綿密かつ有益な代謝解析のための複数の代謝化合物のクラスを回復するために多段階調製技術

メタボロミクス実験の結果の信頼性は、試料調製の有効性及び再現性に依存する。その後、数千の化合物まで分析すること、または関心のあるだけの化合物クラスのオプションを使用して生体液からの代謝物の抽出を可能にし、厳格かつ徹底的な方法について説明する。

この手順の全体的な目標は、メタボロームのカバレッジを改善するための簡略化されたサンプルを取得するために、複雑な体液中の代謝物を分画する効果的な手段を実証することです。これは、まず各サンプルに内部標準物質を添加して、サンプル調製と装置条件の再現性をモニターすることで達成されます。2番目のステップは、氷冷メタノールを各サンプルに添加してタンパク質を沈殿させることで、そうしないとその後のクロマトグラフィーや質量分析による分析に支障を

次に、液体抽出ステップで親水性代謝物と疎水性代謝物を分離します。最後のステップは固相抽出で、脂質代謝物をさらにリン脂質、脂肪酸、中性脂質に分画します。最終的に、この組み合わせた多段階分析法を使用して、血漿メタボロームの効果的な分離、優れた再現性、およびカバレッジの向上を示します。

この手法は、単純なメタノール抽出などの既存の方法と比較した場合の主な利点として、メタボロミクスプロファイリング研究を実施する場合や脂質が特に関心を持つ場合に重要な、特に脂質の代謝物カバレッジが向上することです。タンパク質を沈殿させる前に、まずサンプルを室温まで解凍してサンプルを調製します。次に、事前に調製した内部標準ISTDをサンプルにスパイクします。

すべての標準濃度は、使用する MS および HPLC 装置の感度に基づいて必要に応じて調整されています。分析のために、各サンプルに10マイクロリットルをスパイクします。親水性標準液と疎水性標準液のそれぞれに、1 x 2 x または 4 x ポジティブコントロール溶液のいずれかの 10 マイクロリットルを各サンプルにスパイクします。

すべてのサンプルに内部標準液とポジティブコントロール溶液をスパイクした後、各サンプルを10秒間ボルテックスします。タンパク質の沈殿を開始するには、各サンプルに400マイクロリットルの氷冷メタノールを追加します。チューブあたり10秒間渦巻き、摂氏0度で15分間、18, 000回遠心分離します。

G、タンパク質ペレットはチューブの底に形成されるべきです。遠心分離後、すべての上清を新しいガラス培養チューブに移し、窒素下で乾燥させます。この乾燥した残留物は、後で液体の抽出を受けます。

タンパク質ペレット画分の分析のために、1ミリリットルのメチルタートビートルエーテルまたはMTBEを白色またはオフホワイトのタンパク質ペレット渦に1本のチューブあたり30秒間加え、摂氏0度で15分間18, 000回遠心分離します。MTBE層を新しいガラス培養チューブにGデカントします。ペレットのサイズはサンプルによって異なるため、すべてのサンプルで同じ量のMTBEを一貫して吸引することが重要です。

たとえば、上清の量が最も少ないサンプルに対して 900 マイクロリットルのみをデカントできる場合は、900 マイクロリットルをデカントします。すべてのサンプルについて、さらに1ミリリットルのMTBEをタンパク質ペレットのボルテックスに30秒間加え、その後、摂氏0度または15分間遠心分離します。前と同じように 18 、 000 倍の G を MTBE 層を吸引し、前に準備したガラス培養チューブに加えます。

窒素流でサンプルを乾燥させ、200マイクロリットルの1対1のクロロホルムメタノールに再懸濁します。遠心分離管に各サンプルを移し、摂氏0度で18、000回G.Afterで15分間遠心分離し、ガラスピペットを使用して上清をオートサンプラースクリューキャップバイアルに移します。この手順を開始するには、ガラスピペットを使用して、以前に調製した乾燥メタノール残渣に3ミリリットルのMTBEを加え、30秒間ボルテックスします。

その後、各チューブに750マイクロリットルの水を加え、10秒間渦巻きます。室温で約200倍のGで10分間遠心分離すると、2つの異なる層が見えます 遠心分離後、下の水性層をピペッティングせずに、上部のMTBE層の2.5ミリリットルを慎重に吸引し、きれいなガラス培養に移します。2。各サンプルの残りの水部分に3ミリリットルのMTBEを追加します。

