最適化された合成表面を使用した肝細胞表現型の安定化

この手順の全体的な目標は、幹細胞由来のヒト肝細胞の長期安定培養を維持するために、ポリマーコーティング表面を最適化することです。これは、最初にポリウレタン1 3 4またはPU 1 3 4を合成することによって達成されます。2番目のステップは、PU 1 34を可溶化するための適切な溶媒を選択することです。

次に、ガラスカバースリップにPU 1 3 4を使用したスピンコーティングプロセスを最適化します。最後のステップは、ポリマーP 1 34コーティングガラスカバースリップの滅菌手順の最適化であり、最終的には走査型電子顕微鏡、原子間力顕微鏡、および薬物代謝を行います。アッセイは、幹細胞由来肝細胞の機能におけるPU1 34ポリマーコーティングの影響を示すために使用されます。

この技術の主な利点は、肝細胞を持つURIの強力な幹細胞を維持するために、培養にal Metricesを使用するなどの既存の方法よりも、これらの合成材料を目的に合わせて微調整し、品質保証基準に合わせてスケールを調整できることです。さらに、バッチ 2 バスの一貫性が表示されます。この技術の意味は、細胞表現型を維持するために合成ポリマーの表面をどのように最適化できるかの一例であるため、肝疾患の治療にまで及びます。

この手順を実演するのは、この手順を開始する前に、私の研究室のポスドクであるジェフリー・ウォルトン博士です。モノのワン6ヘキサンダイヤルジエチレングリコールとネオペンタイルグリコールを40°Cで真空オーブンで48時間熱処理します。残留水を除去するには、各モノマーの22ミリモルと55ミリモルのdpic酸を、ディーンスターク装置に接続し、磁気攪拌棒を装備した2つの首の丸底フラスコに加えます。

これに続いて、アセンブリ全体を真空下に置き、フラスコへの化学物質の添加中に水分を吸収しないように、ガラス製品を摂氏40度で6時間静かに加熱します。アセンブリをオーブンから取り出し、システムを窒素の下に置いた後、0.0055モルの触媒チタン4をフラスコにシリンジで酸化物を滴下します。反応混合物を摂氏180度で24時間攪拌し、ディーンスタークトラップに残留水を集めます。

製品を室温まで冷まします。次に、3.2ミリモル、またはポリオールP-H-N-G-A-Gの1つの当量を6.4ミリモルまたは4つの4メチルとビスフェノールイソシアネートの2つの当量と混合します。12ミリリットルの無水DMLを、ディーンスターク装置に接続し、磁気スターバーを装備した2つの首の丸底フラスコに

反応混合物を窒素雰囲気下で摂氏70度で攪拌します。次に、触媒酸化チタン4をシリンジを介して滴下し、最終濃度0.8%まで1時間後、チェーンエクステンダー1 4ブタンダイヤルの1相当物を加えて共重合体製品を与えます。温度を摂氏90度に上げ、窒素雰囲気下で24時間飢餓状態にします。

反応混合物が室温に戻ったら、ポリウレタン製品の沈殿が観察されるまで、反応混合物にダルエーテルを滴下します。反応混合物を遠心分離チューブに移した後、溶液を5,300倍Gで5分間遠心分離します。デカンテーション後、すり酸は溶媒が蒸発するまで室温で乾燥させます。

次に、ガラス瓶にPU 1 34の200ミリグラムの重量を量って動作します。サンプルを最終濃度2%のクロロホルムまたはクロロホルムとトルエンに1対1の比率で希釈するか、テトラローランまたはテトラローラン抗クロロメタンの組み合わせで希釈します。1対1の比率で、溶液が均一になり沈殿物が観察されなくなるまで、シェーカーを使用して室温で20分間激しく振と

終わったら、約15mm四方のガラスカバースリップをスピンローターに置きます。ピペットを使用してカバースリップにPU 1から4溶液の50マイクロリットルを適用し、各カバースリップを23倍G.Thenで7秒間回転させ、滅菌前に少なくとも24時間室温でカバースリップを風乾します。この時点で、実験室のラジエーターを使用して10グレイの線量を12分間適用することにより、各ポリマーコーティングされたカバースリップにガンマ線を照射します。

あるいは、30ワットのUV電球を使用して、各ポリマーコーティングされたカバースリップを両側に16分間UV照射します。終了したら、ポリマーコーティングされたカバースリップを、カバースリップのサイズに応じて適切な組織培養プレートに入れます。ヒト胚性幹細胞株を培養および分化した後、解離試薬を使用して細胞を分離し、分化プロセスの9日目にPU 1 34コーティングカバースリップに再生します。

さまざまなコーティングされたガラスカバースリップの画像は、トルエンまたはクロロホルムによるコーティングが均一ではなかったことを示しており、PE 1 34沈殿によるコーティングの不均一を示しています。対照的に、四面体は、はるかに均一な表面のスピンコーティングを可能にしました。さらに、異なるポリマーコーティングの原子間力顕微鏡分析は、テトラハイドロフリンに可溶化されたP 1 34の粗さが他の溶媒と比較して40%減少することを示し、より均一なPU 1 34コーティングを生物学的適用の肝臓内胚葉分化が誘発され、9日目には、細胞のような肝芽球が明らかであり、サイトケラチン19アルファフェタタンパク質とアルファのための肝細胞核因子を発現する細胞の大部分と明らかでした。代謝機能の尺度としてのアルブミンのレベルが低い。

シトクロムP four 50の機能は、異なるポリマーコーティング表面への再めっきの4日後に評価されました。テトラ ハイドロ フレ mpu 1 3 4 コーティング表面に再播種した細胞では、代謝活性が 2 倍に増加しました。これらの結果は、ヒト胚性幹細胞由来の肝細胞代謝活性が、より均一なP 1 34コーティング面コントラストイメージングにより改善されることを示しており、UVまたはガンマ線照射後に大きな違いは示さず、これは走査型電子顕微鏡分析によってさらに確認されました。

ガンマ線を照射したPU1 34コーティングガラスカバースリップに再メッキしたヒト胚性幹細胞由来肝細胞は、UV放射PU1 34コーティングガラスカバースリップに再メッキされた細胞よりもCYP 3 a活性が3倍増加したことを示しました。これらの観察結果は、ガンマ線が最適な滅菌技術であることを示しています。この手順を試行する際には、異なるスピンコーティングCLO間のコーティングの均一性を確認することを忘れないでください。また、化学溶剤の機器での作業は非常に危険であることを忘れないでください。

この手順を実行するときは、安全ゴーグルの着用などのアプリケーションを常に使用する必要があります。