Name: ソリッド検体からの原発性卵巣癌細胞を得る方法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 58 s
Description: 学ぶ ソリッド検体から原発性卵巣癌細胞を分離培養する方法。酵素処理と遠心分離により線維芽細胞を含まない純粋な上皮性卵巣癌細胞を取得し、個別化医療への応用が可能です。

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私たちは、患者の組織サンプルの収集の支援については、ミネソタ大学の組織調達施設のスタッフに感謝したいと思います。この作品は、MBにし、MBに婦人科腫瘍学部門の資金によってミネソタ卵巣がんのアライアンスにより、MBにランディシェーバー癌研究およびコミュニティ基金によるMBに国防総省の卵巣癌研究プログラム（OCRP）OC093424、サポートされていました。資金提供者は、研究デザイン、データ収集と分析、公開することを決定、または原稿の準備に何の役割がありませんでした。

倫理に関する声明 ヒト被験者の委員会（IRB）の承認：卵巣癌の固体試料は、治験審査委員会委員の後にミネソタ大学の組織調達機能（TPF）から得た。 1。試薬のセットアップ<ol><li> 10％のFBS、100単位ペニシリン - ストレプトマイシンを含むDMEMを補充することにより完全DMEM培地を準備します。 4℃でメディアを格納し、温める37℃、使用前に。 </li><li>複数の凍結を回避するため5〜10 mlを別々のボリュームに分量のディスパーゼIIはnonfrostフリー冷凍庫に-20℃で解凍して保存。 </li></ol> 2。組織採取<ol><li>肉眼的病理学者によって癌と識別領域から手術時に卵巣癌（サイズは〜5グラム）の固体の試料を収集します。臨床検体は、制度的なプロトコルに従って脱識別され、登録されている。 </li><li>無菌、サウスカロライナ州での試験片を置きREW蓋、ポリプロピレン、氷冷PBS 30mlで充填された容器を片。氷上での処理のための研究室に外科病理検査室からの検体を輸送し、検体採取（ 図1）から30分以内。 </li></ol> 3。組織処理<ol><li> （（2mm以下）、さらに可能な限り最小の断片に切断、無菌条件下で作業し、ペトリ皿（X 60ミリメートル60ミリメートル）、新鮮な、氷冷PBSの10ミリリットルを含有し、滅菌したカミソリの刃を使用して上にサンプルを転送図2Aおよび2B）。 </li><li> DMEM中のディスパーゼII（2.4 U / ml）を（30分間37℃）温めておいた10mlのを含む15ミリリットルの円錐管に刻んだ組織を移し、30分間、5％CO 2、37℃でインキュベートする。標本の最適な消化を確実にするために、手動で細胞スラリーごとに5分を攪拌する。 </li><li> 30分間のインキュベーション、移動（使用した後10ミリリットルの血清学的ピペット）セルストレーナー（70ミクロンメッシュ）上に細胞スラリーは、50ミリリットルコニカルチューブの上に配置し、シリンジプランジャを使用してメッシュに対する穏やかな圧力を適用します。 （メッシュの上に残っている）すべての未解離組織を捨て、50ミリリットルの滅菌コニカルチューブ内の得られた細胞懸濁液を収集します。 4℃（ 図3）で7分間320×gで遠心します。 </li><li>上清を捨て、10％のFBSを含むDMEMの10ml中に細胞ペレットを再懸濁する。 </li><li> 5％のCO 2、37℃（ 図4）でのシャーレ中の細胞懸濁液をインキュベートする。 </li><li>最初のプレーティングから24時間後に培地を変更します。これは細胞片の除去及び培養物中に存在する赤血球の大半を可能にします。 </li><li>メディアをプライマリEOCの文化が下流のアプリケーションのための準備ができているし、その後、次の2週間、3日ごとに変更します。 </li></ol>

