集束イオンビームを用いて低温電子顕微鏡標本の準備

この手順の全体的な目標は、極低温凍結したバルクサンプルから集束イオンビームラメラを抽出することにより、クライオTEM用のサンプルを調製することです。これは、最初にサンプルを液体窒素で凍結し、クライオ集束イオンビームSEM内にマウントすることで達成されます。第2ステップは、イオンビームで薄いLA Meloを切り取り、冷却されたナノマニピュレータを使用してTEMグリッドに転写することです。

次に、TEMグリッドは、トランスファーステーションのSEMホルダーからTEMホルダーに転送されます。最後のステップは、TEMホルダーをクライオTEMに移してさらに分析することです。最終的に、クライオTEMは、抽出されたラメラの高解像度画像、トモグラハムス、またはX線マップを表示するために使用されます。

この技術により、透過型電子顕微鏡では、光学顕微鏡や走査型電気顕微鏡などの他の顕微鏡で分析する場所をあらかじめ選択することで、ソフトマターを究極の分解能で分析することが可能となります。この手法がMac cryo Microtomyのような既存の方法よりも優れている主な点は、サンプルの圧縮やデフ形成などの調製アーチファクトが回避されることです。まず、集束イオンビーム試料用のTEMグリッドを2枚取り付けます。

SEMトランスファーホルダーで、対応するネジをドライバーで締めてグリッドを固定し、シャッターを閉じて、試料に適したサンプルスタブを取り付け、試料の一部を追加します。たとえば、ピペットを使用して、平らなスタブに液滴を堆積させます。次に、SEMトランスファーホルダーを真空トランスファーデバイスまたはVTDに取り付けます。

スラッシングステーションに液体窒素を加えてポンプダウンした後、ステーションを開いてSEMトランスファーホルダーを再びプランジフリーズし、沸騰が完了してスラッシュが再び得られるまでポンプダウンします。次に、SEMトランスファーホルダーをVTDの真空チャンバーに引っ込めて密封します。スラッシングステーションとクライオ準備チャンバーエアロックをベントします エアロック 外側のエアロックをベントします。

次に、VTDシールをクライオ調製チャンバーとポンプのエアロックに合わせます。良好な真空レベルに達したら、エアロックピンを測定して、VTDと外側のエアロックのシールを開きます。次に、SEMトランスファーホルダーを挿入します。

これに続いて、コールドナイフを使用してTEMグリッドスロットの保護蓋を開きます。集束イオンビームSEMのハイテンションをオフにし、インナーエアロックを開きます。次に、VTDを使用してSEMホルダーをサンプルチャンバーに移します。

SEMホルダーがコールドステージになったら、押して回転させてVTDを外します。VTDロッドをVTD真空チャンバー内に完全に引っ込め、内側のエアロック、外側のエアロック、およびVTDシールを閉じます。この時点で、前駆体ガスを摂氏24〜26度に加熱し、ガス注入システムまたはGISニードルをサンプル表面から約1ミリメートルの高さに配置します。

電子ビームでイメージングしながら、ガスバルブを数秒間開きます。次に、1000ピコアンペアのイオンビームを低倍率で使用して、関心領域またはROIにわたって堆積物を硬化させます。硬化後、サンプルを52度傾けて、表面がイオンビームに対して垂直になるようにします。

ミルアウェイ。2つのテロリストの塹壕。ROIの両側でサンプルを0度に傾け、イオンビームを使用してラメラの側面と下側を切り取り、カットマークがラメラ全体を通過するようにします。

GIS針が挿入されたら、ナノマニピュレータを、その先端がラメラに物理的に接触するまで、できれば側面で操作します。GISバルブを数秒間開き、電子ビームによる連続イメージングによりクライオ堆積を監視します。さらに1〜2マイクロメートルの白金層を凍結堆積させた後、ナノマニピュレータがラメラと接触している点の周りの数マイクロメートルでのみ白金を硬化させた後、バルブを閉じます。

次に、高イオンビーム電流を使用してラメラを切断します。ナノマニピュレーターを慎重に操作して、トレンチからラメラを抽出し、サンプル表面から少なくとも500マイクロメートル上に移動します。針を引っ込めた後、サンプルステージを数ミリメートル下げ、TEMグリッドの1つが見えるまで動かします。

