Name: ゼブラフィッシュの脳室注入 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-04-06T00:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: 学ぶゼブラフィッシュの脳室注入法。蛍光色素を用いて胚の脳室を可視化し、神経上皮の形態と脳形成を観察する技術です。発生生物学と神経科学の研究に有用です。

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著者らは実験室でこのテクニックを開発したローラアンのロウリーを感謝したいと思います。 HSはNIHMH70926によってサポートされています。ジェニファーGutzmanはCSBi /メルクポスドクによってサポートされていました。

プロトコルパート1：マイクロインジェクションのための準備<ol><li>サターインスツルメンツの針プラーを使用してキャピラリー針を引いて、注射の準備。 </li><li>蛍光色素（例えばテキサスレッドデキストランなど）を使用してニードルを埋めます。 </li><li>マイクロマニピュレータ及びマイクロインジェクション装​​置で針をマウントします。 </li><li>斜めの先端を作成するための角度で適切なサイズに針をカット。 </li><li>ドロップサイズを測定し、それがオイルに注入あたり1 2nlの間にあることを確認してください。 </li></ol>パート2：胚の準備<ol><li>興味の段階より、30分前の胚を注入する。例えば、24時間後に受精（HPF）で心室を勉強するために、23.5 HPFで胚を注入する。キンメルらによれば、胚をステージングします。 （4）。 </li><li>実体顕微鏡下で、慎重にピンセットを用いて胚から絨毛膜を除去。 </li><li> 1％アガロースでコーティングされたプラスチック製の皿を使用して、プラスチック製の100から200μlをピペットチップでアガロースの穴を突く。慎重にピンセットを用いて穴からアガロースプラグを取り外します。 </li><li>穴とアガロースの皿に胚のメディアに胚を移す。 </li><li>胚を麻酔し、実験中に動かないようにするためのメディアにtricaineを（ウェスターフィールド（5）にしたがって作られた）を追加します。 </li><li>ゆっくりと穴に胚の尾部を下にして置かないと、射出装置は胚の後方側になるように向きをそれ。 </li></ol>パート3：脳室に注入する<ol><li>脳室に注入するために、針の先端がハイパワーでの胚のような視野の同じフィールドになるようにマイクロマニピュレーションのセットアップを手配する。 </li><li>慎重に下に脳組織を押すことなくr0/r1 hingepointにちょうど後方後脳の細いroofplateを通して針を刺します。 </li><li>だけで十分な染料を完全心室を埋めるために注入する。それは胚の段階に応じて、心室のスペースを埋めるためにいくつかの注射をかかる場合があります。 </li></ol>パート4：イメージング<ol><li>きれいな1％アガロースでコーティングされた皿を使用して、皿に新しい穴を突く、プラグを取り外し、および胚を麻酔し、動きを防ぐために、tricaineを追加。 </li><li>背側のイメージのための穴と位置に心室注入胚の尾部を置きます。 </li><li>透過光を使用してイメージを取る。 </li><li>それは、胚や顕微鏡を移動させないことが非常に重要です。 </li><li>顕微鏡の設定を変更し、蛍光灯を使用してイメージを取る。 </li><li>透過光と蛍光灯の両方で横方向の画像を撮影する胚を再配置。 </li><li> Photoshopで画像処理のためのTIFFファイルとして画像を保存します。 </li></ol>第5部：画像処理<ol><li> Photoshopで画像を処理するために、透過光と同じ位置で撮影した同じ胚の蛍光画像を開きます。すべての設定は、各画像に対して同じであることを確認してください。 </li><li>透過光の像にあなたの蛍光画像をドラッグし、それらを正確に並べる。 </li><li>蛍光画像を選択した状態で、&quot;イメージ、&quot;&quot;調整して、選択&quot;し、&quot;色の置き換え&quot;と白に黒の背景を変更。 </li><li>蛍光画像は、色が均一になるまで&quot;置換色&quot;ウィンドウの右側に&quot;あいまいさ&quot;の要因を調整します。 </li><li> &quot;レイヤー&quot;ウィンドウで、オーバーレイイメージを表示するには、&quot;乗算&quot;を選択します。あなたの脳室空間のイメージが正確に透過光の像を一致させる必要があります。 </li><li>他の画像については、このファイルと繰り返しを保存します。 </li></ol>代表的な結果/成果誤った注入の画像の例はEHに示されている間は、適切な心室の注入イメージは、図1のパネルのADに示されています。適切な注射はシャープなエッジと非拡散色素を持っている。針を心室に遠く挿入されたときに発生すると、以下の脳組織に当たる誤った注射は、、心室スペースの外に目に見えると卵黄にある色素になる可能性があります。 <img src="/files/ftp_upload/1218/1218figure1.png" alt="図1" width="600" height="742" /> 図1。 25 HPF野生型の胚の心室注射。（AD）正しい注射方法と（EH）不正な注入方法は、例として示されています。対応する蛍光像（B、F）と示される正しいと誤った注入法の両方の蛍光と明視野画像（C、G）のオーバーレイと（、E）背明視野像。矢印は、染料が正しくない心室インジェクション（&quot;トラブルシューティング&quot;を参照）に起因する脳室の空間を超えてしまった領域を示している。前方には、すべての画像の左側にあります。 トラブルシューティング： <table border="1"><tbody><tr style="font-weight:bold; font-size:16px;"><td>問題が</tD&gt; <td>原因と</td><td>救済策</td></tr><tr><td>あなたは針で胚を押しつぶしている。 </td><td>あなたの針は、あまりにも鈍さや先端が大きすぎる。 </td><td>新しい針で起動し、それをさかのぼっ損ないません。ベベルは、針注射器の針のようにそれがシャープにする。 </td></tr><tr><td>染料は、胚と卵黄を通してである（図1E - H参照）。 </td><td>あなたの針は、組織を経て心室空間に滞在していない。 </td><td>あなたの針が十分にシャープではないかもしれない、あなたが穿刺の速度を制御することができないので。 </td></tr><tr><td>染料は、前脳であまりにもかすかなかではありません。 </td><td>あなたは、注射のための十分に高い圧力を使用していない、またはあなたの針が十分では、色素を注入するときに脳に到達する前ではなかった。 </td><td>あなたの射出圧力を増加したり、針がわずかに前方に注入中に置きます。より詳細な情報が脳に必要な場合には、中脳後脳境界を通して針を置くことができます。また、単に画像処理の前にさらに拡散するために染料のためのビットを待つことができます。 </td></tr><tr><td>あなたの蛍光画像は、Photoshopで色置換後のエッジの周りに暗いです。 </td><td>あなたは、色の置換]ウィンドウで、&quot;あいまいさ&quot;の設定を変更するのを忘れ。 </td><td> &quot;曖昧さの&quot;カラーの置換]ウィンドウの右端まで移動します。 </td></tr><tr><td>針は、穿刺後脳のroofplateをしません。 </td><td>あなたの針が適切にカットされていません。 </td><td>新しい針を作る。あなたが注射をたくさんやっている場合はそれらが鈍い得ることができるように、いくつかの針が必要になる場合があります。 </td></tr></tbody></table>

