ゼブラフィッシュの脳室注入
April 6th, 2009
神経管形成後に、神経上皮は収縮し、真空管が胚の脳室を形成するために胚性脳脊髄液（eCSF）でいっぱいにしながら折る。我々は、よりよい生きている胎児の神経上皮の形状とは対照的に、流体の満たされた空間を視覚化するために、この心室注入技術を開発した。
この手順は、ゼブラフィッシュの胚の病期分類から始まります。胚が目的の段階に達したら、それらをコリオンから取り出します。次に、胚を取り付けるためのピペットチップを備えたarosコーティングされた皿に穴が開かれ、胚は尾を下にして穴にそっと配置されます。
胚がマウントされた後、蛍光ダイが後脳を通じて胚の心室空間に慎重に注入されます。心室注入後、胚を画像化し、Photoshopを使用してデータを処理します。こんにちは、マサチューセッツ州ケンブリッジにあるMITのホワイトヘッド生物医学研究所のヘイゼル・シーブ博士の研究室のジェニファー・ガットマンです。
今日は、ゼブラフィッシュの脳室注射の手順をお見せします。当研究室では、この手法を用いて、生きたゼブラフィッシュの脳室形成と神経上皮形態形成を研究しています。透明なゼブラフィッシュの胚の性質上、脳室の形状を特徴付けるのは難しい場合があります。
この技術は、液体で満たされた空間を周囲の組織から区別し、脳心室形成障害を有する可能性のある変異胚を特徴付けるための有用で簡単な方法です。それでは始めましょう。ゼブラフィッシュの脳室に注射する準備をするために、注射針を作ることから始めます。
サッター機器の針極性は、毛細管針を引っ張るために使用されます。次に、毛細血管針にテキサスレッドデキストリンなどの蛍光染料を充填します。次に、充填された針をマイクロインジェクション装置のマイクロマニピュレータに装着します。
針を斜めに適切なサイズに切ります。斜めの先端を作成するには、針の液滴サイズを測定し、オイルへの注入ごとに1〜2ナノリットルであることを確認します。この手順の段階を開始するには、キンメルによれば、すべての胚に関心のある段階よりも30分早く胚を注入する必要があります。
たとえば、受精後24時間で心室を研究するには、受精後23時間半で胚を注入します。目的の段階の胚を実体顕微鏡下に配置し、鉗子を使用して胚からコリオンを慎重に除去します。次に、胚用のアロス皿は、プラスチック製の1〜200マイクロリットルのピペットチップでアロスに1%アロスの突っ穴をコーティングしたプラスチック皿を使用して作られます。
鉗子を使用して、アロスプラグを穴から慎重に取り外します。胚と胚培地を穴の開いたアロス皿に移します。メディアにトリカを追加して、胚に麻酔をかけ、動きを防ぎます。
実験中は、胚の尾を穴にそっと置き、注入装置が胚の後側にくるように向きを変えます。胚がバラバラ皿に正しく配置され、向きが決まったので、脳室注射の準備が整いました。まず、針先が高出力の胚と同じ視野にくるようにマイクロマニピュレーションのセットアップを配置します。
下の脳組織に当たらないように、R zero R 1ヒンジポイントのすぐ後方にある後脳の薄い屋根板に針を慎重に通し、心室を完全に満たすのに十分な色素を注入します。胚の病期によっては、心室空間を埋めるために数回の注射が必要になる場合があります。胚が注入され、イメージングの準備ができたら、胚用の新しいアロス皿が準備されます。
清潔な1%アロスコーティングされた皿を使用して、皿に穴を開け、プラグを取り外します。胚を皿に移し、トリカを加えて胚に麻酔をかけ、動きを防ぎます。注入された心室の胚の尾を、背側像の位置の穴に配置します。
これで、胚をイメージングする準備が整いました。透過光を使用して画像を撮影します。胚や顕微鏡を動かさないことが非常に重要です。
次に、顕微鏡の設定を変更し、蛍光灯で画像を撮影します。透過光と蛍光灯の両方で横方向の画像を撮影するために、胚を再配置します。Photoshopの画像処理用のファイルとしてすべての画像を保存します。
Photoshopで画像を処理するには、同じ位置で撮影した同じ胚の透過光画像と蛍光光画像を開きます。すべての設定が同じであることを確認してください 各画像について、蛍光画像を透過光画像にドラッグし、選択した蛍光画像と正確に並べます。画像の調整を選択し、色を置き換えて、黒い背景を白に変更します。
[色の置換] ウィンドウで、蛍光画像の色が均一になるまで、ぼやけ係数を右に調整します。レイヤーウィンドウで、[乗算] を選択します。オーバーレイ画像を表示するには、心室空間の画像が透過光の画像と一致する必要があります。その通り。
このファイルを保存し、他の画像に対して繰り返します。心室注射が正しく行われると、これらの 25 時間の画像に示すように、画像は非拡散性染料で鋭いエッジを持つはずです。受精後、タイプ胚パネルAは明視野画像を示し、パネルBは蛍光画像を示し、パネルCはオーバーレイ画像を示します。
一方、心室注射中に針が挿入されすぎると、針が心室空間の下の脳組織に入り込み、誤った注射につながります。これにより、ここに示すように、心室空間の外側と卵黄に見える染料が得られます。パネルEは明視野画像を示しています。
パネルFは蛍光画像を示し、パネルGは重ね合わせ画像を示しています。重ね合わせた画像の側面図をパネルHに示します.矢印は、色素が脳室空間を超えた領域を示しています。このビデオでは、発生中のゼブラフィッシュの脳室に蛍光色素を注入する方法を示しました。
この方法は、周囲の神経上皮とは対照的に脳心室空間を可視化するために使用され、心室空間の形状や周囲の脳組織の形状を決定するのに非常に役立ちます。この技術により、生きた胚における脳室形成と脳形態形成の経時的な過程をよりよく理解することができます。これは、脳の心室形成障害を研究し、脳の形態形成変異体の初期特性評価を行うための優れたツールです。
というわけで、これだけです。ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。
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概要
この記事では、ゼブラフィッシュ胚の脳室注入技術について説明し、胚の脳室を可視化する。この方法は、生きた胚における神経上皮の形態と流体力学の理解を深める。
主要な研究要素
科学の分野
- 神経科学
- 発生生物学
- 胚発生学
背景
- 神経管形成は胚発生における重要なプロセスである。
- 胚の脳脊髄液（eCSF）は脳室形成に関与する。
- 生きた胚内でこれらの構造を可視化することで、発生プロセスへの洞察が得られる。
- 脳室注入技術により、これらの構造をより良くイメージングできる。
研究目的
- ゼブラフィッシュ胚の脳室に蛍光染料を注入する技術を開発する。
- 胚の脳内の液体充填空間の可視化を改善する。
- 発生中の神経上皮力学の理解を深める。
使用された方法
- 目的の発生段階までゼブラフィッシュ胚の段階化。
- ピペットチップを使用してarosコーティングされた皿に胚をマウントする。
- 後脳を通じて脳室空間に蛍光染料を注入する。
- 注入後の胚のイメージングとPhotoshopによるデータ処理。
主要な結果
- 脳室注入技術はeCSF充填空間を成功裏に可視化する。
- 胚は注入後に神経上皮の形状の明確なイメージングを示す。
- この方法は胚の脳発生を研究するための信頼性の高いアプローチを提供する。
- データ処理技術はイメージング結果の明瞭さを向上させる。
結論
- 脳室注入技術はゼブラフィッシュ胚の生きたイメージングに効果的である。
- この方法は神経発生の様々な側面を研究するために利用できる。