<ol><li>Kurman, R. J., Visvanathan, K., Roden, R., Wu, T. C., Ie M, S. hih <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+detection+and+treatment+of+ovarian+cancer%3A+shifting+from+early+stage+to+minimal+volume+of+disease+based+on+a+new+model+of+carcinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Obstet.+Gynecol%22%5BJournal%5D)">Early detection and treatment of ovarian cancer: shifting from early stage to minimal volume of disease based on a new model of carcinogenesis.</a> Am. J. Obstet. Gynecol. 198 (4), 351-356 (2008).</li>
<li>Kuhn, E., Kurman, R. J., Shih, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+Cancer+Is+an+Imported+Disease%3A+Fact+or+Fiction%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Obstet.+Gynecol.+Rep%22%5BJournal%5D)">Ovarian Cancer Is an Imported Disease: Fact or Fiction.</a> Curr. Obstet. Gynecol. Rep. 1 (1), 1-9 (2012).</li>
<li>Sarojini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+detection+biomarkers+for+ovarian%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Early detection biomarkers for ovarian.</a> J. Oncol. , (2012).</li>
<li>Shepherd, T. G., Theriault, B. L., Campbell, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nachtigal+M.W.+Primary+culture+of+ovarian+surface+epithelial+cells+and+ascites-derived+ovarian+cancer+cells+from+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Nachtigal M.W. Primary culture of ovarian surface epithelial cells and ascites-derived ovarian cancer cells from patients.</a> Nat. Protoc. 1 (6), 2643-2649 (2006).</li>
<li>Tsao, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+human+ovarian+surface+epithelial+cells+immortalized+by+human+papilloma+viral+oncogenes+%28HPV-E6E7+ORFs%29%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell.+Res%22%5BJournal%5D)">Characterization of human ovarian surface epithelial cells immortalized by human papilloma viral oncogenes (HPV-E6E7 ORFs).</a> Exp. Cell. Res. 218 (2), 499-507 (1995).</li>
<li>Auersperg, N., Maines-Bandiera, S. L., Dyck, H. G., Kruk, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+cultured+human+ovarian+surface+epithelial+cells%3A+phenotypic+plasticity+and+premalignant+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Invest%22%5BJournal%5D)">Characterization of cultured human ovarian surface epithelial cells: phenotypic plasticity and premalignant changes.</a> Lab. Invest. 71 (4), 510-518 (1994).</li>
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<li>Sueblinvong, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment%2C+characterization+and+downstream+application+of+primary+ovarian+cancer+cells+derived+from+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Establishment, characterization and downstream application of primary ovarian cancer cells derived from solid tumors.</a> PLoS One. 7 (11), (2012).</li>
<li>Rockwell, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo-in+vitro+tumour+cell+lines%3A+characteristics+and+limitations+as+models+for+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Cancer+Suppl%22%5BJournal%5D)">In vivo-in vitro tumour cell lines: characteristics and limitations as models for human cancer.</a> Br. J. Cancer Suppl. 41 (4), 118-122 (1980).</li>
<li>Wong, C., Chen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development%2C+application+and+limitations+of+breast+cancer+cell+lines+to+study+tamoxifen+and+aromatase+inhibitor+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Steroid.+Biochem.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The development, application and limitations of breast cancer cell lines to study tamoxifen and aromatase inhibitor resistance.</a> J. Steroid. Biochem. Mol. Biol. 131 (3-5), 83-92 (2012).</li>
</ol>

著者らは、開示することは何もありません。

卵巣がんの病因と開発のより良い理解は、この壊滅的な疾患に罹患した女性の結果を改善することが重要です。この文脈での使用が確立され、「市販の「卵巣癌細胞株は、間違いなく飛躍的に有用であった。しかし、今日、我々は癌細胞株は、彼らが異質9,10の欠如など、多くの面で由来するヒト腫瘍を代表するものではないことを知っている。 ここでは、直接手術標本の分離の30分以内に卵巣癌の臨床検体からの分離と原発性卵巣癌細胞を培養するための迅速かつ信頼性の高い方法を報告している。 初代細胞は、腹水対固体試料から単離されるので、これは前の腹水形成が起こる時間に疾患の初期段階からの細胞を単離するという利点を有する。この技術はまた、副を有する特定のサイトからの原発性卵巣癌細胞を単離するアンテージ。このプロトコルを使用して実行可能な原発性卵巣癌細胞を得ることに成功した試料は、手術後に処理することができるいかに迅速に大きく依存する。最良の結果を得るには、標本は手術から30分以内に受信する必要があります。これが不可能な場合、試料は、一晩（PB...