<ol><li>Gutzman, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+the+zebrafish+midbrain-hindbrain+boundary+constriction+requires+laminin-dependent+basal+constriction%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">Formation of the zebrafish midbrain-hindbrain boundary constriction requires laminin-dependent basal constriction.</a> Mech. Dev. 125, 974-983 (2008).</li>
<li>Lowery, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+Classification+of+Zebrafish+Brain+Morphology+Mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Anat.+Rec.+%28Hoboken%29%22%5BJournal%5D)">Characterization and Classification of Zebrafish Brain Morphology Mutants.</a> Anat. Rec. (Hoboken). 292, 94-106 (2009).</li>
<li>Lowery, L. A., Sive, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+formation+of+zebrafish+brain+ventricles+occurs+independently+of+circulation+and+requires+the+nagie+oko+and+snakehead%2Fatp1a1a.1+gene+products%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Initial formation of zebrafish brain ventricles occurs independently of circulation and requires the nagie oko and snakehead/atp1a1a.1 gene products.</a> Development. 132, 2057-2067 (2005).</li>
<li>Kimmel, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).</li>
<li>Westerfield, M. The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish. , University of Oregon Press. (1995).</li>
</ol>

このビデオでは、ゼブラフィッシュの脳室の開発に蛍光色素（テキサスレッドデキストラン）を注入する方法を示しています。このメソッドは、周囲の神経上皮とは対照的に、脳室のスペースを視覚化するために使用し、心室空間の形状だけでなく、周囲の脳組織の形状を決定するための非常に便利です。それは、私たちはより良い生きている胎児の時間をかけて脳室の形成と脳の形態形成の過程を理解することができます。この手法は、脳室の形成の欠陥を研究するためと初期特性と脳の形態形成突然変異体の研究のための優れたツールです。

