Name: 三次元異 in vitroでモデリング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 42 s
Description: 学ぶ三次元異種in vitroモデリングによる卵巣がん研究の方法。線維芽細胞と上皮細胞の共培養により、腫瘍微小環境における間質-上皮相互作用を解析し、がん発生機構の解明と治療戦略の開発に貢献する。

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この研究は、医学のケック学校、米国カリフォルニア大学、ロンドン大学、英国で行われました。 KLは健康助成5 U19 CA148112-02の国立研究所によって資金を供給される。 BGはイヴアピール婦人科腫瘍学のチャリティー（英国）からのプロジェクトの助成金によって賄われていた。 UCLH / UCLで引き受け、この作品の一部は、部分的に健康のNIHR生物医学研究センターの資金調達スキームの部門から資金提供された。

<ol><li>Jelovac, D., Armstrong, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+progress+in+the+diagnosis+and+treatment+of+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22CA+Cancer+J.+Clin%22%5BJournal%5D)">Recent progress in the diagnosis and treatment of ovarian cancer.</a> CA Cancer J. Clin. , (2011).</li>
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<li>Köbel, M., Kalloger, S. E., Boyd, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+carcinoma+subtypes+are+different+diseases%3A+implications+for+biomarker+studies%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Med%22%5BJournal%5D)">Ovarian carcinoma subtypes are different diseases: implications for biomarker studies.</a> PLoS Med. 5, e232(2008).</li>
<li>Smith, L. H., Morris, C. R., Yasmeen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+cancer%3A+can+we+make+the+clinical+diagnosis+earlier%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Ovarian cancer: can we make the clinical diagnosis earlier.</a> Cancer. 104, 1398-1407 (2005).</li>
<li>Aviv, A., Hunt, S. C., Lin, J., Cao, X., Kimura, M., Blackburn, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impartial+comparative+analysis+of+measurement+of+leukocyte+telomere+length%2FDNA+content+by+Southern+blots+and+qPCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Impartial comparative analysis of measurement of leukocyte telomere length/DNA content by Southern blots and qPCR.</a> Nucleic Acids Res. 39, e134(2011).</li>
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<li>Lawrenson, K., Grun, B., Benjamin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescent+fibroblasts+promote+neoplastic+transformation+of+partially+transformed+ovarian+epithelial+cells+in+a+three-dimensional+model+of+early+stage+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Senescent fibroblasts promote neoplastic transformation of partially transformed ovarian epithelial cells in a three-dimensional model of early stage ovarian cancer.</a> Neoplasia. 12, 317-325 (2010).</li>
<li>Lawrenson, K., Benjamin, E., Turmaine, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+three-dimensional+modelling+of+human+ovarian+surface+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Prolif%22%5BJournal%5D)">In vitro three-dimensional modelling of human ovarian surface epithelial cells.</a> Cell Prolif. 42, 385-393 (2009).</li>
<li>Lawrenson, K., Sproul, D., Grun, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+genetic+and+clinical+heterogeneity+in+epithelial+ovarian+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Modelling genetic and clinical heterogeneity in epithelial ovarian cancers.</a> Carcinogenesis. 32, 1540-1549 (2011).</li>
<li>Grun, B., Benjamin, E., Sinclair, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+in+vitro+cell+biology+models+of+ovarian+and+endometrial+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Prolif%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional in vitro cell biology models of ovarian and endometrial cancer.</a> Cell Prolif. 42, 219-228 (2009).</li>
<li>Zietarska, M., Maugard, C. M., Filali-Mouhim, A., Alam-Fahmy, M., Tonin, P. N., Provencher, D. M., Mes-Masson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+description+of+a+3D+in+vitro+model+for+the+study+of+epithelial+ovarian+cancer+%28EOC%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Carcinog%22%5BJournal%5D)">Molecular description of a 3D in vitro model for the study of epithelial ovarian cancer (EOC.</a> Mol. Carcinog. 46, 872-885 (2007).</li>
<li>Shield, K., Ackland, M. L., Ahmed, N., Rice, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicellular+spheroids+in+ovarian+cancer+metastases%3A+Biology+and+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Gynecol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Multicellular spheroids in ovarian cancer metastases: Biology and pathology.</a> Gynecol Oncol. 113, 143-148 (2009).</li>
<li>Dafou, D., Grun, B., Sinclair, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microcell-mediated+chromosome+transfer+identifies+EPB41L3+as+a+functional+suppressor+of+epithelial+ovarian+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Microcell-mediated chromosome transfer identifies EPB41L3 as a functional suppressor of epithelial ovarian cancers.</a> Neoplasia. 12, 579-589 (2010).</li>
<li>Levanon, K., Crum, C., Drapkin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+the+pathogenesis+of+serous+ovarian+cancer+and+its+clinical+impact%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">New insights into the pathogenesis of serous ovarian cancer and its clinical impact.</a> J. Clin. Oncol. 26, 5284-5293 (2008).</li>
<li>Kurman, R. J., Shih, I. eM. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+pathogenesis+and+extraovarian+origin+of+epithelial+ovarian+cancer--shifting+the+paradigm%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Molecular pathogenesis and extraovarian origin of epithelial ovarian cancer--shifting the paradigm.</a> Hum. Pathol. 42, 918-931 (2011).</li>
</ol>