その比較的低い発生率にもかかわらず、卵巣癌は婦人科疾患と女性の1,2のがんによる死亡の第五の主要な原因の最も致命的である。これは主に忠実疾患3の開始および進行を再現信頼性の高いツールとモデルの不足が原因です。卵巣癌についての我々の知識今日のほとんどは、腹水から回収4-7不死化卵巣表面上皮細胞（IOSが）、卵巣癌細胞株および原発性卵巣癌細胞の使用により可能であった。残念ながら、それらの使用は、不死化プロセスまたは体外路及び腹水製剤から得られた集団の異質性に関連する遺伝的および表現型変化の数など、いくつかの制限があります。 そのため、卵巣癌の特定可能な、特定の固体標本由来の初代卵巣癌細胞はuniquを表す卵巣癌の進行を研究するための電子ツール。 これらの悪性細胞の取得に必要な主な困難は、生存率およびこれらのEOC細胞の培養における増殖能力の早期不足の損失に伴う間質細胞や線維芽細胞の異常増殖によるものである。固形腫瘍からの単細胞懸濁液を作成するには、いくつかの方法が、現在、しかし、特定の技術が有利な結果8より多くの量が得られ、機械的手段または酵素的解離によって、存在しています。ここでは、実行可能な、線維芽細胞のないEOC細胞の効果的な回復のディスパーゼIIの結果とその酵素消化を示しています。このようにして得られたEOC培養物は、遺伝子操作を非常に受けやすいと薬物スクリーニング試験においても有用であり、これらのEOC培養物は、多くの下流の用途に適していることを示している。

<table><tbody><tr><td>1x PBS、滅菌&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>スクリュー蓋、ポリプロピレン試料容器、滅菌済み</td><td>Thermo Scientific</td><td>02 1090</td><td></td></tr><tr><td>DMEM medium、滅菌済み&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清、滅菌済み</td><td>Thermo Scientific Hyclone</td><td>SH30396.03</td><td></td></tr><tr><td>100x ペニシリン-ストレプトマイシン、液体</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II、滅菌済み</td><td>Roche</td><td>04942 078 001</td><td></td></tr><tr><td>小型細先端鉗子およびメス刃、滅菌済み</td><td>Fisher Scientific</td><td>鉗子: 08-953E, 刃: 08-927-5D</td><td></td></tr><tr><td>小型解剖ハサミ、滅菌済み</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-945</td><td></td></tr><tr><td>15 ml コニカルキャップ付きチューブ、滅菌済み</td><td>BD ファルコン</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>50 ml コニカルキャップ付きチューブ、滅菌済み</td><td>BD ファルコン</td><td>352027</td><td></td></tr><tr><td>10 ml セロジカルピペット、滅菌済み&nbsp;</td><td>Corning</td><td>13-678-11E</td><td></td></tr><tr><td>6 mlシリンジプランジャー、滅菌&nbsp;</td><td>タイコヘルスケア</td><td>8881516911</td><td></td></tr><tr><td>ナイロンフィルター(70 &mu;m ) セルストレーナー、滅菌済み</td><td>BD Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>5 cm シャーレ、滅菌済み&nbsp;</td><td>コーニング430166</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10cmシャーレ、滅菌&nbsp;</td><td>コーニング430167</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ソリッド検体からの原発性卵巣癌細胞を得る方法