<table><tbody><tr><td>ピンセット</td><td>器具</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>キャピラリーチューブ（針）</td><td>器具</td><td>Frederick Haer and Co.</td><td>30-30-1</td><td></td></tr><tr><td>アガロースコーティングディッシュ</td><td>器具</td><td>アガロース (Seakem GTG; Lonza) ディッシュ (Corning)</td><td>アガロース (50027) ディッシュ (430166)</td><td>注入する胚のステージに応じて、ディッシュ内のアガロースを約2-3 mmの深さにしてください</td></tr><tr><td>解剖顕微鏡</td><td>顕微鏡</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>蛍光機能および画像キャプチャソフトウェア付き顕微鏡カメラ</td><td>器具</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1-200 &amp;mu; ピペットチップ</td><td>器具</td><td>USA Scientific, Inc.</td><td>1111-0806</td><td>アガロースに穴を開け、胚をぴったりと収めるのに最適なサイズです</td></tr><tr><td>Photoshop</td><td>画像解析</td><td>Adobe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>胚用ループ</td><td>器具</td><td></td><td></td><td>ガラスピペットと毛または釣り糸を用いて自作し、蜜蝋で封止してください</td></tr><tr><td>マイクロインジェクター</td><td>器具</td><td>Harvard Apparatus</td><td>PL1-100</td><td></td></tr><tr><td>ニードルプラー</td><td>器具</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td></td><td>設定（Heat 785, Pull 70, Velocity 40, Time 70）</td></tr><tr><td>マイクロマニピュレーター</td><td>器具</td><td>Narishige International</td><td></td><td></td></tr><tr><td>蛍光染料 Texas-Red Dextran 70,000MW</td><td>試薬</td><td>Molecular Probes, Life Technologies</td><td>D1830</td><td>必要に応じて、他の分子量も利用可能です</td></tr><tr><td>トリカイン（3-アミノ安息香酸エチル）</td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-5040</td><td></td></tr><tr><td>胚培養液</td><td>試薬</td><td></td><td></td><td>Westerfield (5) に準拠</td></tr></tbody></table>

ゼブラフィッシュの脳室注入

Zebrafish Brain Ventricle Injection

胚の脳の発達の間に適切な脳室の形成は正常な脳機能に必要です。脳室は脳脊髄液で満たされている脳内で高度に保存されて空洞です。それは脳室の形成を生じる流体で満たされる間、ゼブラフィッシュでは、神経管形成後に、神経上皮では狭窄やひだのシリーズを受ける。心室形成の過程、および同時に発生する神経上皮の形状の変化を理解するために、我々は、脳組織に比較して心室の領域を可視化する方法が必要でした。しかし、透明なゼブラフィッシュの胚の性質は、それが困難な心室スペースから組織を区別することができます。したがって、我々は、心室のスペースが蛍光色素を充填し、明視野および蛍光顕微鏡によって撮像される脳室注入の技術を開発した。明視野および蛍光イメージは、処理され、Photoshopで重畳されています。この技法は、明視野像における神経上皮の形状と比較して、蛍光色素による心室空間の可視化が可能になります。ゼブラフィッシュの脳室注入は、初期の幼虫の段階を経て18時間後の受精から採用することができます。我々は、脳室の形成と形態形成の我々の研究だけでなく、脳の形態形成変異体（1-3）を特徴付けるに広くこの技術を使用している。

神経管形成後に、神経上皮は収縮し、真空管が胚の脳室を形成するために胚性脳脊髄液（eCSF）でいっぱいにしながら折る。我々は、よりよい生きている胎児の神経上皮の形状とは対照的に、流体の満たされた空間を視覚化するために、この心室注入技術を開発した。

胚の脳発達過程における適切な脳室形成は、正常な脳機能に不可欠である。脳室は、高度に保存された...

