三次元異 in vitroでモデリング

次の実験の全体的な目標は、初期段階の卵巣がん発生の3次元典型的なモデルを生成することです。まず、初代正常卵巣上皮組織および線維芽細胞組織に由来するHタート不死化細胞株を作製します。次に、卵巣共培養に存在するin vivo構造と複雑な細胞細胞相互作用を再現するために、3次元Sスフェロイドモデルの上皮細胞株と間質細胞株は、オルガノイド培養物の固定と染色を進め、特定のマーカーの発現を解析して、間質上皮相互作用の分子特性を研究します。

得られた結果は、3Dタイピックモデルの間質細胞コンパートメントの変化が、共培養上皮細胞の表現型にどのように影響するかを示しています。3次元タイピカルモデルは、卵巣がんの研究分野における重要な疑問、例えば、この疾患の起源を探ることや、腫瘍の開始と発生における間質微小環境の役割を解明することなど、重要な疑問に答えるのに役立ちます。これらの技術の応用は、他の3D培養方法と比較して、疾患の診断と治療にまで及びます。

この技術は、より広範な細胞培養量およびダウンストリームアプリケーションに適用できます。例えば、3Dホモ培養物やタイピック培養物は、in vitro薬物試験に使用することができます。このアプローチは、他の固形腫瘍タイプの研究や良性疾患の研究など、他のモデルシステムにも適用できます。

新鮮な卵巣組織を、不死化した正常な卵巣線維芽細胞増殖培地に、追加の抗生物質とアンティックスを添加した細胞培養実験室に輸送します。サンプルを5ミリリットルのPBSで3回洗浄し、組織にゆるく付着したままの上皮細胞を取り除きます。次に、サンプルとPBSをクリーンなP 100培養皿に移します 滅菌器具を使用して、組織を2番目の乾燥P 100クリーン培養皿に移します。

ティッシュを0.5平方センチメートルの小片に切り、各小片を別々のP 100皿に移します。ティッシュを1平方ミリメートル未満のサイズにカットし続けます。次に、20ミリリットルのINOF GM培地と培養モニターを添加し、相顕微鏡を使用して細胞増殖を行います。

24時間以内に細胞がディッシュに付着することを確認します。位相顕微鏡による細胞増殖のモニタリング 細胞は通常、1週間後24時間以内に皿に付着します。吸引によって非接着組織を除去し、培地を補充し、その後、細胞コロニーのサイズが約500ミクロンの1〜3週間以内に週に2回培養物を再供給します。

トリップスおよびコーティングされたクローニングディスクを使用してクローンを分離します。100%線維芽細胞を確認するため。細胞株のサンプルをガラスカバースリップに播種し、線維芽細胞マーカー、上皮マーカー、および内皮細胞マーカーの免疫蛍光染色を行います。

H Tult継代のレトロウイルス形質導入の1日前に、正常な卵巣線維芽細胞細胞は、単一のP 100皿から3つのP 100皿に分離します。既製のウイルスsup natanは、HEC 2 9 3 T細胞のコットトランスフェクションの標準プロトコルを使用して、社内で購入または製造することができます。ポリヘマ溶液を調製するには、1.5グラムのポリヘマを秤量し、滅菌ボトルに入れます。

95ミリリットルの分子生物学、グレード、無水エタノール、および5ミリリットルの細胞培養グレードの蒸留水を追加します。ポリヘマ溶液を摂氏65度の水浴に完全に溶解するまで置きます。ティッシュカルチャーディッシュに作りたてのポリヘマ溶液をコーティングします。

層流フード内の細胞培養皿を風乾します。ロッキングプラットフォーム上での穏やかなロッキングを使用して、より大きなサイズの皿やフラスコを均一にコーティングすることができます。ポリアス溶液の乾燥が速すぎると、表面は滑らかになりません。

所望であれば、3D培養の前に線維芽細胞を前処理し、例えば、老化の誘導のために、細胞を亜致死量の過酸化水素で前処理する。INOFおよび上皮細胞培養をin vitroで回収および増殖し、3Dヘテロトピアステロイドを確立するのに十分な細胞を調製します。5分間のPBS洗浄後、ポリヘマプレートに15ミリリットルのメディウムを追加します。

その間、不死化した正常な卵巣線維芽細胞にトリプシンを加えて、培養皿からそれらを分離します。3〜5分後、等量の培養培地でトリプシンを中和し、遠心分離により細胞を回収します。細胞ペレットを5ミリリットルの培地に再懸濁し、ピペッティングで上下するか、穏やかにボルテックスしてよく混合します。

