Name: 胚形成の間に機能的な冗長性をテストするための逆遺伝学的アプローチ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-11T17:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 59 s
Description: 学ぶ ゼブラフィッシュ胚における遺伝子の機能的冗長性を、モルフィノを用いた逆遺伝学的手法で検証する方法です。細胞系譜の決定における遺伝子相互作用を定量的に評価し、発生生物学の重要な知見を得られます。

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我々は、このプレゼンテーションの準備で彼らの助けのためにエヴァンスの研究室のメンバーに感謝。ここで使用されるモルフォは、もともと博士オードリーHoltzingerにより検証された。 TEは、国立衛生研究所（HL064282とHL056182）からの補助金によってサポートされています。動物実験は、ワイルコーネル医科大学の動物実験委員会の研究所が定めるガイドラインおよび規則に従って、行われた。

<ol><li>Heicklen-Klein, A., McReynolds, L. J., Evans, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+the+zebrafish+model+to+study+GATA+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Using the zebrafish model to study GATA transcription factors.</a> Semin Cell Dev Biol. 16, 95-106 (2005).</li>
<li>Bill, B. R., Petzold, A. M., Clark, K. J., Schimmenti, L. A., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+primer+for+morpholino+use+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">A primer for morpholino use in zebrafish.</a> Zebrafish. 6, 69-77 (2009).</li>
<li>Holtzinger, A., Evans, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gata5+and+Gata6+are+functionally+redundant+in+zebrafish+for+specification+of+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Gata5 and Gata6 are functionally redundant in zebrafish for specification of cardiomyocytes.</a> Dev Biol. 312, 613-622 (2007).</li>
<li>Peterkin, T., Gibson, A., Patient, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redundancy+and+evolution+of+GATA+factor+requirements+in+development+of+the+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Redundancy and evolution of GATA factor requirements in development of the myocardium.</a> Dev Biol. 311, 623-635 (2007).</li>
<li>Holtzinger, A., Evans, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gata4+regulates+the+formation+of+multiple+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Gata4 regulates the formation of multiple organs.</a> Development. 132, 4005-4014 (2005).</li>
<li>Sorrentino, R. P., Gajewski, K. M., Schulz, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GATA+factors+in+Drosophila+heart+and+blood+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">GATA factors in Drosophila heart and blood cell development.</a> Semin Cell Dev Biol. 16, 107-116 (2005).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

実験は、ここで説明では、我々は2つ​​のモルフォ、単独で表現型の異なる範囲を生成、そのうち、それぞれを組み合わせて、それらが一緒に共同注入した全く異なる表現型を発見した。もちろん、我々は最初の場所でこの実験を行うための正当化を必要としていました。我々は2つ​​の遺伝子が、この場合心臓の仕様で、以前の関数のためにお互いを補うかもしれないことを疑った。遺伝子が高度に関連している（と同じDNA配列に結合することができる）と胚5でパターンがオーバーラップで表現されているためです。さらに、 ショウジョウバエの遺伝学的実験GATA転写因子は、心臓の仕様6で必要とされるべきであることが示された。 しかし、この戦略は、遺伝的相互作用の機能的な冗長性あるいはより一般的にテストするために使用されている他の状況があります。最初に、一方または両方の遺伝子のノックダウンは明らかな表現型を生成しないことがあります。この場合、それぞれの遺伝子に対して定義された閾値レベルは存在しない、および使用するためにモルフォリノの量は、経験的に定義され、それらが胚...