- 将来の応用には、遺伝子改変が脳の発達に与える影響の調査が含まれる可能性がある。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Visualizing fluid-filled cavities in live embryos supports mechanistic de-risking in neurodevelopmental target validation by clarifying structure-function relationships. This technique enables quantitative assessment of neuroepithelial dynamics, improving predictive confidence in early discovery. It aids in prioritizing genetic or pharmacological interventions based on phenotypic brain morphogenesis.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of ventricular morphology as a phenotypic readout for neuroepithelial shape changes.
- Operational Value: Provides a live-imaging compatible method to distinguish fluid spaces from tissue in transparent models.
- Predictive Value: Supports functional target validation by linking genetic perturbations to ventricular defects.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized fluorescent and brightfield outputs for comparative analysis across conditions.
- Quantitative Output: Facilitates measurement of ventricle size and shape as dependent variables in screening campaigns.
- Reproducibility: Enables consistent ventricular labeling for cross-experiment comparison in multiwell formats.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models conserved vertebrate brain ventricle formation, relevant to human neurodevelopmental disorder studies.
- Translational Continuity: Connects early neuroepithelial patterning to later brain structure and function.
- Mechanistic De-risking: Reduces ambiguity in distinguishing primary ventricular defects from secondary tissue abnormalities.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows where phenotypic screening requires structural validation of fluid-filled compartments in living systems.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling direct visualization of ventricle formation dynamics.
- Screening: Delivers assay-ready samples with quantifiable ventricular morphology for compound or genetic library evaluation.
- Analytics: Provides image-based morphometric outputs that can be statistically compared across experimental groups.
- Translational Research: Links embryonic ventricle phenotypes to potential postnatal neurological outcomes.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform for neurodevelopmental target and pathway validation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence by reducing phenotypic ambiguity in neurodevelopmental models.
- Operational Value: Standardizes ventricular labeling for reproducible imaging across laboratories and timepoints.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing structural phenotyping data early in the discovery pipeline.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement of candidates based on brain morphogenesis safety profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish embryology and microinjection techniques.
- Dependent on fluorescent dye compatibility and injection volume precision (1-2 nL).
- Necessitates standardized mounting and anesthesia protocols to prevent embryo movement during imaging.
- Requires image processing capability (e.g., Photoshop) for overlay and analysis of brightfield and fluorescent channels.
- Limited to embryonic and early larval stages due to increasing tissue opacity and ventricular accessibility.