特別な利害関係は宣言されません。

早期上皮性卵巣癌の生物学（EOC）は、あまり理解されていない。おそらく、長年にわたってこの分野の主要な障害の1つは、組織特異的疾患の起源とEOC開発における微小環境の役割の重要性の理解の欠如であった。過去数年間、EOCがおそらく異なるサブタイプの異なる細胞起源を持つ複数の異なるhistophathologicalサブタイプを持つ異質な疾患であることが明らかになってきています。たとえば、現在のデータは、高品位漿液EOCsは卵管分泌上皮細胞と卵巣表面上皮細胞の両方に由来することが示唆され、少なくとも内膜および明細胞EOCsの割合は、卵巣子宮内膜症（子宮内膜）から発生すると考えられている、と粘液EOCsは卵巣傍のまたはparatubal移行型上皮15,16から発生する可能性がある。しかし、唯一のin vitroおよび&lt;そこに限定されていたem&gt;はこれらhistotypesのいずれかの疾患進行のin vivoモデルインチ腫瘍間質-上皮の相互作用と発展卵巣癌に関連付けられた微小環境を研究するために、EOC の in vitro異型モデリングにおける</...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬 </td><td> サプライヤー </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td>細胞培養に適したポリHEMA、 </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> P3932 </td></tr><tr><td>分子生物学グレードのエタノール</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> E7023 </td></tr><tr><td>細胞培養用の滅菌水</td><td> VWR </td><td> 12001-356 </td></tr><tr><td> MCDB105 </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> M6395 </td></tr><tr><td>培地199 </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> M2154 </td></tr><tr><td>ハイクローンウシ胎児血清</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td> SH30088.03 </td></tr><tr> &lt;TD&gt;ゲンタマイシン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> G1397 </td></tr><tr><td>アムホテリシンB </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> A2942 </td></tr><tr><td> pBABE-湿気のhTERTの</td><td> Addgene </td><td> 1773 </td></tr><tr><td> PBS </td><td> VWR </td><td> 12001-766 </td></tr><tr><td> 0.25％トリプシン-EDTA </td><td>インビトロジェン</td><td> 25200-072 </td></tr><tr><td>セルストレーナー（40または70μm）を</td><td> VWR </td><td> 21008-949 21008-952 </td></tr><tr><td>抗線維芽細胞表面タンパク質抗体、クローン1B10 </td><td>シグマ</td><td> F4771 </td></tr><tr><td>抗パンサイトケラチン抗体（C11） </td><td>サンタクルス</td><td> SC-8018 </td></tr><tr><td>ポリブレン（ヘキサジメトリンブロマイド） </td><td>シグマ</td><td> 107689 </td></tr><tr><td> TeloTAGGGテロメラーゼPCR ELISA PLUS </td><td>ロッシュ</td><td> 12013789001 </td></tr><tr><td>テロメア長AssayをTeloTAGGG </td><td>ロッシュ</td><td> 12209136001 </td></tr></tbody></table> 表1試薬および器具は、この研究に言及。

三次元異<em&gt; in vitroで</em卵巣がんの発生と進行中に間質相互作用の上皮&gt;モデリング

Heterotypic Three-dimensional In Vitro Modeling of Stromal-Epithelial Interactions During Ovarian Cancer Initiation and Progression

