーケンスを設定します。注：このようにして、各サンプルにLC-MSによって導入変動を分配し、異なるサンプル間のより正確な比較を確実にする。 LCグラジエントは10分間95％Aで0.15 ml /分の流速で85％Aで5分のカラム平衡化に続い除くすべての6サンプルは、同じMS法を共有する洗浄運転を追加する。システムのバックグラウンドを評価し、レベルに運ぶために、各洗浄の実行後にブランク試料（水100％）を追加します。 </li><li>シーケンスを保存し、LCカラムは400 PSIまわり、安定した圧力を示し、一度、シーケンスの実行を開始します。他のサンプルが存在しない場合、この配列の後に実行されるべきであり、次いで、グラジエントの最後0 ml /分の流量を有する配列の端部にストップランを追加し終えた後に「スタンバイ」を選択するシーケンス。 </li><li>再実行して同じサンプルは、キャリブレーション後の12時間に設定してください。 （これは私がキャリブレーション後の質量誤差の変動を評価するための）。 </li></ol> 4。ポストの分析計測器クリーニングとメンテナンス<ol><li>シーケンスの最後に、0.2〜2時間、ml /分の流速で95％Aでカラムを洗浄し、必要に応じて、洗浄前の列を逆転。 </li><li> LCカラムを取り外し、直接結合によってイオン源へのLCを接続してください。 （：V：V、90:10:0.2 v）を、待機モードにMSを設定し、除去し、1時間0.1ミリリットル/分の流速でLC-MSシステムを洗浄溶媒としては、水/メタノール/ギ酸を掃除調製残差は、塩または他の不純物を沈殿させた。あまりにも多くのシステム圧力がある場合、流量を低下させる。 </li><li> 50℃のキャピラリー温度を設定し、イオンケージを取り外す。キャピラリー温度が50℃まで低下した後、慎重にイオンスイープコーンおよびイオントランスファーチューブを取り出しイオンスイープコーンの表面に残った不純物を除去するために、サンドペーパーなどの粗いメッシュを使用する。 </li><li>イオンの移動を置く0.1％ギ酸を含む10ミリリットルの90％水/メタノールを含有する15 50mlのFalconチューブにチューブ。 20分間水浴超音波処理チューブを超音波処理した後、内部の溶媒をデカント10ミリリットル純メタノールと交換し、さらに20分間超音波処理。 （必要に応じて、超音波処理は、良好な洗浄結果を達成するために40℃以上、より高い温度で行うことができる。） </li></ol> 5。LC-MSデータの解析を<ol><li>サンプル·シーケンスを確実にするためには、シーケンスの最初の二つのサンプルを終えた後、未知の代謝物ピークを確認し、スムーズに動作します。入力ファイルとして、代謝物名、中性化学式および検出モード（正または負）の一覧のCSVファイルを使用して、出力ファイルはppmで抽出されたピークと質量誤差が含まれています。ピーク形状が異常であるか、質量誤差が5ppm以下でオフである場合、シーケンスの残りの部分は停止し、トラブルシューティングを行う必要があることが必要である。 </li><li> 「ピークの位置合わせの方法を選択してくださいそして市販のソフトウェアでのフレーム抽出」。 LC-MSおよびグループ化からの生データを選択します。ピークの位置合わせのためのクロマトグラフィーの基準サンプルとして実行シーケンスの途中でサンプルを選ぶ。収集した情報に基づき対象となる代謝物の分析と、対応するフレームの種のための既知の代謝物を含むフレームの種をアップロードします。 </li><li>別々に正および負のモードでデータ解析を行う。他のパラメータのデフォルト設定を使用してください。データベースの検索機能をオフにして、ワークフローを実行します。すべてのフレームのピーク面積を含むExcelシートとして処理されたデータをエクスポートします。フレームの最初のセットは、ターゲットリスト内の代謝物に対応しています。注：標的代謝産物分析のために、代謝産物情報は、以前の研究13,15に基づいて取得される。 </li><li>非標的代謝物分析のために、「成分抽出」の方法を選択します。バックグラウンド除去のためのブランク試料をロードします。設定したピーク強度閾値aをt10の5,3の対雑音比10 ppmおよび信号のm / zの幅。 </li><li>未知の化合物の同定のためのヒューマン·メタボローム·データベースを使用します。反復サンプル内の大きなCVSでコンポーネントを削除するのCVフィルタを使用します。手動で各コンポーネントを通過し、明確に定義されたピークまたはデータベース検索のための種々のサンプルタイプでは比較的大きな差を持つものを選択します。データベース内のヒットしたデータをエクスポートします。 （ピークアラインメントスコアが低すぎる場合には、ピーク位置合わせをバイパスすることができる。） </li></ol>