<table><tbody><tr><td>魚類飼育タンクおよび仕切り板</td><td>Aquatic Habitats</td><td></td><td></td></tr><tr><td>魚用ネット</td><td>Aquatic Habitats</td><td></td><td></td></tr><tr><td>システム水</td><td></td><td></td><td>dH2O 1Lあたり60mg Instant Ocean&amp;#8221;</td></tr><tr><td>100mmペトリ皿</td><td>BD Biosciences</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>マイクロピペットニードルプラー</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97 Flaming/Brown</td><td></td></tr><tr><td>3.5&quot; ガラスキャピラリー</td><td>Drummond Scientific</td><td>3-000-203-G/X</td><td></td></tr><tr><td>カミソリ刃</td><td>Personna Medical Care</td><td>94-120-71</td><td></td></tr><tr><td>マイクログラインダー</td><td>Narishige International</td><td>EG-4</td><td></td></tr><tr><td>目盛付き顕微鏡接眼レンズ</td><td>Premiere</td><td>MF-02</td><td></td></tr><tr><td>マイクロメーター</td><td>WARD&amp;rsquo;s Natural Science</td><td>94 W 9910</td><td></td></tr><tr><td>超純アガロース</td><td>Invitrogen</td><td>15510-027</td><td></td></tr><tr><td>スパチュラ</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-357Q</td><td></td></tr><tr><td>電子天秤</td><td>Mettler Toledo</td><td>AB54-S/FACT</td><td></td></tr><tr><td>使い捨て計量皿</td><td>Fisher Scientific</td><td>2-202-B</td><td></td></tr><tr><td>汎用電子レンジ</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>エルレンマイヤーフラスコ</td><td>Corning</td><td>4980</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡スライドガラス</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-552</td><td></td></tr><tr><td>メスシリンダー</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-572-6D</td><td></td></tr><tr><td>自動ピペットマン</td><td>BrandTech</td><td>2026333</td><td></td></tr><tr><td>70% エタノール洗浄液</td><td>Tarr</td><td>801VWR</td><td></td></tr><tr><td>N2タンク</td><td>Tech Air</td><td></td><td></td></tr><tr><td>マイクロインジェクター</td><td>Harvard Apparatus</td><td>PLI-100</td><td></td></tr><tr><td>マイクロマニピュレーター</td><td>Micro Instruments</td><td>LTD</td><td></td></tr><tr><td>解剖顕微鏡</td><td>Nikon Instruments</td><td>SMZ1500</td><td></td></tr><tr><td>パラフィルム</td><td>American National Can</td><td>PM-992</td><td></td></tr><tr><td>ミネラルオイル</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5904</td><td></td></tr><tr><td>キムワイプス</td><td>Kimberly-Clark Corporation</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;gata5&lt;/em&gt; スプライス部位モルフォリノ</td><td>Genetools, LLC</td><td></td><td>5&amp;rsquo;-TCTTAAGATTTTTACCTATACTGGA-3&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>gata5 ATGブロッカー</td><td>Genetools, LLC</td><td></td><td>5&amp;rsquo;-AAGATAAAGCCAGGCTCGAATACAT-3&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;gata6&lt;/em&gt; Long Isoform ATGブロッカー</td><td>Genetools, LLC</td><td></td><td>5&amp;rsquo;-AGCTGTTATCACCCAGGTCCATCCA-3&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>使い捨てパストールピペット</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20B</td><td></td></tr><tr><td>トリカインメシル酸塩</td><td>Argent Labs</td><td>MS-222</td><td></td></tr><tr><td>メチルセルロース</td><td>ICN Biomedicals</td><td>155495</td><td></td></tr><tr><td>ドライバス（ヒートブロック）</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-718-4</td><td></td></tr><tr><td>精密ピンセット</td><td>Dumont</td><td></td><td>サイズ 55</td></tr><tr><td>凹型マイクロスライドガラス</td><td>VWR international</td><td>48339-009</td><td></td></tr></tbody></table>

