集束イオンビームを用いて低温電子顕微鏡標本の準備
2014年7月26日
クライオ電子顕微鏡、走査型（SEM）のいずれか、または送信（TEM）は、広く高含水率1を有する生物学的試料または他の材料の特徴付けのために使用される。 SEM /集束イオンビーム（FIB）は、試料中の関心対象の特徴を識別し、クライオTEMへの転送のために薄い電子透過性のラメラを抽出するために使用される。
この手順の全体的な目標は、極低温凍結したバルクサンプルから集束イオンビームラメラを抽出することにより、クライオTEM用のサンプルを調製することです。これは、最初にサンプルを液体窒素で凍結し、クライオ集束イオンビームSEM内にマウントすることで達成されます。第2ステップは、イオンビームで薄いLA Meloを切り取り、冷却されたナノマニピュレータを使用してTEMグリッドに転写することです。
次に、TEMグリッドは、トランスファーステーションのSEMホルダーからTEMホルダーに転送されます。最後のステップは、TEMホルダーをクライオTEMに移してさらに分析することです。最終的に、クライオTEMは、抽出されたラメラの高解像度画像、トモグラハムス、またはX線マップを表示するために使用されます。
この技術により、透過型電子顕微鏡では、光学顕微鏡や走査型電気顕微鏡などの他の顕微鏡で分析する場所をあらかじめ選択することで、ソフトマターを究極の分解能で分析することが可能となります。この手法がMac cryo Microtomyのような既存の方法よりも優れている主な点は、サンプルの圧縮やデフ形成などの調製アーチファクトが回避されることです。まず、集束イオンビーム試料用のTEMグリッドを2枚取り付けます。
SEMトランスファーホルダーで、対応するネジをドライバーで締めてグリッドを固定し、シャッターを閉じて、試料に適したサンプルスタブを取り付け、試料の一部を追加します。たとえば、ピペットを使用して、平らなスタブに液滴を堆積させます。次に、SEMトランスファーホルダーを真空トランスファーデバイスまたはVTDに取り付けます。
スラッシングステーションに液体窒素を加えてポンプダウンした後、ステーションを開いてSEMトランスファーホルダーを再びプランジフリーズし、沸騰が完了してスラッシュが再び得られるまでポンプダウンします。次に、SEMトランスファーホルダーをVTDの真空チャンバーに引っ込めて密封します。スラッシングステーションとクライオ準備チャンバーエアロックをベントします エアロック 外側のエアロックをベントします。
次に、VTDシールをクライオ調製チャンバーとポンプのエアロックに合わせます。良好な真空レベルに達したら、エアロックピンを測定して、VTDと外側のエアロックのシールを開きます。次に、SEMトランスファーホルダーを挿入します。
これに続いて、コールドナイフを使用してTEMグリッドスロットの保護蓋を開きます。集束イオンビームSEMのハイテンションをオフにし、インナーエアロックを開きます。次に、VTDを使用してSEMホルダーをサンプルチャンバーに移します。
SEMホルダーがコールドステージになったら、押して回転させてVTDを外します。VTDロッドをVTD真空チャンバー内に完全に引っ込め、内側のエアロック、外側のエアロック、およびVTDシールを閉じます。この時点で、前駆体ガスを摂氏24〜26度に加熱し、ガス注入システムまたはGISニードルをサンプル表面から約1ミリメートルの高さに配置します。
電子ビームでイメージングしながら、ガスバルブを数秒間開きます。次に、1000ピコアンペアのイオンビームを低倍率で使用して、関心領域またはROIにわたって堆積物を硬化させます。硬化後、サンプルを52度傾けて、表面がイオンビームに対して垂直になるようにします。
ミルアウェイ。2つのテロリストの塹壕。ROIの両側でサンプルを0度に傾け、イオンビームを使用してラメラの側面と下側を切り取り、カットマークがラメラ全体を通過するようにします。
GIS針が挿入されたら、ナノマニピュレータを、その先端がラメラに物理的に接触するまで、できれば側面で操作します。GISバルブを数秒間開き、電子ビームによる連続イメージングによりクライオ堆積を監視します。さらに1〜2マイクロメートルの白金層を凍結堆積させた後、ナノマニピュレータがラメラと接触している点の周りの数マイクロメートルでのみ白金を硬化させた後、バルブを閉じます。
次に、高イオンビーム電流を使用してラメラを切断します。ナノマニピュレーターを慎重に操作して、トレンチからラメラを抽出し、サンプル表面から少なくとも500マイクロメートル上に移動します。針を引っ込めた後、サンプルステージを数ミリメートル下げ、TEMグリッドの1つが見えるまで動かします。
グリッド上のアタッチメント領域を作業位置に移動し、GIS針を挿入します。次に、ナノマニピュレータを慎重に操作して、付着したラメラをTEMグリッド上の付着領域に物理的に接触させ、ガスバルブを数秒間開き、さらに1〜2マイクロメートルの白金層を凍結堆積させますラメラとTEMグリッドとの接触点の周りの数マイクロメートルで白金を硬化させます。次に、高イオンビーム電流を使用して、ナノマニピュレーターからラメラを切断します。
