ゼブラフィッシュの脳室注入

この手順は、ゼブラフィッシュ胚のステージ判定から始まります。胚が目的のステージに達したら、卵膜から取り出します。次に、ピペットチップを用いてアロスコーティングされたディッシュに穴を開けて胚を固定するための準備をし、胚の尾側を下にして静かに穴の中に配置します。

胚を固定した後、後脳を通じて胚の脳室腔に蛍光染料を慎重に注入します。脳室への注入後、胚をイメージングし、Photoshopを用いてデータを処理します。こんにちは、私はマサチューセッツ州ケンブリッジにあるMITホワイトヘッド生物医学研究所のHazel Sieve博士の研究室のJennifer Gutmanです。

本日は、ゼブラフィッシュの脳室注入の手順について解説します。当研究室では、生きたゼブラフィッシュにおける脳室形成と神経上皮の形態形成を研究するためにこの手法を用いています。ゼブラフィッシュの胚は透明であるという特性を持つため、脳室の形状を特徴づけることは困難な場合があります。

この手法は、液体で満たされた空間を周囲の組織から区別し、脳室形成に欠損がある可能性のある変異胚を特徴付けるための、有用かつ簡便な方法です。それでは、始めていきましょう。ゼブラフィッシュの脳室に注入する準備として、まずは注入用針を作製します。

Sutter社のニードルプラーを用いて、キャピラリーニードルを・引き伸ばします。次に、テキサスレッドデキストリンなどの蛍光色素をキャピラリーニードルに充填します。その後、色素を充填したニードルをマイクロインジェクション装置のマイクロマニピュレーターに取り付けます。

針を適切なサイズに斜めにカットします。ベベルチップを作成するために、針の液滴サイズを測定し、オイル中での1注入あたり1～2ナノリットルであることを確認してください。この手順のステージを開始するには、Kimmelらの基準に従い、すべての胚を目的のステージの30分前に注入する必要があります。

例えば、受精後24時間の脳室を研究する場合、受精後23時間半に胚に注入を行います。目的の段階の胚を実体顕微鏡下に置き、ピンセットを用いて胚から絨毛膜を慎重に除去します。次に、1%アガロースをコーティングしたプラスチック製ディッシュを用いて、胚用のアガロースディッシュを作成し、1〜200 µLピペットチップを用いてアガロースに穴を開けます。

ピンセットを用いて、穴からアロスプラグを慎重に取り除きます。胚と胚培養液を、穴のあるアロスディッシュに移します。胚を麻酔し、動きを止めるために、培養液にトリカインを添加します。

実験中、胚の尾側を下にして慎重に穴に配置し、注射装置が胚の後側にくるように向きを調整します。胚がアガロースディッシュ内に正しく配置および方向付けられたので、脳室への注射を行う準備が整いました。まず、高倍率で胚と同じ視野に針先が入るように、マイクロマニピュレーターの設定を調整します。

後脳のR0-R1ヒンジポイントの直後にある薄い屋根板に、下の脳組織を傷つけないよう慎重に針を刺し、脳室が完全に満たされるまで十分な量の染料を注入します。胚のステージによっては、脳室空間を満たすために数回の注入が必要な場合があります。胚への注入が完了し、イメージングの準備が整ったら、胚用の新しいアガロースディッシュを用意します。

清潔な1%arosコーティング済みのディッシュを用い、ディッシュに穴を開けてプラグを取り除きます。胚をディッシュに移し、胚を麻酔して動きを止めるためにtricaを加えます。脳室に注入した胚の尾部を、背面像が得られる位置に穴に合わせて配置します。

胚のイメージング準備が整いました。透過光を用いて撮影します。胚や顕微鏡を動かさないことが極めて重要です。

次に、顕微鏡の設定を変更し、蛍光光で画像を撮影します。胚の位置を調整し、透過光と蛍光光の両方で側面画像を撮影します。すべての画像を、Photoshopで画像処理するためのファイルとして保存してください。

Photoshopで画像を処理するには、同一胚の同じ位置で撮影された透過光画像と蛍光光画像を同時に開きます。すべての設定が同一であることを確認してください。各画像について、蛍光画像を透過光画像の上にドラッグし、蛍光画像を選択した状態で正確に位置を合わせます。「イメージ」から「色調補正」を選択し、「色の置き換え」で黒い背景を白に変更します。

「色域指定」ウィンドウで、蛍光画像の色が均一に見えるまで「許容値」を右に調整します。「レイヤー」ウィンドウで「乗算」を選択します。オーバーレイ画像を確認し、脳室腔の画像が透過光画像と正確に一致していることを確認してください。

このファイルを保存し、他のすべての画像についても同様に繰り返します。脳室への注入が正しく行われていれば、これらの25 hours post fertilizationの胚の画像に示されているように、染料が拡散していない部分は境界が鮮明になるはずです。パネルAは明視野像、パネルBは蛍光像、パネルCは重ね合わせ像を示しています。

オーバーレイ画像の側面図をパネルDに示します。一方で、脳室への注入時に針を深く挿入しすぎると、脳室腔の下の脳組織に入り込み、誤った注入につながります。その結果、ここに示すように、染料が脳室腔の外側や卵黄に見えるようになります。パネルEに明視野像を示します。

パネルFに蛍光画像、パネルGに重ね合わせ画像を示します。重ね合わせ画像の側面図はパネルHに示されています。矢印は、色素が脳室腔を超えて浸透した領域を示しています。本ビデオでは、発生中のゼブラフィッシュの脳室に蛍光色素を注入する方法を実演しました。

本手法は、周囲の神経上皮と対比させて脳室腔を可視化するために用いられ、脳室腔の形態および周囲の脳組織の形態を決定する上で極めて有用です。この技術により、生存胚における脳室形成および脳形態形成の過程を、経時的に詳細に理解することが可能になります。本手法は、脳室形成不全の研究や、脳形態形成変異体の初期特性評価を行うための優れたツールとなります。

以上です。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。