グリッド上のアタッチメント領域を作業位置に移動し、GIS針を挿入します。次に、ナノマニピュレータを慎重に操作して、付着したラメラをTEMグリッド上の付着領域に物理的に接触させ、ガスバルブを数秒間開き、さらに1〜2マイクロメートルの白金層を凍結堆積させますラメラとTEMグリッドとの接触点の周りの数マイクロメートルで白金を硬化させます。次に、高イオンビーム電流を使用して、ナノマニピュレーターからラメラを切断します。

サンプルを52度に傾け、イオンビームを使用して電子透過性まで薄くします。クライオトランスファーステーションを乾燥窒素ガスで洗い流した後、クライオトランスファーTEMホルダーをクライオトランスファーステーションの適切なスロットに挿入し、液体窒素を充填します。これに続いて、ドライバー、TEMサンプルクランプツール、ピンセットを液体窒素で満たされた極低温カップに浸し、先端を所望の温度に冷却します。

VTDが外側のエアロックに一致したら、コールドステージをトランスファー高さ16mmにします。ハイテンションを切った後、VTDシール、アウターエアロック、インナーエアロックを開けます。次に、VTDロッドを使用して、時計回りに押して回転させることにより、SEMトランスファーホルダーにロックします。

この時点で、SEMトランスファーホルダーをクライオ調製チャンバーに引っ込めます。コールドナイフを使用して、TEMグリッドの保護蓋を閉じます。次に、VTDロッドを使用してサンプルをVTDの真空チャンバーに移動し、エアロックを閉じてシールします。

次に、外側のエアロックをベントし、VTDを取り外します。VTDをクライオトランスファーステーションのSEMポートに一致させます。乾燥窒素で洗い流しながら、ステーションのピンを使用してVTDのシールを開き、SEMトランスファーホルダーをクライオトランスファーステーションの実行者にスライドさせます。

冷却されたドライバーを使用して、蓋の1つを開き、対応するネジを緩め、TEMグリッドを所定の位置に保ちます。次に、TEMグリッドを手に取り、冷却されたピンセットを使用してTEMホルダーに配置します。これに続いて、TEMグリッドをTEMホルダーに固定します。

冷却された六角リングを使用して、クライオトランスファーTEMホルダーのシャッターを閉じ、クライオトランスファーステーションをポンピングシステムから切り離します。TEMホルダーのステーションとヒーターコントローラーをTEMの近くに輸送し、再接続します。TEM 試料段をマイナス 70 度の傾きに設定します。

次に、エアロックのポンピング時間を最短に設定し、乾燥窒素ガスによるパージを1サイクルのみ行います。クライオトランスファーステーションからTEMホルダーを取り外し、傾斜ゴニオメーターの第1ステージに挿入すると、ポンピングサイクルが開始されます。サイクルが完了したら、TEMホルダーを保持したままゴニオメーターを0度まで傾けて、ゴニオメーターと一緒に回転しないように設定します。

次に、ホルダーをゴニオメーターを通してTEM内に完全に挿入します。最後に、クライオトランスファーTEMホルダーに液体窒素を補充します。この方法では、アスペルギルス・ニジェールの胞子を最初にSEMで画像化して抽出部位を特定します。

胞子の断面積で十分ですが、細胞膜から特定の距離で特定の細胞をスライスするために、サブマイクロメートルの精度で抽出用のROIを配置することができます。目的の特徴が特定されたら、クライオ堆積の最初のステップが実施されます イオンミリング中のビーム損傷からサンプルを保護するために、サンプルを52度に傾け、続いてメラの両側にある2つのトレンチをスパッタリングします。次に、サンプルを後ろに傾けてさらに粉砕し、バルクに接続する2つの小さなブリッジのみを残します。

冷却されたナノマニピュレータをメラに接触させ、白金の別のクライオ堆積物がそれらを一緒にはんだ付けします。小さな接続ブリッジはフライス加工され、ナノマニピュレーターはラメラをTEMグレードの取り付け領域の近くに移動し、そこでプラチナの最終的なクライオ堆積ではんだ付けされます。次に、ナノマニピュレータは、電子透過性まで薄いラメラから分離されます。

イオンビームにより、ラメラはTEMに移され、高解像度のイメージング分光法、断層撮影、およびその他の技術を採用できます。この方法は、ニューロプローブや骨インプラントなどのシステムにおける心臓のソフトマター界面の理解に貢献します。このビデオを見れば、アーティファクト3であり、バグサンプルの特定の領域からサブマイクロメートルの精度で抽出できるクライオTMサンプルの調製方法について十分に理解できるはずです。