サンプルを52度に傾け、イオンビームを使用して電子透過性まで薄くします。クライオトランスファーステーションを乾燥窒素ガスで洗い流した後、クライオトランスファーTEMホルダーをクライオトランスファーステーションの適切なスロットに挿入し、液体窒素を充填します。これに続いて、ドライバー、TEMサンプルクランプツール、ピンセットを液体窒素で満たされた極低温カップに浸し、先端を所望の温度に冷却します。
VTDが外側のエアロックに一致したら、コールドステージをトランスファー高さ16mmにします。ハイテンションを切った後、VTDシール、アウターエアロック、インナーエアロックを開けます。次に、VTDロッドを使用して、時計回りに押して回転させることにより、SEMトランスファーホルダーにロックします。
この時点で、SEMトランスファーホルダーをクライオ調製チャンバーに引っ込めます。コールドナイフを使用して、TEMグリッドの保護蓋を閉じます。次に、VTDロッドを使用してサンプルをVTDの真空チャンバーに移動し、エアロックを閉じてシールします。
次に、外側のエアロックをベントし、VTDを取り外します。VTDをクライオトランスファーステーションのSEMポートに一致させます。乾燥窒素で洗い流しながら、ステーションのピンを使用してVTDのシールを開き、SEMトランスファーホルダーをクライオトランスファーステーションの実行者にスライドさせます。
冷却されたドライバーを使用して、蓋の1つを開き、対応するネジを緩め、TEMグリッドを所定の位置に保ちます。次に、TEMグリッドを手に取り、冷却されたピンセットを使用してTEMホルダーに配置します。これに続いて、TEMグリッドをTEMホルダーに固定します。
冷却された六角リングを使用して、クライオトランスファーTEMホルダーのシャッターを閉じ、クライオトランスファーステーションをポンピングシステムから切り離します。TEMホルダーのステーションとヒーターコントローラーをTEMの近くに輸送し、再接続します。TEM 試料段をマイナス 70 度の傾きに設定します。
次に、エアロックのポンピング時間を最短に設定し、乾燥窒素ガスによるパージを1サイクルのみ行います。クライオトランスファーステーションからTEMホルダーを取り外し、傾斜ゴニオメーターの第1ステージに挿入すると、ポンピングサイクルが開始されます。サイクルが完了したら、TEMホルダーを保持したままゴニオメーターを0度まで傾けて、ゴニオメーターと一緒に回転しないように設定します。
次に、ホルダーをゴニオメーターを通してTEM内に完全に挿入します。最後に、クライオトランスファーTEMホルダーに液体窒素を補充します。この方法では、アスペルギルス・ニジェールの胞子を最初にSEMで画像化して抽出部位を特定します。
胞子の断面積で十分ですが、細胞膜から特定の距離で特定の細胞をスライスするために、サブマイクロメートルの精度で抽出用のROIを配置することができます。目的の特徴が特定されたら、クライオ堆積の最初のステップが実施されます イオンミリング中のビーム損傷からサンプルを保護するために、サンプルを52度に傾け、続いてメラの両側にある2つのトレンチをスパッタリングします。次に、サンプルを後ろに傾けてさらに粉砕し、バルクに接続する2つの小さなブリッジのみを残します。
冷却されたナノマニピュレータをメラに接触させ、白金の別のクライオ堆積物がそれらを一緒にはんだ付けします。小さな接続ブリッジはフライス加工され、ナノマニピュレーターはラメラをTEMグレードの取り付け領域の近くに移動し、そこでプラチナの最終的なクライオ堆積ではんだ付けされます。次に、ナノマニピュレータは、電子透過性まで薄いラメラから分離されます。
イオンビームにより、ラメラはTEMに移され、高解像度のイメージング分光法、断層撮影、およびその他の技術を採用できます。この方法は、ニューロプローブや骨インプラントなどのシステムにおける心臓のソフトマター界面の理解に貢献します。このビデオを見れば、アーティファクト3であり、バグサンプルの特定の領域からサブマイクロメートルの精度で抽出できるクライオTMサンプルの調製方法について十分に理解できるはずです。
概要
本記事では、集束イオンビーム（FIB）技術を用いて、クライオ透過電子顕微鏡（cryo-TEM）用の生物学的試料を調製する手順について詳しく解説します。この手法により、試料調製のアーティファクトを最小限に抑えながら、ソフトマターの高解像度イメージングが可能になります。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- バイオイメージング
- クライオ電子顕微鏡法
背景
- クライオ電子顕微鏡は、生物学的試料の解析に不可欠です。
- 集束イオンビーム（FIB）法により、クライオ透過電子顕微鏡（cryo-TEM）用の試料調製を効率化できます。
- 正確なイメージングには、アーティファクトを最小限に抑えることが極めて重要です。
- この手法を用いることで、他の顕微鏡技術を用いて解析部位を事前に選定することが可能です。
研究の目的
- cryo-TEM用の試料調製における信頼性の高い手法を確立すること。
- 軟らかい生物学的材料の高解像度イメージングを実現すること。
- 結果を歪ませる可能性のある調製上のアーティファクトを回避すること。