Method for Obtaining Primary Ovarian Cancer Cells From Solid Specimens

卵巣癌の発生および進行を調査するための信頼性の高いツールが緊急に必要とされている。卵巣癌細胞株の使用は、卵巣癌を理解するための貴重なツールのままで、それらの使用は多くの制限がある。これらは、異質性の欠如および拡張のin vitro継代に関連した遺伝子変異の過多があります。ここでは、手術時に回収した固体臨床検体を形成原発性卵巣癌細胞の迅速な確立を可能にする方法を記載している。この方法は、30分間酵素消化に臨床検体を施すからなる。単離された細胞懸濁液を増殖させ、薬物スクリーニングを含め下流側のアプリケーションのために使用することができる。確立された卵巣癌細胞株上の原発性卵巣癌細胞株の利点は、それらが由来し、異なる部位か否かに由来することができる元の特定の臨床検体の代表的なものであるということで一応RYまたは転移性卵巣癌。

卵巣癌の臨床検体を、新鮮な細胞スラリーを構成する（ 図1）手術後に収集し、小片（ 図2Aおよび2B）に切断される。これは酵素処理への検体の最適な露出が可能になります。細胞スラリーを酵素消化に曝し、30分間37℃でインキュベートする。インキュベーション時間の間、スラリーは、（特に、各攪拌後）ますます濁り、これは、組織脱凝集のサインです。インキュベーション時間の最後に、スラリーは、任意の組織解離していない（ 図3）からEOC細胞を分離する細胞ろ過器上に転写される。回収した細胞懸濁液を、5％CO 2、37°C（Fのigure 4）に配置される。この段階で、細胞培養物の形態は、単一細胞懸濁液として、小塊の両方のEOC細胞の存在を明らかにする。この時点での培養もPRESENを明らかに<html>赤血球と、図5に示すように、小さな破片のCE。 EOCがゆっくり（1〜3日の期間にわたって）プラスチックに付着する重要なのが、赤血球...

本研究では、固体の臨床検体からの原発性卵巣癌細胞の単離および特徴付けのための詳細な方法を記載している。卵巣癌臨床検体は、下流の用途に非常に適した生存可能な、線維芽細胞を含まない上皮性卵巣癌（EOC）細胞を得るために酵素消化に供される。

Reliable tools for investigating ovarian cancer initiation and progression are urgently needed. While the use of ovarian cancer cell lines remains a ...

この手順の全般的な目的は、臨床的な固形検体から原発性卵巣がん細胞を単離し、その特性を解析することである。まず、卵巣腫瘍検体を採取し、ペトリ皿に配置する。次に、サンプルを細切し、それらを消化試薬の入ったコニカルチューブに移してインキュベートする。次に、細胞懸濁液をフィルターに通して細胞のみを回収します。遠心分離の最終ステップとして、上清を捨て、細胞を培地で再懸濁して一晩培養します。最終的に、上皮性卵巣癌細胞は数週間にわたって培養され、これによりダウンストリームのアプリケーションへの利用が可能になります。この手法は、個々の患者にとって最適な治療法は何かという、卵巣癌分野における重要な課題の解決に寄与します。この手法の意義は卵巣がんの治療にまで及びます。なぜなら、遺伝子操作への感受性が高く、薬剤スクリーニング試験により有用な、より現実的な細胞培養を用いることが可能になるためです。まず、500 millilitersのDulbecco's Modified Eagle Medium（DMEM）に、10% fetal bovine serum（FBS）および1% penicillin-streptomycin（PS）を添加します。この培地を4 °Cで保存してください。手術室からサンプルを回収し、輸送容器に入れたまま氷上で研究室まで運搬します。サンプルを生物学的安全キャビネット内に置きます。50 mLコニカルチューブから、10 mLの新鮮で氷冷したPBSを含む60 mm × 60 mmのペトリ皿にサンプルを移します。次に、滅菌済みのカミソリを用いて、サンプルを2 mm以下の大きさにさらに細切します。その後、15 mLコニカルチューブ内でDMEMをDispaseチューブで処理します。細切した組織を、このDMEM Dispase混合液チューブに移します。次に、サンプルを5% 二酸化炭素、37 °Cで30分間インキュベートします。最適な消化を確実にするため、5分ごとに細胞懸濁液を手動で攪拌してください。インキュベーション後、50 mLコニカルチューブの上に置いた70 µmメッシュのセルストレーナーを通して、細胞懸濁液を転移させます。シリンジのプランジャーを使用してメッシュに穏やかに圧力をかけ、メッシュ上に残った不要な組織を除去し、得られた細胞懸濁液を50 milliliterの滅菌コニカルチューブに回収します。次に、コニカルチューブを4 °Cで320 ×g、7分間遠心分離します。上清を廃棄し、細胞ペレットを10%FBSおよび1%psを含む10 millilitersのDMEMで再懸濁します。次に、細胞懸濁液をペトリ皿に移し、5%carbon dioxide、37 degrees Celsiusでインキュベートします。初回播種から24時間後に培地を交換し、細胞残骸および培養液中