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</ol>

著者らは、利害の衝突を宣言していません。

このプロトコルを使用して、細胞内の正常な代謝物プロファイリングのための最も重要なステップは次のとおりです。1）増殖培地、細胞を慎重に取り出しを制御する。 2）定量のためのピーク間で十分に（通常は少なくとも10）のデータ·ポイントがあることを確認するために、MSメソッドの設定に基づいて、LC法を調整する。 3）サンプルを実行する前に、低質量キャリブレーションを行う。 4）保持時間のシフトを回避するために、せいぜい5ミリリットル注入し、ピークの広がりは、水に起因する;および5）バッチ効果を最小化するために、同じバッチ内の比較のためのサンプルを準備し、実行する。 低質量範囲のキャリブレーションのためにここで選択された基準（ 表1）は、交換可能である。質量スキャン範囲内に収まるのm / zを有する任意の公知の化合物を、ウェルH-ESIソースに挙動し、水、メタノール、またはアセトニトリルに溶解されている較正標準のための合理的な候補である。それは非常にすべてのキャリブレーション溶液Aを保存することをお勧めしますトン4°C、カフェインを安定させるとともに、キャリ...

同時に複数の代謝物を測定した実験として定義メタボロミクスは、強烈な関心領域となっている。メタボロミクスは、分子生理学の直接的な読み取りを提供し、癌の1-4などの開発や病気への洞察を提供してきました。核磁気共鳴（NMR）、ガスクロマトグラフィー-質量分析（GC-MS）は、最も一般的に使用される器具5-9の一つである。 NMR、特に、13 C標識された代謝産物などの重同位体標識された化合物は、以降フラックス実験のために使用されている、10,11 NMR活性である。しかし、この戦略は、比較的高いサンプル純度とメタボロミクスへの応用が制限され、大きなサンプル量を必要とする。一方、NMRから収集されたデータは、集中的な分析を必要とし、複雑なNMRスペクトルの化合物の割り当てが困難である。 GC-MSは、広く極性代謝および脂質研究のために使用されてきたが、それは揮発性compounを必要とするDS、したがって、場合によっては時間がかかる可能性が錯体化学を伴い、実験ノイズが導入されて代謝物の多くの場合、誘導体化、。 第3の四重極を特徴フラグメントまたは娘イオンを選択するために使用される三連四重極質量分析に連結した液体クロマトグラフィー（LC）は、次いで、第2四重極で断片化された無傷の親イオンを選択するための第1の四重極を使用する。特定の娘イオンの親イオンからの遷移を記録するこの方法は、多重反応モニタリング（MRM）と呼ばれる。 MRMは、小分子とタンパク質定量12-15,21両方のための非常に感度が高く、特異的で、かつロバストな方法である。しかし、MRMはその制限があります。高い特異性を達成するために、MRM方法は、各代謝産物のために構築する必要がある。この方法は、プロペンの事前知識を必要とする、特定のフラグメントを識別し、最適化された衝突エネルギーを対応するから成りこのような化学構造情報のような目的の代謝産物のrties。したがって、一般的なフラグメントのニュートラルロスを伴ういくつかの例外を除いて、それがこの方法で、未知の代謝物を同定することは不可能である。 近年では、高分解能質量分析（HRMS）器具は、例えばLTQ-オービトラップとExactiveシリーズ、QuanTof、およびTripleTOF 5600 16-18,22として、リリースされている。 HRMSは、数ppmの誤差内で無傷のイオンの比（m / z）の質量電荷を提供することができる。したがって、すべての前駆体イオン（ すなわち、フルスキャンモード）を検出することによって操作HRMS器具は、正確な質量及び分析物の得られた元素組成から直接の構造情報を得ることができ、この情報は、潜在的な代謝産物を同定するために用いることができる。実際、化合物に関するすべての情報は、構造異性体のレベルまで、正確な質量を得ることができる。また、フルスキャン方式は、代謝物の予備知識を必要とせず、法の最適化を必要としません。のm / zの走査範囲に落ちると、全てのイオンを分析することができるので、HRMSは、MRM法と比較して、単一の実行で定量することができる代謝産物の数の点でほぼ無制限の容量を有する。 HRMSも発生するフルMSスキャンで得られるデータ点の同程度の数が、その結果、短いデューティ·サイクルに定量的な能力の三連四重極MRMに匹敵する。したがって、HRMSは、定量的メタボロミクスのための代替アプローチを提供します。近年、HRMSの改良版は、（QE-MS）は、検出範囲19を拡張し 、単一の方法では十分に速いサイクル時間を有する正および負のモード間の切り替えの下で動作させることができるQ-Exactive質量分析法と呼ばれる。ここでは、QE-MSを用いて当社のメタボロミクス戦略を説明します。