次に、10マイクロリットルのサンプルを使用して、トライアンブルーを使用して生存細胞を列挙します。次に、ポリヘマコーティングプレートに分注済みの培地に400万個のINOF細胞を追加します。培地の容量を20ミリリットルに構成し、摂氏37度、二酸化炭素5%でインキュベートします。

位相顕微鏡法で多細胞ステロイドへの細胞凝集をモニターし、2〜3日ごとにSスフェロイド培養物を再供給します。プレートをピペットに斜めに置きます。スフェロイドが落ち着くのを待ち、5ミリリットルのピペットで約16ミリリットルの消耗した媒体を慎重に取り除きます。

16ミリリットルの新鮮な培地を培養物に加え、7日目にインキュベーターに戻します。線維芽細胞pheに上皮細胞を添加することにより、ヘテロタイピング培養物を作製します。まず、細胞を列挙した後、前述のようにトリプシンにより卵巣上皮細胞の懸濁液を調製します。

INOF GM培地で一度洗浄し、上皮成長培地から成長因子が持ち越されないようにしてください。線維芽細胞OID培養液を補充した後、上皮細胞培養物に4対1の割合で上皮細胞を添加する。INOF GMの異所性OIDは、2〜3日ごとに典型的な培養物をさらに14日間再給餌します。

免疫組織化学では、PHEを中性緩衝ホルミンで固定し、PHEをペレット化し、ホルマリンを70%エタノールで置き換えます。ヒト組織に使用される標準プロトコルを使用してパラフィンへのプロセッシングに進みます。パラフィン包埋ステロイドは、免疫組織化学を用いて特定の分子マーカーのhおよびeで切片化および染色することができます。

あるいは、PBSでステロイドを洗浄し、4%パラホルムアルデヒドで固定します。次に、サンプルをOCT培地に埋め込み、凍結してクライオスタット切片化および免疫蛍光染色を行い、フローサイトメトリーによる分析を行います。PBSでステロイドを洗い、トリプシンまたはアキュテイン消化によって摂氏37度で解離します。

ステロイドの単一細胞懸濁液への完全な解離は、1ミリリットルのピペットチップで溶液を上下にピペッティングすることで促進できます。細胞を過度にサイズしないように注意し、等量の培養培地で反応を中和し、懸濁液を40〜70ミクロンの細胞ストレーナーに通して細胞塊を除去します。次に、細胞をペレット化し、PBSで洗浄し、製造元の指示に従って、必要な数の細胞を事実上の緩衝液と染色に再懸濁します 私たちの研究室では、卵巣上皮細胞を部分的に形質転換し、これらの細胞を正常および老化卵巣線維芽細胞と共培養して、初期段階の卵巣癌の発症を模倣しました。

閉経前の卵巣では、不死化正常卵巣線維芽細胞の免疫蛍光染色は、一次正常卵巣線維芽細胞と不死化正常卵巣線維芽細胞の両方が線維芽細胞特異的タンパク質を発現したが、サイトケラチン7を発現せず、メントンを発現しないことを示しています。正常な卵巣線維芽細胞を3D形態PHEで単独で培養すると、紡錘体形態と豊富な細胞外マトリックスを示します。ここでは、正常な卵巣線維芽細胞を過酸化水素に曝露して7日間にわたって老化を誘導した後、部分的に形質転換した卵巣上皮細胞で14日間培養しました。

2つの細胞型を区別するために、得られたステロイドを、増殖マーカーとしてmim1について免疫染色し、上皮マーカーとしてパンサイトケラチンを免疫染色しました。データの定量化は、老化した微小環境が部分的に形質転換された上皮細胞の腫瘍性の特徴を促進するのに対し、正常な微小環境は腫瘍性の進行を阻害し、細胞を培養したときには検出できない正常細胞と悪性細胞の組織学的特徴を阻害することが示唆されています。例えば、細胞をスフェロイド培養に移行すると、明細胞卵巣がんの組織学的特徴は、明細胞卵巣がん細胞株の3D培養では検出できますが、同じ細胞の単層培養では検出できません。

このビデオを見れば、上皮細胞と間質細胞の間の相互作用を研究するための3次元タイピングカルチャーの設定方法について十分に理解できるはずです。初期の腫瘍発生中。3D培養を設定する際には、下流のアプリケーションに応じて細胞数を調整することが重要であり、処理中に材料がいくらか失われることを考慮します。

一度習得すれば、この手順に続いて1時間で3D培養を設定することができます。遺伝子発現マイクロレイプロファイリングと組み合わせたフローサイトメトリーなどの他の方法を実行して、3D典型的な培養で発生するが単層培養条件下では検出されない全体的な遺伝子発現変化を解析できます。これにより、3Dコア培養下で特異的に発生する双方向シグナル伝達経路の解剖が可能になります。微小環境。