敏感な、大規模定量的メタボロームのための戦略

この手順の全体的な目標は、培養細胞の代謝プロファイリングを研究することです。これは、最初に細胞から極性代謝物を抽出することによって達成されます。2番目のステップは、細胞抽出物を水中で再構成し、サンプルをlcバイアルに移すことです。

次に、サンプルをキャリブレーションしたlc QE MS装置に注入し、最終ステップで生データをコンピューターに記録します。市販のソフトウェアを使用して生データから代謝物のピークを抽出し、未知なるピークを高分解能質量データベースに対して検索します。このマスターは、SARSの相対的な代謝物レベルに関する洞察を提供することができますが、血清や組織などの他のシステムにも適用できます。

まず、移動相 A 500 ミリリットル(20 ミリモル酢酸アンモニウム)と 15 ミリモルの水酸化アンモニウムを 3% アセト、ニトリル、および水に調製します。ボトルを緩くキャッピングした後、加熱せずに10分間水浴で溶液を超音波処理します。これに続いて、5ミリグラムのフルオロ酢酸ナトリウムと酸の両方を5ミリリットルの水に溶解して、1ミリリットルあたり1ミリグラムの最終濃度にします。

次に、ジアジノンをメタノールに溶解して、1ミリリットルあたり10マイクログラムの最終濃度にします。1ミリリットルのネガティブ低質量キャリブレーション溶液を調製するには、960マイクロリットルのサーモネガティブキャリブレーション溶液と20マイクロリットルのフルオロ酢酸ナトリウムおよびホモバニリン酸溶液を混合します。1ミリリットルの正の低質量較正溶液を作るには、990マイクロリットルのサーモポジティブ校正溶液と10マイクロリットルのダイアジノン溶液を混合します。

ポジティブモードで標準質量校正を行った後、装置のコントロールパネルでスキャン範囲を60〜900質量対電荷比に調整し、25電子ボルトのソース衝突誘起解離を適用します。カスタマイズしたキャリブレーションイオンを入力し、イオン源が安定したら、チューニングページでカスタマイズしたキャリブレーションを開始します。ネガティブモードで標準質量校正を行った後、極性をネガティブモードに切り替え、機器のコントロールパネルでスキャン範囲を60〜900質量対電荷比に調整し、35電子ボルトのソース衝突誘起解離を適用します。

カスタマイズされたキャリブレーションイオンを入力し、イオン源が安定したら、カスタマイズされたキャリブレーションを開始します。チューニングページでは、QE MS装置に加熱式エレクトロスプレーイオン化プローブまたはHESIプローブをレベルCに固定し、窒素ガス入口、気化器ケーブル、電圧ケーブルに接続して装備します。コンピューターのチューニングページで、プローブに関連するチューニングパラメーターを設定します。

キャピラリー温度を320°Cに、Sレンズを55°Cに設定します。次に、メソッド・プログラムで、次の値を使用してフル・スキャン・メソッドを作成します。線形グラジエント情報を入力してクロマトグラフィー法を確立します。

室温での化合物分離には、amidカラムを使用してください。この時点で、50ミリリットルに40ミリリットルのメタノールと10ミリリットルの水を手動で混合して抽出溶媒を準備します。2。以前に大腸がんH CTを培養すると、8つの細胞が80%のコンフルエントに達します。

培地を素早く吸引し、6ウェルプレートをドライアイスの上に置きます。次に、すぐに各ウェルに1ミリリットルの抽出溶媒を加え、プレートをマイナス80°Cの冷凍庫に移します。プレートを冷凍庫から取り出した後、15分後、ドライアイスの上に置き、細胞を溶媒にこすり落とします。

各ウェルから溶液を3本の1.7ミリリットルのeinorチューブに移し、サンプルをGの20, 000倍の速度で摂氏4度で10分間遠心分離します。遠心分離後、上清を2つの新しいeinorチューブに移します。その後、サンプルをスピードバキュームで乾燥させます。

サンプルが乾いたら、マイナス80°Cの冷凍庫に保管します。分析のためにサンプルを冷凍庫から取り出した後、氷温に達するまで待ちます。次に、20マイクロリットルの氷冷水を加え、サンプルをボルテックスして代謝物を溶解します。

次に、サンプルを摂氏4度でGの20, 000倍で遠心分離します。2分間、SUPERNATをlcバイアルに移し、分析のためにlc QES装置に5マイクロリットルのサンプルを注入します。QE MS装置でキャリブレーションを適切に実施したら、0.15 mL/分の流速で移動相Bの85%でlcカラムを5分間平衡化します。

次に、サンプルシーケンスをランダムな順序で設定して、LCMSによってもたらされる変動を各サンプルに分散させ、異なるサンプル間のより正確な比較を確保します。6つのサンプルごとに、ウォッシュランを追加し、続いてブランクサンプルを追加して、システムのバックグラウンドとキャリーオーバーレベルを評価します。シーケンスを保存し、シーケンスの実行を開始します。

lcカラムが400 PSIに近い安定した圧力を示したら、シーケンスの最初の2つのサンプルを実行した後、これらのクロマトグラムのピークに未知の代謝物がないかチェックして、サンプルシーケンスがスムーズに実行されることを確認します。シーケンス内のすべてのサンプルが終了したら、別のコンピューターでデータ解析を実行します。低分子のピークアライメントとフレーム抽出の方法は、市販のソフトウェアで選択してください。