<table><tbody><tr><td>ポジキャリブレーションミックス</td><td>Thermo Scientific</td><td>#88323</td><td>光に敏感です。4°Cで保管します。C</td></tr><tr><td>ネガティブキャリブレーションミックス</td><td>Thermo Scientific</td><td>#88324</td><td>4°C;C</td></tr><tr><td>Diazinon</td><td>Sant Cruz Biotechnology</td> <td>#C0413</td><td>それは目の刺激を引き起こすので、フードで作業してください。4°Cで保管します。C</td></tr><tr><td>H-ESIニードルインサート</td><td>Fisher Scientific</td><td>#1303200</td><td>目詰まりした場合は、5%ギ酸/水(ゴムリングを取り外す)で交換または洗浄することができます。</td></tr><tr><td>Xbridge アミドカラム</td><td>Waters</td><td>#186004860</td><td>カラムの寿命を延ばすために、ガードカラムをお勧めします。</td></tr></tbody></table>

敏感な、大規模定量的メタボロームのための戦略

A Strategy for Sensitive, Large Scale Quantitative Metabolomics

代謝物プロファイリングは、健康と病気における代謝の研究に貴重な資産となっている。しかし、現在のプラットフォームでは、このような労働集約的試料調製、低検出限界、スロースキャン速度、各代謝のための集中的な方法の最適化、および積極的に両方を測定することができないことや、単一の実験では負に帯電したイオンなどの異なる制限要因を持っています。このため、新たなメタボロミクスプロトコルはメタボロミクス研究を進めることができます。アミド系親水性クロマトグラフィーは、任意の化学的誘導体化することなく、極性代謝物の分析を可能にします。 Q-Exactive（QE-MS）を用いて高分解能MSは、イオン光学系を改善し、スキャン速度（解像度7万256ミリ秒）に上昇し、正/負切り替えを行う能力を有している。冷メタノール抽出戦略を使用して、QE-MSとのアミドの列を結合することは、同時に、追加機能の168の標的極性代謝と数千のロバストな検出を可能にします。 DAT処理は非常に効率的な方法で市販のソフトウェアを用いて実施され、マススペクトルから抽出された未知の機能がデータベースに照会することができる。

メタボロミクスデータの精度は非常にLC-QE-MS装置の性能に依存します。器具が良好な状態で動作しているかどうかを評価するために、 図1に示すように、適用される方法が適切であるかどうか、いくつかの既知の代謝産物のLCピークは、全イオンクロマトグラム（TIC）から抽出される。アミノ酸を含む極性代謝産物、解糖中間体、TCA中間体、ヌクレオチド、ビタミン、というように、ATP、NADP +とは、現在のLC条件の下でアミドの列の列と良好なピーク形状に良好な保持を持っている。一方、質量誤差試験は三連のサンプルの6つの異なる濃度の校正後に二回実行される。 図2に示すように、低質量較正後24時間以内に行われ、全体の時間範囲は、ほぼ24時間を覆っている。質量誤差は、標的代謝物の理論のm / zを検出したm / zを比較することによって評価される。ここで対象となる代謝物は、m / zを持っている74（グリシン）から744（NADP +）の範囲。ここでY軸は、特定の質量誤差範囲内の代謝産物の累積パーセンテージを表す。赤色の曲線は12〜24時間から...

代謝物プロファイリングは、健康と病気における代謝の研究に貴重な資産となっている。極性切り替えと迅速なデューティサイクルの高分解能質量分析に連結された正常相化液体クロマトグラフィーを利用して、我々は、高感度、精度、および解像度を有する生物学的物質の極性代謝物を分析するためのプロトコルを記載している。

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. However, current platforms have different limiting ...