使用した手法
- 液体窒素を用いた試料のプランジ凍結。
- 集束イオンビームを用いた薄いラメラの切り出し。
- 冷却ナノマニピュレーターを用いたラメラのTEMグリッドへの転移。
- cryo-TEMを用いた高解像度イメージングおよび解析。
主要な結果
- イメージングに向けたラメラの抽出および転送の成功。
- クライオTEMの高解像度イメージング能力の実証。
- 従来の手法と比較して、試料作製時のアーチファクトを最小限に抑制。
- ソフトマター構造の詳細な解析を実現。
結論
- 開発された本手法は、cryo-TEM用の試料調製に有効です。
- アーティファクトを低減しつつ、高解像度画像を得ることができます。
- この技術は、神経科学における生物学的試料の解析を向上させます。
よくある質問
産業界における重要性
本手法では、集束イオンビーム（FIB）ミリングを用いて凍結生物試料から薄いラメラを抽出することで、アーティファクトを最小限に抑えた高精度なクライオTEM試料調製が可能になります。関心領域をサブマイクロメートル精度の精度で選択できるため、構造解析における曖昧さが軽減され、早期発見段階におけるターゲットの検証やメカニズムのリスク低減を支援します。このアプローチは、本来の超微細構造を維持し、神経生物学やインプラント材料に関連するソフトマター界面の高解像度イメージングを可能にすることで、後続のワークフローにおける予測の信頼性を向上させます。
バイオ製薬研究開発における戦略的応用
初期探索およびターゲットバリデーション
- 科学的価値：天然状態における細胞内構造を直接視覚化することで、治療仮説の検証を可能にする。
- 運用の価値：標的結合や作用機序の研究を妨げる可能性のある、調製過程でのアーティファクトを低減する。
- 予測的価値：リード候補の評価に不可欠な高忠実度の構造データを提供し、ポートフォリオの選別を支援する。
スクリーニングおよびアッセイの開発
- 科学的価値： 相関光電子顕微鏡法（CLEM）のワークフローに向けて、検証済みの生物学的システムを調製する。
- 運用的価値： スクリーニングキャンペーン全体で再現性のある超微形態解析を行うため、サンプル調製を標準化する。
- 拡張性： ナノスケールの構造検証を必要とする複数の標的クラスにおいて、プラットフォームの再利用を容易にする。
翻訳・前臨床研究
- トランスレーショナルな継続性： モデルシステム間での一貫した超微形態学的評価を可能にすることで、基礎研究から前臨床検証への橋渡しを行います。
- バイオマーカーの整合性： タンパク質複合体や膜ドメインの高解像度マッピングを通じて、トランスレーショナルバイオマーカーの同定を支援します。
- リスク調整後の推進： 標本作製に起因するアーティファクトによる偽陽性を最小限に抑え、進捗判断（go/no-go決定）に有用な情報を提供します。
パイプラインおよびワークフローの統合
この手法は、定量的で再現性のある超微細構造データを提供することで、メカニズムの理解や化合物の評価を可能にし、ターゲットの検証からリード化合物の同定、さらには前臨床研究に至る創薬の連続的なプロセスに統合されます。
- 探索生物学： 細胞構造の部位特異的な解析を可能にすることで、仮説の検証およびパスウェイの解明を支援します。
- スクリーニング： アーティファクトのないサンプルを提供することでアッセイの準備状態を向上させ、信頼性の高い化合物誘導表現型スクリーニングを実現します。
- 分析学： ラメラの厚さ、膜の曲率、タンパク質密度などの定量的測定値を生成し、条件間の比較分析を可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ： 疾患モデルに関連する保存された超微細構造の特徴を通じて、前臨床段階への連続性を確保します。
- エンタープライズ再利用： 複数のプロジェクトやターゲットクラスにわたる構造検証のための、再利用可能な機能として活用できます。
運用および企業への影響
- 科学的価値： 天然の生物学的状態の高解像度イメージングにより、アーチファクトを最小限に抑えた予測信頼性を実現します。
- 運用上の価値： 各研究室におけるクライオサンプルの調製において、標準化、再現性、および拡張性を確保します。
- 戦略的価値： 生物学的解釈の誤りによる後期段階での失敗を低減し、Go/No-Go判断の改善と資本効率の向上を図ります。
- ポートフォリオへの影響： アーチファクトが発生しやすい代用指標ではなく、検証済みの構造データに基づいたリスクベースの優先順位付けを可能にします。
実施上の考慮事項
- クライオ電子顕微鏡、集束イオンビーム（FIB）操作、およびナノ操作技術の専門知識が必要です。
- クライオFIB/SEMシステム、クライオ転送ステーション、および冷却ナノ操作装置へのアクセスに依存します。
- 汚染を最小限に抑えるため、試料ハンドリング、凍結プロトコル、およびグリッド調製に関するチーム間の標準化が必要です。
- 適応上の考慮事項として、試料の種類、グリッドの形状、および異なる生物学的システムに対するイオンビームパラメータが挙げられます。
- 実用上の制限として、ラメラの抽出および転送時の汚染を避けるための、スキルに依存するハンドリング操作があります。