そして、チューブあたり10秒の渦巻きでGの約200倍で10分間遠心分離します。室温で、水を得ずに3ミリリットルのMTBEを吸引し、前のMTBEチューブと組み合わせます。このMTBE画分は、後で固相抽出を受けます。

残りの水層を窒素下で乾燥させて濃縮します。1の100マイクロリットルで残渣を再懸濁し、各チューブの渦に氷冷メタノールの400マイクロリットルを追加し、次にマイクロ遠心分離管に移します。摂氏マイナス80度で20〜30分間放置し、残りのタンパク質がメタノール中に沈殿するのを待ちます。

次に摂氏0度で15分間遠心分離し、Gの18,000倍で、遠心分離後にチューブの側面に沿って沈殿物が沈殿物を吸引せずに450マイクロリットルの上清を吸引し、きれいなマイクロ遠心分離管に移す必要があります。45°C以下の真空遠心濃縮器で約1〜2時間完全に乾燥させます。乾燥した上清を200マイクロリットルの5%アセチルニトリル水とボルテックスに再懸濁します。.

サンプルを自動車、サンプラー、バイアルに短時間移し、マイナス80°Cで凍結します。固相抽出の手順を開始するには、以前に得られたMTBE画分を、摂氏35度から15度の窒素の良好な流れ下で10〜15分間乾燥させます。MTBEフラクションが完全に乾いたら、窒素の流れを止め、ガラスピペットボルテックスを使用して各サンプルを1ミリリットルのクロロホルムにすばやく再懸濁します。

固相抽出カートリッジまたはSPEカートリッジを400マイクロリットルのヘキサンで2回短時間洗浄し、コンディショニングします。廃棄物を捨てて、新しいガラス収集チューブと交換してください。サンプルをSPEカラムに加え、真空を適用してフロースルーを収集します。

ガラスピペットを使用して、2〜1個のクロロホルムイソプロピルアルコール1ミリリットルをSPEカラムに加え、同じガラス管に流れを回収します。これが中立分数です。中性画分を窒素下で10〜15分間乾燥させます。

ガラスピペットで酸化を最小限に抑えるには、1ミリリットルの5%酢酸含有エチルエーテルをSPEカラムに加え、フロースルーを回収します。これが脂肪酸画分です。脂肪酸画分を窒素下で10〜15分間乾燥させ、プラスチックチップを使用して酸化を最小限に抑えます。

SPEカートリッジに800マイクロリットルのメタノールを加え、15ミリリットルのプラスチック円錐管で流れを回収すると、これがリン脂質画分です。リン脂質画分を1.5ミリリットルの遠心分離管に移し、45°Cの真空遠心濃縮器でサンプルを約1〜1.5時間乾燥させます。最後に、reusは、100%メタノールの200マイクロリットルの3つの画分からサンプルのそれぞれを懸濁し、自動車、サンプラー、バイアルに移し、マイナス80°Cの冷凍庫に保管します。

脂質標準物質および内因性代謝物の両方の抽出におけるM-T-B-E-S-P-E法の有効性は、定性的および定量的ソフトウェアを使用して特徴の数を比較した場合、メタノール抽出またはMTBE抽出などの他の方法と比較して、代謝産物のより良い抽出およびカバレッジが全体的に良好であることが実証されています。lc MS 分析後、M-T-B-E-S-P-E フラクションの比較では、SPE 後の 3 つのフラクション間の重複が最小限に抑えられ、疎水性代謝物をそれぞれの化学クラスに分離する効率が実証され、代謝物の同定がより確実になりました。さらに、M-T-B-E-S-P-E法(NR 12)を用いた画分中の内部標準試料の回収は、内部標準物質がそれらの化学クラスに関連する画分に言及されていることを実証しました。

データのクロマトグラフィー再現性を評価するために、3 つの別々のプール血漿 QC サンプルに対してサンプル調製を行い、各サンプルを LCM MSS 装置に 3 回ずつ注入しました。一貫したオーバーラップにより、装置とサンプル調製の再現性が実証されます。脂肪酸画分の負イオン化モードで観察されるケミカルノイズの増加は、LCM S溶媒中の汚染物質が原因である可能性があります。

したがって、9分前に言及した代謝物のみが分析されました。.クロロホルム、MTBE、エチルエーテル、さらにはこの方法で使用される一般的な試薬の取り扱いは非常に危険であり、この手順を実行する際には、白衣、手袋、目の保護具を着用したり、ドラフトでサンプル調製を行うなどの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。