次に、lc msの生データをロードし、サンプルタイプに基づいてグループ化します。ランシーケンスの途中にあるサンプルをピークアライメント用のクロマトグラフィー参照サンプルとして選択し、グループを比率グループまたはフルチェンジ計算として選択します。次に、標的代謝物分析のための既知の代謝物を含むフレームシードを、収集されたデータと対応するフレームシードとともにアップロードします。

次に、ポジティブモードまたはネガティブモードのいずれかでフルスペクトルスキャンを選択し、このデータ処理ファイルを生データと同じフォルダに保存します。データベース検索機能をオフにして、ワークフローを実行します。次に、プロセスデータを各フレームのピーク面積を含むExcelシートとしてエクスポートします。

ノンターゲット代謝物分析には、成分抽出の方法を選択してください。サンプルの生データと、バックグラウンド減算用の 3 つの空白サンプルを読み込みます。このグループに続いて、生データと参照サンプルを前述のように設定します。

コンポーネントのしきい値を 10 から 5 番目に設定します。ヒトメタボロームデータベースを使用して、未知の化合物を同定します。この処理ファイルを保存した後、データベース検索機能をオフにしてワークフローを開始してください。

データ処理が終了したら、変動係数またはCVフィルターを使用して、反復サンプルと強度フィルター内のCVが大きい成分を除去します。ノイズレベルで検出された成分を手動で除去するには、各成分を調べて、データベース検索のために、明確に定義されたピークまたは異なるサンプルタイプで比較的大きな違いがあるものを選択します。最後に、データベース内のヒットを含むデータをエクスポートします。

メタボロミクスデータの精度は、lc QEMS装置の性能に大きく依存し、装置が良好な状態で動作しているかどうか、および適用された方法が適切であるかどうかを評価します。ここに示すように、いくつかの既知の代謝物 lc ピークが全イオンクロマトグラフィーから抽出されます。アミノ酸、解糖系、中間体、TCA、中間体ヌクレオチド、ビタミンA、TPおよびNADPなどの極性代謝物は、現在のlc条件下でカラム上で良好な保持および良好なピーク形状を示します。

一方、質量誤差試験は、図に示すように、低質量校正後24時間以内に行われます。ここでは、検出された質量電荷比を、標的代謝物の理論上の質量電荷比と比較することにより、質量誤差を評価します。ここで、標的代謝物の質量電荷比は74〜744の範囲です。

ここでのY軸は、特定の質量誤差範囲内の代謝物の累積パーセンテージを表しています。青色の曲線は0時間から12時間後の結果を示し、赤色の曲線はキャリブレーション後12時間から24時間後に収集されたデータを示しています。代謝物の90%以上が5ppmの質量誤差内にあるため、ここで開発された低質量範囲のキャリブレーション法は、低質量範囲の検出で5ppmの質量誤差を維持するのに十分であることを意味します。

対処すべきもう一つの問題は、現在の方法と装置のセットアップに対する装置の感度です。10 cmのペトリ皿から三重サンプルの段階希釈を5回行い、希釈係数を6にすると、6つの異なる濃度のサンプルが得られました。ターゲットリストは、サンプルの異なる濃度で検出される代謝物の数を評価するために使用されます。

ここで示す結果は、検出される標的代謝物の最適な数は、6つの細胞に対して10の2.78倍から5番目の細胞から10の1.67倍の間であり、一方、7つの細胞の1倍10倍では、イオン抑制効果による代謝物の検出数が少なくなることを示しています。この結果は、この分析で抽出する最適な細胞量が、おおよそ6ウェルプレートのウェル量であることを示しています。ノンターゲット代謝物分析では、CVカットオフを20%、平均強度値を10から7番目に設定して、成分テーブルのフィルタリングを行います。

CVカットオフ値は増やすことができますが、平均強度値を減らす必要があります より多くのピークを含めるために ピークを手動でチェックした後、良好な形状の成分が選択され、ヒトメタボロームデータベースで検索されます。ポジティブ モードで収集されたデータの結果がここにリストされ、ネガティブ モードの結果がここにリストされます。ここで同定された代謝物の一部は、グルタチオンやプロリンなど、標的リスト内の代謝物と重複しています。

解糖系に由来するメチルグリオキサールや、ポジティブモードで3.2分の保持時間で検出される1つのpto、2つのELE SNグリセロール、3つのホスホコリンなど、標的リストにない追加の代謝物も調査されます。このビデオを見れば、培養されたSARSからポリ代謝物を抽出する方法と、RC QESを使用してさまざまなサンプルの相対代謝レベルを測定する方法について十分に理解できるはずです。ご視聴いただきありがとうございました。