胚形成の間に機能的な冗長性をテストするための逆遺伝学的アプローチ

A Reverse Genetic Approach to Test Functional Redundancy During Embryogenesis

胚発生時の遺伝子の機能は通常、マウスにおける標的特異的変異（ノックアウト）するなどして、機能喪失実験によって定義されています。ゼブラフィッシュのモデルでは、効果的な逆遺伝学的手法は、遺伝子特異的アンチセンスモルフォのマイクロインジェクションを使用して開発されました。モルフォは、胚発生（ノックダウン）の間に数日間のための翻訳を阻害するか、選択的スプライシングによって一過性に特異的塩基対形成とブロックの遺伝子の機能を介してmRNAをターゲットとしています。しかし、マウスやゼブラフィッシュなどの脊椎動物では、いくつかの遺伝子の機能は、損失を補償する他の遺伝子の存在により、これらのアプローチによって隠されることができる。これは、同じ発展途上の組織で共発現している姉妹の遺伝子を含む遺伝子ファミリーのために特に当てはまります。ゼブラフィッシュでは、機能的な補償は、その同時に両遺伝子のターゲットのノックダウンモルフォの同時注入によって、比較的高スループットな方法でテストすることができます。同様に、モルフォを使用して、任意の2つの遺伝子間の遺伝的相互作用は、サブスレッショルドレベルで一緒に両遺伝子のノックダウンによって実証することができます。例えば、モルフォは、どちらも個々のノックダウンは、表現型を生成するように滴定することができます。 、これらの条件下で、両方モルフォの同時注入が表現型を引き起こす場合、遺伝的相互作用が示されています。ここでは2つの関連GATA転写因子のコンテキスト内で機能的な冗長性を表示する方法を示します。 GATA因子は、心臓前駆細胞の仕様のために不可欠ですが、これはのみGata5とGata6両方の損失が明らかにされる。我々は、マイクロインジェクション実験を行うモルフォの検証、および心臓発生のための補償表現型を評価する方法を示します。

別の遺伝子による補償がある場合は、遺伝子の機能は、機能喪失実験で隠されることができる。ゼブラフィッシュのモデルは、生きている胚ではそのような機能的な冗長性を明らかにするために、比較的高スループットの手段を提供します。

胚発生における遺伝子機能は、通常、機能喪失実験によって定義されます。例えば、マウスにおける標的変異導入（ノックアウト）などが挙げられます。...

