胚形成の間に機能的な冗長性をテストするための逆遺伝学的アプローチ

別の遺伝子による補償がある場合は、遺伝子の機能は、機能喪失実験で隠されることができる。ゼブラフィッシュのモデルは、生きている胚ではそのような機能的な冗長性を明らかにするために、比較的高スループットの手段を提供します。

この手順の全体的な目標は、定義された細胞系譜の特定に対して2つの遺伝子が機能的に冗長であるかどうかを判断することです。これは、まず、発生中のゼブラフィッシュ胚に注入された遺伝子特異的な形態を用いて、個々の遺伝子の機能喪失表現型を定義することによって達成されます。手順の2番目のステップは、細胞系譜の仕様または分化を定量化するためのアッセイを開発することです。

たとえば、ここで示すように、レポーターの魚株を使用します。手順の3番目のステップは、2つの形態FENOを組み合わせて、両方の遺伝子の機能喪失を同時に標的にすることです。手順の最後のステップは、ダブルノックダウンによって引き起こされる表現型を評価することです。

最終的には、系統レポーターの検査または系統特異的マーカーの発現の解析を通じて、特定の系統の細胞の機能の喪失または獲得を示す結果を得ることができます。この手法は、マウスモデルでノックアウトを組み合わせるなどの既存の方法よりも優れている点として、1回の実験で検証済みのmorphosを組み合わせるだけで、魚類モデルで2つまたは3つの遺伝子を標的にできることです。100個以上の胚を注入し、数日間で表現型を評価することができます。

この方法は、重要な質問に答えるのに役立ちます。細胞の運命を制御する転写経路の定義など、発生生物学では、主要な制御経路は、機能的に冗長な関連遺伝子の小さなファミリーによって表されることがよくあります。したがって、その役割は、Sister Genesによる補償のために、マウスのノックアウト研究からは明らかではありません。

このモデルはゼブラフィッシュの胚発生に関する洞察を提供しますが、同じ遺伝的プログラムは通常、進化を通じて良好に保存されているため、結果はマウスなどの他のシステムにも適用できます。胚を注入する前にマイクロインジェクションプレートを準備します。水槽システムから直接取り出したきれいな水であるシステム水に約100ミリリットルの2%アグロスを100ミリメートルのシャーレの逆さまの蓋に注ぎます。

2枚の顕微鏡スライドを蓋の両側に約45度の角度で置きます。アグロスが固まったら、スライドを蓋からそっと引き離し、注入中に胚が休むトラフを作成します 形態 fo、茎は1ミリモルの濃度で室温に保たれず、滅菌蒸留脱イオン水 注入する前に。モルフォスストックを摂氏65度で5分間インキュベートし、完全に溶液中にあることを確認します。

ストックを室温まで冷まします。新しく設計された各モルフォは、活性と胚耐性について経験的に検証する必要があります。マイクロ遠心チューブでは、蒸留脱イオン水でストックモルフォを1〜2回連続希釈することから始め、1ミリモル0.5ミリモル、0.25ミリモル、0.125ミリモルの使用濃度が得られます。

解剖スコープの下で、吸引を使用して、マイクロマニピュレーターに取り付けられ、適切に配置されたキャリブレーションされた注射針をフロントロードします。針に約1マイクロリットルの最低濃度のモルフォ溶液をロードします。トランスファーピペットを使用して、受精した1細胞胚をマイクロインジェクションプレートのトラフに移します。

ピペットを使用してプレートから余分な水分を取り除き、胚がトラフの底に落ちるようにします。注射プレートを顕微鏡下に配置し、針をコリオンを通って卵黄に下降させます。針を取り外し、注入プレートを再配置して次の胚にアクセスする前に、各胚を注入します。

注入を学ぶときは、ここに示すように、細胞への注入を視覚化するためにバイタル色素を使用し、胚をシステム水で100ミリメートルのペトリ皿に戻して摂氏28.5度で培養すると役立つ場合があります。針から残っているモルフォ溶液を排出し、次に高濃度のモルフォで満たして、発生の適切な段階で次の胚のバッチを注入します。注入された各モルフォ濃度で胚の表現型を調べます。

各モルフォの閾値用量は、定義された信頼性の高い表現型が存在する最低用量です。不正確な閾値を定義するために、複数回の滴定が必要になる場合があります。2つの異なる遺伝子間の遺伝的相互作用を探すこと。

2つの目的の形態を、それぞれそれぞれの閾値濃度で混合物を調製します。胚は、注射ごとに20ナノグラムを超える総モルフォに耐えられない可能性があることに留意することが重要です。以前と同じ方法で胚を注入します。

実験群と対照群の間で注入量を一定に保ち、これには、解剖顕微鏡下で各モルフォのみを注入するセットを含める必要があります。注入された胚を注入直後および1日中に数回モニターし、トランスファーピペットを使用して死んだ胚または死にかけている胚を取り出します。これらは、トランスファーピペットで残りのモルヒネの生存率を損なう可能性があるため、いつでも、鎮静または安楽死した胚

観察のためにくぼみのスライドをポイントします。写真撮影用。必要に応じて、鋭利な鉗子を使用してコリオンを取り除きます。

3%メチルセルローススクリーニング胚の滴で胚を安定化させ、単一のモルヒネの表現型の浸透度が高いのとは対照的に、形態の組み合わせに特有の明確な表現型を実現します。これは、閾値でモルフォスを注入したときのいくつかの野生型胚です。ガタ5の場合、典型的な表現型は心二分症または2つの心臓であり、これは前駆細胞が正中線で融合しなかったためです。

矢印で示されているGFP陽性の心筋細胞に注目してください。6つのモルヒネの表現型には、適切にループしない誤った形の心臓が含まれています。これらの胚は、GFP陽性の心筋細胞も発達させます。

しかし、ここに示したgata fiveとgata sixの両方の形態の組み合わせで注入された胚。心筋細胞の発達が全失していることを示しており、心筋細胞が発達するためにはガタ5またはガタシ6のいずれかが発現しなければならないことを示しています。この2つの遺伝子は、心筋細胞の仕様化のために機能的に冗長です。

この手順を試行する際は、まず自分の形態を完全に検証し、この手順に続いて、それらが単一遺伝子ターゲットの真のノックダウンを表していることをできるだけ確認することが重要です。条件付きマウスヌル対立遺伝子を組み合わせるなどの他の方法を実行して、同じ遺伝子が機能することを示すことができます。哺乳類でも同様です。

ビデオを見た後、胚形成中に2つの遺伝子が機能的に冗長であるかどうかを判断する方法を十分に理解しているはずです。