上皮性卵巣癌（EOCs）は、西洋社会における婦人科悪性腫瘍による死亡の主要な原因となっています。外科的治療と改善プラチナベースの化学療法の進歩にもかかわらず、40年以上1,2のEOC生存率にほとんど改善がみられた。私の腫瘍は5年生存率&gt; 85％を持って上演しながら、ステージIII / IV疾患の生存率は&lt;40％である。腫瘍は以前より治療可能な、3から5までの段階で検出された場合、このようにして、EOCの死亡率の高さを大幅に低減することができた。現時点では、早期の疾患発達の分子遺伝学的および生物学的根拠はあまり理解されています。具体的には、少しは、腫瘍の開始時の微小環境の役割についてはほとんど知られていない、しかしEOCs（ 例えば年齢、パリティ）の既知の危険因子には、微小環境がEOCsの初期発生に重要な役割を果たしていることを示唆している。そこで我々は、3次元異機種を開発正常な卵巣の両方と早期卵巣癌の。文化の中で、これらの細胞の寿命を延ばすために、ヒトテロメラーゼホロ酵素の触媒サブユニット酵素（hTERT）のretrovrial形質導入により不死化正常な卵巣のために、我々は、共培養した正常な卵巣表面の上皮（IOSE）と通常の間質線維芽細胞（INOF）細胞。卵巣上皮細胞形質転換、細胞内IOSE CMYC癌遺伝子の過剰発現は、再びINOF細胞と共培養の初期段階をモデル化する。これらの異型のモデルは、上皮細胞の形質転換および浸潤に対する加齢と老化の効果を調査するために使用された。ここでは、これらの3次元モデルの開発に方法論的な手順を説明し、これらの方法論は、正常な卵巣や卵巣癌組織の発達に固有のものではなく、間質と上皮細胞の相互作用が基本である場合、他の組織型を研究するために使用することができる組織の保守及びジの側面sea​​se開発。

我々は、確立するための方法論を記述する<em&gt; in vitroで</em&gt;卵巣線維芽細胞と正常卵巣表面または卵巣癌上皮細胞を含む異型3次元モデル。我々は、卵巣癌の開発中に発生する間質上皮の相互作用を研究するために、これらのモデルの使用について説明します。

上皮性卵巣癌（EOC）は、欧米社会における婦人科系悪性腫瘍の死因の第1位となっています。外科的治療の進歩にもかかわらず...

本実験の全体的な目的は、初期段階の卵巣がん進行の三次元的な典型的モデルを構築することである。まず、原代の正常な卵巣上皮組織および線維芽細胞組織に由来するH turt不死化細胞株を樹立する。次に、卵巣内に存在する生体内の構造および複雑な細胞間相互作用を再現するため、上皮細胞株と間質細胞株を三次元Sスフェロイドモデルで共培養する。続いて、オルガノイド培養物を固定および染色し、特定のマーカーの発現を解析することで、間質・上皮相互作用の分子的な特徴を研究する。得られた結果は、3D擬似モデルの基質細胞コンパートメントにおける改変が、共培養された上皮細胞の表現型にどのように影響を与えるかを示しています。3次元擬似モデルは、この疾患の起源の探索や、腫瘍の発生および進展における基質微小環境の役割の解明など、卵巣がん研究分野における重要な疑問への回答に役立ちます。これらの手法の応用範囲は、他の3D培養法と比較して、疾患の診断や治療にまで及びます。この手法は、より広範な細胞培養量およびダウンストリームアプリケーションに適用可能です。例えば、3Dのホモおよびタイピック培養は、in vitroでの薬剤試験に使用できます。また、このアプローチは、他の固形腫瘍型の研究や良性疾患などの他のモデルシステムにも適用可能です。新鮮な卵巣組織を、追加の抗生物質と抗真菌剤を添加した不死化正常卵巣線維芽細胞増殖培地を用いて、細胞培養室まで運搬します。組織に緩く付着している上皮細胞を除去するため、サンプルを5 mLのPBSで3回洗浄します。次に、サンプルとPBSを清潔なP100培養皿に移します。滅菌済みの器具を用いて、組織を2枚目の乾燥した清潔なP100培養皿に転移させます。組織を0.5平方センチメートルの大きさに切り分け、各断片を別々のP 100ディッシュに移します。さらに組織を切り進め、1平方ミリメートル未満の大きさにします。その後、20ミリリットルのINOF GM培地を加え、培養します。位相差顕微鏡を用いて細胞の増殖を観察してください。24時間以内に細胞がディッシュに接着したことを確認します。位相差顕微鏡を用いて細胞の増殖を観察してください。通常、細胞は24時間以内にディッシュに接着します。1週間後、非接着組織を吸引により除去し、培地を補充します。その後、細胞コロニーの大きさが約500 micronsになるまで、1〜3週間の間、週2回培地を交換してください。トリップスとコーティング済みクローニングディスクを用いてクローンを単離します。100%線維芽細胞であることを確認するため、細胞株の一部をガラスカバースリップに播種し、線維芽細胞マーカー、上皮マーカー、および血管内皮細胞マーカーを用いて免疫蛍光染色を行います。H Turtのレトロウイルス導入の1日前に、正常な卵巣線維芽細胞の単離物を単一のP 1