この手順の全体的な目的は、特定の細胞系譜の決定において、2つの遺伝子が機能的に冗長であるかどうかを判定することです。これは、まず、発生中のゼブラフィッシュ胚に遺伝子特異的なモルフォリノを注入し、個々の遺伝子の機能喪失表現型を定義することで達成されます。この手順の第2ステップは、細胞系譜の決定または分化を定量化するためのアッセイを構築することです。例えば、本稿で示すように、レポーター魚株を使用します。手順の第3ステップは、2つのモルフォFENOを組み合わせて、2つの遺伝子の機能喪失を同時に標的とすることです。手順の最終ステップは、ダブルノックダウンによって引き起こされる表現型を評価することです。最終的に、リネージレポーターの確認やリネージ特異的マーカーの発現解析を通じて、特定の系統の細胞における機能喪失または機能獲得を示す結果を得ることができます。マウスモデルでのノックアウトの組み合わせのような既存の手法に対する本手法の主な利点は、検証済みのモルフォリノを単一の実験で組み合わせるだけで、魚類モデルにおいて2つ、あるいは3つの遺伝子までも標的にできる点にあります。100個以上の胚に注入を行い、数日間にわたって表現型を評価することが可能です。この手法は、重要な疑問の解明に役立ちます。細胞運命を制御する転写経路の定義などの発生生物学において、主要な調節経路は、機能的に冗長な関連遺伝子の小さなファミリーによって構成されていることが多くあります。そのため、姉妹遺伝子による補完作用により、マウスノックアウト研究からではそれらの役割を明らかにすることが困難な場合があります。このモデルはゼブラフィッシュの胚発生に関する洞察を提供しますが、同様の遺伝的プログラムは通常、進化を通じて高度に保存されているため、その結果はマウスなどの他のシステムにも適用可能です。胚に注入を行う前に、マイクロインジェクションプレートを準備します。100 mmペトリ皿の反転させた蓋に、魚槽システムから直接採取した浄水であるシステムウォーターで調製した2% agaroseを約12 mL注ぎます。2枚の顕微鏡スライドグラスを、蓋の両側に約45度の角度で設置します。アガロースが凝固したら、スライドグラスを蓋からゆっくりと引き離し、注入中に胚を保持するための溝を作成します。モルフォリノストックは、注入前に1 mMの濃度で滅菌済みの脱イオン蒸留水を用いて室温で保存します。モルフォリノストックを65 °Cで5分間インキュベートし、完全に溶解していることを確認してください。ストック溶液を室温まで冷却します。新たに設計された各モルフォリノは、活性および胚への耐性を実験的に検証する必要があります。マイクロ遠心チューブを用いて、脱イオン蒸留水でストックモルフォリノを1～2回の連続希釈し、1 mM、0.5 mM、0.25 mM、および0.125 mMの作動濃度を調製します。解剖顕微鏡下で、マイクロマニピュレーターに取り付け、適切に配置した校正済み注入針に、吸引を用いて溶液を前から充填します。最低濃度のmorpho溶液を約1µL、針に充填してください。その後、転送ピペットを使用して、受精後の1細胞期胚をマイクロインジェクションプレートの溝に移動させます。ピペットを使用してプレートから余分な水を取り除き、胚が溝の底に落ちるようにします。注入プレートを顕微鏡の下に配置し、針を絨毛膜（corion）経由で卵黄へと刺入します。各胚に注入した後、針を抜き、注入プレートを移動させて次の胚にアクセスします。注入の習得には、ここに示すようにバイタルダイを用いて細胞への注入を可視化することが有用な場合があります。胚を100 millimeterのペトリ皿に戻し、システムウォーターで28.5 degrees Celsiusにて培養します。針に残っているmorpho溶液をすべて排出し、適切な発生段階にある次の胚群に注入するため、次に高い濃度のmorpho溶液を充填します。注入した各morpho濃度における胚の表現型を確認してください。各モルフォ（morpho）の閾値用量は、明確で信頼性の高い表現型が現れる最低用量です。不正確な閾値を定義するためには、複数回のタイトレーションが必要になる場合があります。これは、2つの異なる遺伝子間の遺伝学的相互作用を調べるためのものです。目的とする2種類のモルフォリノを、それぞれ閾値濃度で混合して調製します。1回の注入あたりのモルフォリノ総量が20 nanogramsを超えると、胚が耐えられない可能性があることに注意してください。前述と同様の方法で胚に注入します。実験群と対照群の間で注入量を一定に保ってください。対照群には、解剖顕微鏡下で各morphoのみを注入したセットを含める必要があります。注入直後および一日の中で数回、注入した胚を観察し、トランスファーピペットを使用して死滅した胚または死にかけている胚を除去してください。これらは残りの胚の生存率を損なう可能性があるため、トランスファーピペットを用いて、鎮静状態または安楽死した胚を随時取り除いてください。観察用に凹面スライドグラスに載せます。撮影を行う際、必要に応じて鋭いピンセットで絨毛膜を除去してください。3%メチルセルロースの液滴中で胚を固定し、単一のモルフォリノによる表現型の浸透率の高さではなく、モルフォリノの組み合わせに特有の明確な表現型が現れているか胚をスクリーニングします。ここでは、閾値のモルフォリノを注入した野生型胚をいくつか示します。gata5の場合、前駆細胞が正中線で融合できなかったため、心分断（cardio bifida）または二心心と呼ばれる表現型が典型的に現れます。矢印で示されたGFP陽性の心筋細胞に注目してください。6-morphine（6-モルフォリノ）の表現型には、適切にループしなかった変形した心臓が含まれます。これらの胚においても、GFP陽性の心筋細胞が発達します。しかし、ここで示すgata fiveとgata sixの両方のモルフォリノを注入した胚では、心筋細胞の発達が完全に消失しており、心筋細胞の発達にはgata fiveまたはgata sixのいずれかが発現している必要があることが示唆されます。これら2つの遺伝子は、心筋細胞の分化決定において機能的に冗長です。この手順を試みる際は、まず使用するモルフォリノ（morpho）を完全に検証し、本手順に従った結果が単一の標的遺伝子の真のノックダウンを代表していることを可能な限り確実にすることが重要です。同様の遺伝子機能が哺乳類においても存在することを示すために、条件付きマウスヌルアレルを組み合わせるなどの他の方法を実施することができます。ビデオを視聴することで、胚発生過程において2つの遺伝子が機能的に冗長であるかどうかを判定する方法について、十分に理解できるはずです。

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Research

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Biology

生物学

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