この手順の全体的な目標は、培養細胞の代謝プロファイリングを研究することです。これは、最初に細胞から極性代謝物を抽出することによって達成されます。2番目のステップは、細胞抽出物を水中で再構成し、サンプルをlcバイアルに移すことです。次に、サンプルをキャリブレーションしたlc QE MS装置に注入し、最終ステップで生データをコンピューターに記録します。市販のソフトウェアを使用して生データから代謝物のピークを抽出し、未知なるピークを高分解能質量データベースに対して検索します。このマスターは、SARSの相対的な代謝物レベルに関する洞察を提供することができますが、血清や組織などの他のシステムにも適用できます。まず、移動相 A 500 ミリリットル(20 ミリモル酢酸アンモニウム)と 15 ミリモルの水酸化アンモニウムを 3% アセト、ニトリル、および水に調製します。ボトルを緩くキャッピングした後、加熱せずに10分間水浴で溶液を超音波処理します。これに続いて、5ミリグラムのフルオロ酢酸ナトリウムと酸の両方を5ミリリットルの水に溶解して、1ミリリットルあたり1ミリグラムの最終濃度にします。次に、ジアジノンをメタノールに溶解して、1ミリリットルあたり10マイクログラムの最終濃度にします。1ミリリットルのネガティブ低質量キャリブレーション溶液を調製するには、960マイクロリットルのサーモネガティブキャリブレーション溶液と20マイクロリットルのフルオロ酢酸ナトリウムおよびホモバニリン酸溶液を混合します。1ミリリットルの正の低質量較正溶液を作るには、990マイクロリットルのサーモポジティブ校正溶液と10マイクロリットルのダイアジノン溶液を混合します。ポジティブモードで標準質量校正を行った後、装置のコントロールパネルでスキャン範囲を60〜900質量対電荷比に調整し、25電子ボルトのソース衝突誘起解離を適用します。カスタマイズしたキャリブレーションイオンを入力し、イオン源が安定したら、チューニングページでカスタマイズしたキャリブレーションを開始します。ネガティブモードで標準質量校正を行った後、極性をネガティブモードに切り替え、機器のコントロールパネルでスキャン範囲を60〜900質量対電荷比に調整し、35電子ボルトのソース衝突誘起解離を適用します。カスタマイズされたキャリブレーションイオンを入力し、イオン源が安定したら、カスタマイズされたキャリブレーションを開始します。チューニングページでは、QE MS装置に加熱式エレクトロスプレーイオン化プローブまたはHESIプローブをレベルCに固定し、窒素ガス入口、気化器ケーブル、電圧ケーブルに接続して装備します。コンピューターのチューニングページで、プローブに関連するチューニングパラメーターを設定します。キャピラリー温度を320°Cに、Sレンズを55°Cに設定します。次に、メソッド・プログラムで、次の値を使用してフル・スキャン・メソッドを作成します。線形グラジエント情報を入力してクロマトグラフィー法を確立します。室温での化合物分離には、amidカラムを使用してください。この時点で、50ミリリットルに40ミリリットルのメタノールと10ミリリットルの水を手動で混合して抽出溶媒を準備します。2。以前に大腸がんH CTを培養すると、8つの細胞が80%のコンフルエントに達します。培地を素早く吸引し、6ウェルプレートをドライアイスの上に置きます。次に、すぐに各ウェルに1ミリリットルの抽出溶媒を加え、プレートをマイナス80°Cの冷凍庫に移します。プレートを冷凍庫から取り出した後、15分後、ドライアイスの上に置き、細胞を溶媒にこすり落とします。各ウェルから溶液を3本の1.7ミリリットルのeinorチューブに移し、サンプルをGの20, 000倍の速度で摂氏4度で10分間遠心分離します。遠心分離後、上清を2つの新しいeinorチューブに移します。その後、サンプルをスピードバキュームで乾燥させます。サンプルが乾いたら、マイナス80°Cの冷凍庫に保管します。分析のためにサンプルを冷凍庫から取り出した後、氷温に達するまで待ちます。次に、20マイクロリットルの氷冷水を加え、サンプルをボルテックスして代謝物を溶解します。次に、サンプルを摂氏4度でGの20, 000倍で遠心分離します。2分間、SUPERNATをlcバイアルに移し、分析のためにlc QES装置に5マイクロリットルのサンプルを注入します。QE MS装置でキャリブレーションを適切に実施したら、0.15 mL/分の流速で移動相Bの85%でlcカラムを5分間平衡化します。次に、サンプルシーケンスをランダムな順序で設定して、LCMSによってもたらされる変動を各サンプルに分散させ、異なるサンプル間のより正確な比較を確保します。6つのサンプルごとに、ウォッシュランを追加し、続いてブランクサンプルを追加して、システムのバックグラウンドとキャリーオーバーレベルを評価します。シーケンスを保存し、シーケンスの実行を開始します。lcカラムが400 PSIに近い安定した圧力を示したら、シーケンスの最初の2つのサンプルを実行した後、これらのクロマトグラムのピークに未知の代謝物がないかチェックして、サンプルシーケンスがスムーズに実行されることを確認します。シーケンス内のすべてのサンプルが終了したら、別のコンピューターでデータ解析を実行します。