heterotypic-three-dimensional-vitro-modeling-stromal-epithelial

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ここで説明した中皮クリアランスアッセイは、蛍光標識細胞とタイムラプスビデオ顕微鏡可視化と定量的に卵巣癌多細胞スフェロイドと中皮細胞単層の相互作用を測定するために利用しています。このアッセイは、卵巣癌転移の初期段階をモデル化します。...

in vitroで中皮クリアランスアッセイでそのモデルの卵巣がんの転移の初期段階を

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腹腔内層における卵巣癌転移のモデリング:腹膜内層のin vitro 3Dモデルを確立する方法

ここでは、多細胞相互作用やがん細胞の挙動の細胞外マトリックス依存性調節を調査するのに役立つ、3次元での共培養のプロトコールを紹介します。この実験モデルでは、ヒトのがん関連線維芽細胞を包埋したコラーゲンゲル上でがん細胞を培養します。...

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ここでは、卵巣癌細胞の接着、浸潤、増殖を調査するツールとして、初代ヒト中皮細胞と細胞外マトリックスで層状にされた線維芽細胞からなる腹腔の内層の3次元in vitroモデルを構築するためのプロトコルを提示します。...

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の調製と分析<em&gt;インビトロ</em&gt;三次元乳癌サロゲート

生理学的に関連するモデルにおける卵巣腫瘍の進行を研究するために、多細胞スフェロイドは、シミュレートされた流体の流れの下でのマイクロデバイスで培養しました。このダイナミックな3Dモデルは、卵巣癌転移が起こる細胞および機械部品を腹腔内環境をエミュレートします。...

ダイナミックな3D腹膜のマイクロデバイスに卵巣癌多細胞スフェロイドの挙動のモデル化

卵巣がん幹細胞(OCSC)は、がんの開始、再発、治療抵抗性、および転移の原因です。OCSC血管ニッチは、OCSCの自己複製を促進し、化学療法抵抗性につながると考えられています。このプロトコルは、in...

3次元共培養システムNICO-1を用いた卵巣癌幹細胞様細胞の血管遺伝学的特性の評価

このプロトコルは癌の細胞大網の相互作用の三次元(3D) ex vivo...

ヒト大網を用いた卵巣癌腹膜転移の Ex vivo モデル

がんの転移を研究するためには、ヘテロセルのクロストークを捉える3Dがんモデルが急務となっています。私たちの研究は、侵入と細胞空間分布の研究に使用できる足場および足場のない環境でのヘテロ多細胞間質-上皮の生成を示しています。...

上皮癌細胞のスキャフォールドフリー3D培養におけるヘテロ多細胞間質細胞による浸潤の促進

このプロトコルは、 in vitro および in vivoでの高悪性度漿液性卵巣癌(HGSOC)マウスモデルの開発について詳しく説明しています。マウス卵管オルガノイドの誘導から,ヒトHGSOC遺伝学を再現するための遺伝子組み換え,および腫瘍の in vivo...

高悪性度漿液性卵巣癌モデリングのための卵管上皮細胞からのマウス由来オルガノイド株の開発

学ぶ三次元異種in vitroモデリングによる卵巣がん研究の方法。線維芽細胞と上皮細胞の共培養により、腫瘍微小環境における間質-上皮相互作用を解析し、がん発生機構の解明と治療戦略の開発に貢献する。

三次元異

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