ホールマウントラット網膜における免疫組織化学的およびカルシウムイメージング法

この手順の全体的な目標は、カルシウム指示色素の視神経断端注射を介して、マウント全体の調製物中の網膜神経節細胞を選択的に標識することです。これは、最初に、フローフォーのような非常に親和性の高いカルシウム指示染料を視神経断端に注入することによって達成されます。次に、網膜をアイカップから分離し、スライドガラスに取り付けるために象限に分割され、生理学的条件を模倣するように設定された記録チャンバー内で、カルシウム信号への電位依存性カルシウムチャネルの寄与を

網膜神経節では、チャネルブロッカーを使用して脱分極細胞で細胞を測定できます。最終的に、この結果は、高カリウム誘発カルシウムシグナルなどの信号に対する電圧教育カルシウムチャネルの寄与の半定量的測定を提供できます。エレクトロポレーションやバルクローディングなどの既存の方法に対するこの技術の主な利点は、全マウント調製で網膜神経節細胞とその軸索を選択的に標識する能力であり、ラッドアイを解剖し、照準媒体または同様の溶液を冬眠させます。

さて、カルシウムイメージング実験を行う予定がある場合は、網膜神経節細胞をフロー4で埋め戻します。0.5マイクロリットルの40ミリモルフロー4ペンタカリウム塩を注入し、水中で視神経に再構成し、眼球の約1ミリメートル後方に切り株を注入します。眼球を哺乳類のリンガーに移します。

95%の酸素、5%の二酸化炭素、または室温で1時間泡立てます。準備は暗闇に保管してください。光の強度を制御した顕微鏡で目を解剖します。

カミソリの刃を使って、眼球の前面に小さな切開をそっと行い、角膜を取り除きます。次に、鉗子を使用してレンズを内側の網膜表面から取り外します。強膜をしっかりと保持します。

他の鉗子で硝子体を取り外すときは、硝子体基部を網膜の中心に向かってそっと剥がします。Iカップと呼ばれる得られた調製物は、免疫組織化学ホールマウント調製物、カルシウムイメージング調製物、または横方向の網膜切片用に調製して免疫組織化学ホールマウント調製物を調製することができる。まず、網膜が平らになるように網膜に4つの切り込み

網膜をガラスカバースライドに置き、神経節細胞層を下に向けて置きます。次に、網膜に溶液を一滴加え、必要に応じてセルロース濾紙で覆い、ブラシまたは鉗子で網膜を平らにします。第三に、網膜が完全に平らになり、濾紙に剥がれたら、それを溶液に戻します。

最初に調製物を処理するには、調製物を4%パラホルムアルデヒドに10〜15分間移します。次に、網膜をpH 7.4の0.1モルリン酸緩衝液で3回、1回の洗浄につき30分間、合計90分間洗浄します。次に、網膜を500マイクロリットルのブロッキング溶液で摂氏4度で一晩インキュベートします。

この溶液は、5%正常ヤギ血清またはロバ血清をリン酸緩衝液に0.3%トリットンおよび0.1%アジ化ナトリウムで、次の5〜7日間で、一次抗体溶液中で網膜を摂氏4度でインキュベートします。このソリューションの構成は、経験的に到達する必要があります。固定剤を洗い流したのと同じように、一次抗体溶液を洗い流します。

次に、網膜を二次抗体に1〜1000の濃度で一晩、摂氏4度でインキュベートします。さらに3回の洗浄とリン酸緩衝液で二次抗体を除去します。次に、視覚化のために網膜をマウントし、マニキュアで密封します。

これらのスライドは、摂氏4度の暗闇で保管する必要があります。まず、リンガーのIカップからカルシウムイメージングホールマウント調製を行います。まず、網膜組織を象限に切ります。

神経節層を上に向けて、したがって視細胞層を下に向けて、記録チャンバー上に1つの象限を平らに置きます。キムワイプで周囲を注意深く乾かし、油を塗ったハープをティッシュにそっと置きます。次に、レチナール準備をリグにロードし、8チャンネルの重力駆動超融合システムのセットアップを終了します。

ハープを配置した後、取り付けられた網膜が動く場合は、ハープを慎重に取り外して清掃してください。網膜の周囲を乾かし、ハープスーパーを再度取り付けます。記録チャンバーを哺乳類のリンガー溶液と融合し、溶液を95%の酸素、5%の二酸化炭素で連続的に泡立て続けます。

まず、薬物を使用しないコントロールとして、3ミリモルから60ミリモルまでの2対の高カリウムパルスを33秒間実行します。脱分極すると、RGCは、調製が機能している場合、電位依存性カルシウムチャネルを活性化する必要があります。次に、実験を進めます。

ニフェジピンおよびL型電位依存性カルシウムチャネルブロッカーは、脱分極誘発カルシウムシグナルコバルトに対するL型電位依存性カルシウムチャネルの寄与を評価するために一般的に使用されます。非特異的カルシウムチャネルブロッカーは、電圧依存性カルシウムチャネルを選択的に非ブロックするために使用できます。5秒ごとに調製物をスキャンして、蛍光RGCの画像を視覚化して取得します。

レーザー出力はできるだけ低くしてください。励起は488ナノメートルに設定し、発光は505ナノメートルのLPフィルターで収集する必要があります。記載されたプロトコルを使用して、免疫標識を、複数のスプライシングフローを有するRNA結合タンパク質である神経節細胞タンパク質R-B-P-M-Sに対して行った。4。

染色は、抗体の仕様に基づいて、実際に神経節細胞に限定されていました。次に、RGCのカルシウムシグナルに対する電位依存性カルシウムチャネルの寄与を、rgcから取得した蛍光強度値を用いて調べました。ベースラインレベルでは、RGCおよびRGC軸索はフロー4で標識されていることがわかります。

蛍光強度値を取得するために、ROIを神経節細胞、体腫、および/または軸索に配置しました。高カリウムを全マウント調製物に適用した後、RG C'Sの蛍光シグナルが増加しました。これに続いて、2回目の高カリウムパルス中にコバルトの存在下で蛍光強度値が減少しました。

このビデオを見れば、全マウント調製で網膜神経節細胞に合成カルシウムインジケーターダイを選択的にロードする方法を十分に理解できるはずです。