低分子のピークアライメントとフレーム抽出の方法は、市販のソフトウェアで選択してください。次に、lc msの生データをロードし、サンプルタイプに基づいてグループ化します。ランシーケンスの途中にあるサンプルをピークアライメント用のクロマトグラフィー参照サンプルとして選択し、グループを比率グループまたはフルチェンジ計算として選択します。次に、標的代謝物分析のための既知の代謝物を含むフレームシードを、収集されたデータと対応するフレームシードとともにアップロードします。次に、ポジティブモードまたはネガティブモードのいずれかでフルスペクトルスキャンを選択し、このデータ処理ファイルを生データと同じフォルダに保存します。データベース検索機能をオフにして、ワークフローを実行します。次に、プロセスデータを各フレームのピーク面積を含むExcelシートとしてエクスポートします。ノンターゲット代謝物分析には、成分抽出の方法を選択してください。サンプルの生データと、バックグラウンド減算用の 3 つの空白サンプルを読み込みます。このグループに続いて、生データと参照サンプルを前述のように設定します。コンポーネントのしきい値を 10 から 5 番目に設定します。ヒトメタボロームデータベースを使用して、未知の化合物を同定します。この処理ファイルを保存した後、データベース検索機能をオフにしてワークフローを開始してください。データ処理が終了したら、変動係数またはCVフィルターを使用して、反復サンプルと強度フィルター内のCVが大きい成分を除去します。ノイズレベルで検出された成分を手動で除去するには、各成分を調べて、データベース検索のために、明確に定義されたピークまたは異なるサンプルタイプで比較的大きな違いがあるものを選択します。最後に、データベース内のヒットを含むデータをエクスポートします。メタボロミクスデータの精度は、lc QEMS装置の性能に大きく依存し、装置が良好な状態で動作しているかどうか、および適用された方法が適切であるかどうかを評価します。ここに示すように、いくつかの既知の代謝物 lc ピークが全イオンクロマトグラフィーから抽出されます。アミノ酸、解糖系、中間体、TCA、中間体ヌクレオチド、ビタミンA、TPおよびNADPなどの極性代謝物は、現在のlc条件下でカラム上で良好な保持および良好なピーク形状を示します。一方、質量誤差試験は、図に示すように、低質量校正後24時間以内に行われます。ここでは、検出された質量電荷比を、標的代謝物の理論上の質量電荷比と比較することにより、質量誤差を評価します。ここで、標的代謝物の質量電荷比は74〜744の範囲です。ここでのY軸は、特定の質量誤差範囲内の代謝物の累積パーセンテージを表しています。青色の曲線は0時間から12時間後の結果を示し、赤色の曲線はキャリブレーション後12時間から24時間後に収集されたデータを示しています。代謝物の90%以上が5ppmの質量誤差内にあるため、ここで開発された低質量範囲のキャリブレーション法は、低質量範囲の検出で5ppmの質量誤差を維持するのに十分であることを意味します。対処すべきもう一つの問題は、現在の方法と装置のセットアップに対する装置の感度です。10 cmのペトリ皿から三重サンプルの段階希釈を5回行い、希釈係数を6にすると、6つの異なる濃度のサンプルが得られました。ターゲットリストは、サンプルの異なる濃度で検出される代謝物の数を評価するために使用されます。ここで示す結果は、検出される標的代謝物の最適な数は、6つの細胞に対して10の2.78倍から5番目の細胞から10の1.67倍の間であり、一方、7つの細胞の1倍10倍では、イオン抑制効果による代謝物の検出数が少なくなることを示しています。この結果は、この分析で抽出する最適な細胞量が、おおよそ6ウェルプレートのウェル量であることを示しています。ノンターゲット代謝物分析では、CVカットオフを20%、平均強度値を10から7番目に設定して、成分テーブルのフィルタリングを行います。CVカットオフ値は増やすことができますが、平均強度値を減らす必要があります より多くのピークを含めるために ピークを手動でチェックした後、良好な形状の成分が選択され、ヒトメタボロームデータベースで検索されます。ポジティブ モードで収集されたデータの結果がここにリストされ、ネガティブ モードの結果がここにリストされます。ここで同定された代謝物の一部は、グルタチオンやプロリンなど、標的リスト内の代謝物と重複しています。解糖系に由来するメチルグリオキサールや、ポジティブモードで3.2分の保持時間で検出される1つのpto、2つのELE SNグリセロール、3つのホスホコリンなど、標的リストにない追加の代謝物も調査されます。このビデオを見れば、培養されたSARSからポリ代謝物を抽出する方法と、RC QESを使用してさまざまなサンプルの相対代謝レベルを測定する方法について十分に理解できるはずです。ご視聴いただきありがとうございました。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

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敏感な、大規模定量的メタボロームのための戦略

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