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我々は、確立するための方法論を記述する...

三次元異<em&gt; in vitroで</em卵巣がんの発生と進行中に間質相互作用の上皮&gt;モデリング

このプロトコルは、卵巣外植片を卵管がん細胞と共培養することによるサンプル調製の技術について説明しています。これらのサンプルは、イメージング質量分析法(IMS)を使用して視覚化され、腫瘍の発生につながる細胞と組織間の小分子交換を検出します。...

イメージング質量分析のための卵巣がんコミュニケーションのモデリング:転移性卵巣腫瘍の発生における低分子化学コミュニケーターを同定する方法

このビデオでは、固形卵巣腫瘍組織標本から原発性卵巣がん細胞を分離し、特徴づける方法について説明します。このプロトコルを使用して得られた上皮がん細胞は、卵巣がんの開始と発症につながる可能性のあるプロセスを理解するのに適しています。...

固形標本からの原発性卵巣癌細胞の採取:卵巣腫瘍標本から上皮性卵巣癌細胞を培養する方法

腹膜の中皮ライニングに卵巣癌細胞の浸潤は、時間とともに動的なプロセスである。実時間分析器を利用して、回転楕円体、中皮細胞の共培養モデルにおける卵巣癌細胞の浸潤能は、転移のプロセスを調節する因子への洞察を提供し、長期の期間にわたって定量化することができる。...

リアルタイムで中皮細胞の卵巣癌スフェロイドアタッチメントおよび浸潤の評価

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卵巣がんの腫瘍開始細胞の体外富化

ここでは、卵巣癌細胞の接着、浸潤、増殖を調査するツールとして、初代ヒト中皮細胞と細胞外マトリックスで層状にされた線維芽細胞からなる腹腔の内層の3次元in vitroモデルを構築するためのプロトコルを提示します。...

ヒト腹腔器官培養における卵巣癌普及の初期段階のモデル化

卵巣癌の腹膜播種の多段階プロセスを明確にするために、現在の研究では、これらの腫瘍細胞と同所接種を介して元の腫瘍の開発と腹膜転移のマウス実験モデルを提示します。...

オリジナル腫瘍の開発のマウス実験モデルと腹膜転移<em&gt;経由で</em卵巣癌細胞で&gt;同所接種

患者由来オルガノイド(PDO)は、 in vitroで腫瘍環境を模倣できる3次元(3D)培養です。高悪性度漿液性卵巣がんにおいて、PDOは新しいバイオマーカーと治療法を研究するためのモデルです。...

高悪性度漿液性卵巣癌患者由来オルガノイドの作製と培養

患者由来の卵巣がんオルガノイドを用いた治療薬試験の実施に使用できるプロトコルを提示します。...

前臨床薬物検査のための卵巣癌患者由来オルガノイドモデル

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ヒト大網を用いた卵巣癌腹膜転移の Ex vivo モデル

このプロトコルは、さまざまな病期からの卵巣がんオルガノイドを確立するための体系的なフレームワークを提供し、患者固有の変動性の課題に対処して、収量を増やし、その後のアプリケーションのための堅牢な長期拡張を可能にします。これには、組織処理、播種、培地要件の調整、および免疫蛍光染色の詳細な手順が含まれています。...

卵巣がんオルガノイドのバイオバンキング戦略:組織学的サブタイプと疾患病期にわたる患者間の不均一性への対処

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ソリッド検体からの原発性卵巣癌細胞を得る方法

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