この手順は、ゼブラフィッシュ胚のステージ判定から始まります。胚が目的のステージに達したら、卵膜から取り出します。次に、ピペットチップを用いてアロスコーティングされたディッシュに穴を開けて胚を固定するための準備をし、胚の尾側を下にして静かに穴の中に配置します。胚を固定した後、後脳を通じて胚の脳室腔に蛍光染料を慎重に注入します。脳室への注入後、胚をイメージングし、Photoshopを用いてデータを処理します。こんにちは、私はマサチューセッツ州ケンブリッジにあるMITホワイトヘッド生物医学研究所のHazel Sieve博士の研究室のJennifer Gutmanです。本日は、ゼブラフィッシュの脳室注入の手順について解説します。当研究室では、生きたゼブラフィッシュにおける脳室形成と神経上皮の形態形成を研究するためにこの手法を用いています。ゼブラフィッシュの胚は透明であるという特性を持つため、脳室の形状を特徴づけることは困難な場合があります。この手法は、液体で満たされた空間を周囲の組織から区別し、脳室形成に欠損がある可能性のある変異胚を特徴付けるための、有用かつ簡便な方法です。それでは、始めていきましょう。ゼブラフィッシュの脳室に注入する準備として、まずは注入用針を作製します。Sutter社のニードルプラーを用いて、キャピラリーニードルを・引き伸ばします。次に、テキサスレッドデキストリンなどの蛍光色素をキャピラリーニードルに充填します。その後、色素を充填したニードルをマイクロインジェクション装置のマイクロマニピュレーターに取り付けます。針を適切なサイズに斜めにカットします。ベベルチップを作成するために、針の液滴サイズを測定し、オイル中での1注入あたり1～2ナノリットルであることを確認してください。この手順のステージを開始するには、Kimmelらの基準に従い、すべての胚を目的のステージの30分前に注入する必要があります。例えば、受精後24時間の脳室を研究する場合、受精後23時間半に胚に注入を行います。目的の段階の胚を実体顕微鏡下に置き、ピンセットを用いて胚から絨毛膜を慎重に除去します。次に、1%アガロースをコーティングしたプラスチック製ディッシュを用いて、胚用のアガロースディッシュを作成し、1〜200 µLピペットチップを用いてアガロースに穴を開けます。ピンセットを用いて、穴からアロスプラグを慎重に取り除きます。胚と胚培養液を、穴のあるアロスディッシュに移します。胚を麻酔し、動きを止めるために、培養液にトリカインを添加します。実験中、胚の尾側を下にして慎重に穴に配置し、注射装置が胚の後側にくるように向きを調整します。胚がアガロースディッシュ内に正しく配置および方向付けられたので、脳室への注射を行う準備が整いました。まず、高倍率で胚と同じ視野に針先が入るように、マイクロマニピュレーターの設定を調整します。後脳のR0-R1ヒンジポイントの直後にある薄い屋根板に、下の脳組織を傷つけないよう慎重に針を刺し、脳室が完全に満たされるまで十分な量の染料を注入します。胚のステージによっては、脳室空間を満たすために数回の注入が必要な場合があります。胚への注入が完了し、イメージングの準備が整ったら、胚用の新しいアガロースディッシュを用意します。清潔な1%arosコーティング済みのディッシュを用い、ディッシュに穴を開けてプラグを取り除きます。胚をディッシュに移し、胚を麻酔して動きを止めるためにtricaを加えます。脳室に注入した胚の尾部を、背面像が得られる位置に穴に合わせて配置します。胚のイメージング準備が整いました。透過光を用いて撮影します。胚や顕微鏡を動かさないことが極めて重要です。次に、顕微鏡の設定を変更し、蛍光光で画像を撮影します。胚の位置を調整し、透過光と蛍光光の両方で側面画像を撮影します。すべての画像を、Photoshopで画像処理するためのファイルとして保存してください。Photoshopで画像を処理するには、同一胚の同じ位置で撮影された透過光画像と蛍光光画像を同時に開きます。すべての設定が同一であることを確認してください。各画像について、蛍光画像を透過光画像の上にドラッグし、蛍光画像を選択した状態で正確に位置を合わせます。「イメージ」から「色調補正」を選択し、「色の置き換え」で黒い背景を白に変更します。「色域指定」ウィンドウで、蛍光画像の色が均一に見えるまで「許容値」を右に調整します。「レイヤー」ウィンドウで「乗算」を選択します。オーバーレイ画像を確認し、脳室腔の画像が透過光画像と正確に一致していることを確認してください。このファイルを保存し、他のすべての画像についても同様に繰り返します。脳室への注入が正しく行われていれば、これらの25 hours post fertilizationの胚の画像に示されているように、染料が拡散していない部分は境界が鮮明になるはずです。パネルAは明視野像、パネルBは蛍光像、パネルCは重ね合わせ像を示しています。オーバーレイ画像の側面図をパネルDに示します。一方で、脳室への注入時に針を深く挿入しすぎると、脳室腔の下の脳組織に入り込み、誤った注入につながります。その結果、ここに示すように、染料が脳室腔の外側や卵黄に見えるようになります。パネルEに明視野像を示します。パネルFに蛍光画像、パネルGに重ね合わせ画像を示します。重ね合わせ画像の側面図はパネルHに示されています。矢印は、色素が脳室腔を超えて浸透した領域を示しています。本ビデオでは、発生中のゼブラフィッシュの脳室に蛍光色素を注入する方法を実演しました。本手法は、周囲の神経上皮と対比させて脳室腔を可視化するために用いられ、脳室腔の形態および周囲の脳組織の形態を決定する上で極めて有用です。この技術により、生存胚における脳室形成および脳形態形成の過程を、経時的に詳細に理解することが可能になります。本手法は、脳室形成不全の研究や、脳形態形成変異体の初期特性評価を行うための優れたツールとなります。以上です。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。

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