Name: 最適化された合成表面を使用した肝細胞表現型の安定化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: 学ぶ ポリウレタン134合成とスピンコーティングによる肝細胞培養表面の最適化。iPS細胞由来ヒト肝細胞の長期安定培養と代謝機能向上を実現する手法です。

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DCH、MBとFKは基金に関するEPSRCフォローによってサポートされていました。 BL-VとDSがそれぞれのMRC博士studentshipsによってサポートされていました。 KCは、英国再生医療プラットフォームからの資金によってサポートされていました。

PHNGAD（ポリ[1,6-hexanodiol /ネオペンチルグリコール/ジ（エチレングリコール）-alt - アジピン酸]ジオール）の合成<img alt="スキーム1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51723/51723scheme1.jpg" width="500" /> スキーム1：PHNAGDの合成 PHNAGDの合成の模式図。。 PHNAGDは、1,6 - Hexanodiol、ジエチレングリコール、neoppentylグリコールとアジピン酸との反応により調製した。 PHNAGD、ポリ[1,6-hexanodiol /ネオペンチルグリコール/ジ（エチレングリコール）-alt - アジピン酸]ジオール。 <ol><li>残留水を除去し、真空オーブン中で48時間40℃でのモノマー1,6 - ヘキサンジオール、ジ（エチレングリコール）及びネオペンチルグリコールに熱処理を適用する。真空下で室温まで寒さにできるようにします。 </li><li>二口丸底フラスコに攪拌棒を備えたディーン·スターク装置に接続する各モノマーの22ミリモルを加え、アジピン酸（55ミリモル）を加えた。 </li><li>真空下でアセンブリ全体を置き、静かにGLAを加熱フラスコ中の化学物質の添加中の任意の吸湿を避けるために、6時間40℃でssware。 </li><li> 、一滴ずつ、シリンジを介して追加の触媒チタン（IV）ブトキシドの0.0055モル。 </li><li> 24時間N 2雰囲気下、180℃で反応混合物を撹拌し、そしてディーン-スタークトラップに残留水を集める。製品が室温まで冷却させる。 </li></ol> PU134の2の合成<img alt="スキーム2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51723/51723scheme2.jpg" width="500" /> スキーム2：PU134の合成 PU134は、4,4 &#39; -メチレンビス（フェニルイソシアネート）の2.0当量とPHNGADの1.0当量との反応により調製されたポリウレタン134の合成の略図、1.0を添加した。 1,4 - ブタンジオール連鎖延長剤の当量。 <ol><li> 4の2当量とポリオールPHNGAD 1当量の量（Mn〜1,800ダルトン、3.2ミリモル）を混ぜ無水N 4 &#39; -メチレンビス（フェニルイソシアネート）（6.4ミリモル）、Nジメチルホルムアミド（12 ml）を加えた。 </li><li> N 2雰囲気下、70℃で反応混合物を、攪拌する。 </li><li>触媒チタン（IV）ブトキシド（0.8％重量）を一滴ずつ、シリンジを介して追加します。 </li><li> 1時間後、鎖延長剤1,4 - ブタンジオール（3.2ミリモル）の1当量を加える。 90℃に温度を上昇させ、N 2雰囲気下で24時間撹拌した。 </li><li>反応後、沈殿が生じるまで反応溶液に滴下し（ヘキサンまたは水を使用することもできる）のジエチルエーテルを加えて沈殿させることによりポリウレタンを収集する。 </li><li> 5分間5,300×gで解決策を遠心。 </li><li>上清を除去し、溶媒が蒸発するまで、真空オーブンで40℃で乾かす。 注するために、反応の最終生成物は、分子量分布に関する適切なパラメータを有することを確実にするために、機能的grouポリマー、溶融およびガラス転移温度のpsが、さまざまな分析技術および方法は、ゲル浸透クロマトグラフィーまたはFITR分光法を用いることができる。 </li></ol> PU134ソリューションの調製<ol><li>ガラス瓶にPU134を200mg秤量する。 </li><li>クロロホルム、1クロロホルムとトルエンの組み合わせ：1の比率、テトラヒドロフラン、及び1テトラヒドロフラン及びdicloromethaneの組み合わせ：1の比の溶媒の数が2％の最終濃度にPU134を希釈する。 注：右の溶媒の選挙は、使用するポリマーに応じて変化する。異なる溶媒は、ポリマーの可溶化に影響を与えることができる異なる沸点を有する。 </li><li>溶液が均一になり、沈殿物が観察されなくなるまで、200 MOT /分の速度でシェーカーを用いて室温で20分間溶液を激しく振る。 </li></ol> PU134とスライドガラスの4。塗装<ol><li> ROUを配置スピンコーター上のND 15ミリメートル2カバースリップ。 </li><li>ピペットを用いて各PU134溶液50μlを適用します。比に比例表面ボリュームを保つ必要なカバーガラスサイズに応じてPU134溶液の量を調整します。 </li><li> 23 x gで7秒間、各カバースリップスピン。 </li><li>滅菌前に少なくとも24時間、室温で空気乾燥カバースリップ。 </li></ol>カバースリップの5。照射<ol><li> 12分間実験室の照射装置を用いて10グレイの線量を適用することにより、ポリマーで被覆されたカバースリップをガンマ - 照射する。 </li><li> UV-16分間、30 W、UV電球の各側面を用いてポリマーコーティングされたカバースリップを照射する。 </li><li>スライドのサイズに応じて適切な組織培養プレートにポリマー被覆カバースリップを置きます。 </li></ol> 6。走査型電子顕微鏡<ol><li>圧力5×10 -1ミリバールの雰囲気下で200秒間スパッタリングによる金コートポリマーカバースリップ。 </li><li>マイクログラムをキャプチャ二次電子撮像モードで20kVの加速電圧での走査型電子顕微鏡を用いてポリマーコーティングされたカバースリップのraphs。 </li></ol> 7。原子間力顕微鏡の観察<ol><li>ポリマー表面の20×20μmの領域をスキャンします。 </li><li> 1.32ヘルツから1.60 Hzのスキャンレートを設定します。 </li><li>スキャンされた領域内の512×512ピクセルの解像度を設定します。 </li><li>平均画像データプレーンから採取した高さ偏差の平均値を用いて、コーティングの平方根（RMSまたはさRq）の平均平方根を計算し、のように表さ。 <img fo:content-width="1in" src="/files/ftp_upload/51723/51723eq1.jpg" width="123" /> Ziが現在のZ値であり、Nは、所定の領域内の点の数である。 </li><li> 7.5偏差を計算し、または使用して、画像の表面粗さ（Ra）を意味し、 <img fo:content-width="1.5in" src="/files/ftp_upload/51723/51723eq2.jpg" width="154" /> Z（x）はtで記述する関数である。彼は、高さ（Z）と評価長さ &quot;L&quot;を超える試料の位置（x）に関して分析プロファイル表面。 Raは中心面に対する表面の平均値を表す。 </li></ol> 8。細胞培養および分化<ol><li>文化·ヘイ17で説明したようにヒト胚性幹細胞株（ヒトES細胞）H9を区別。 </li><li>解離試薬を用いて細胞を外し、Szkolnicka 18,19で説明するように、無血清培地の存在下で、分化過程の9日目でPU134被覆スライドにドラッグreplate。 注：酵素的細胞解離の使用は物理的な細胞剥離に好適である。 </li></ol> 9チトクロームP450機能アッセイ<ol><li>製造者の指示に従ってCYP3A活性を測定する。 </li><li>細胞なしのhESCに由来する13日目または19日目での肝細胞、およびメディアをインキュベート - ネガティブコントロールとして、適切なSUBSTRで37℃で5時間食べた。 </li><li> 、細胞および培地からの上清を回収し、製造業者の指示に従ってアッセイを実施しています。 </li><li>表面積（cm 2）でのCYP活性と正規化のレベルを測定する。 </li></ol> 10免疫染色<ol><li> PBSで洗浄するのhESC派生肝細胞は、1分間、2回繰り返す。 </li><li> 10分間、-20℃での氷冷100％の細胞を固定するために、メタノール、場所を追加します。 </li><li> 5分間のPBSで細胞を洗浄し、二回繰り返します。 </li><li> RTで1時間PBS / T（0.1％トゥイーン）/ 10％BSAで細胞をインキュベートする。 </li><li> PBST液を吸引し、PBS / T（0.1％トゥイーン）/ 1％BSA中に希釈した適切な一次抗体を追加し、穏やかに撹拌し、O / N、4℃でインキュベートする。 </li><li> 5分間のPBS / T（0.1％トゥイーン）/ 1％BSAで細胞を洗浄し、三回繰り返して。 </li><li> ％のBSA / 1×PBS / T（0.1％トゥイーン）中で適切な抗体を希釈し、細胞に追加し、穏やかに撹拌しながら室温で1時間、暗所でインキュベートする。。 </li><li> 5分間のPBSで細胞を洗浄し、3回繰り返します。 </li><li>各ウェルに、気泡の数を減らすために穏やかにカバースリップを追加し（千DAPI 1を含む）MOWIOL 488を追加する。暗闇の中で4℃で保存固定した細胞。適切なフィルターと蛍光灯顕微鏡を用いて染色し観察します。最適化された一次および二次抗体は、 表1に記載されています。 </li></ol>

<ol><li>Zhou, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUMOylation+of+HNF4%CE%B1+regulates+protein+stability+and+hepatocyte+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">SUMOylation of HNF4α regulates protein stability and hepatocyte function.</a> J Cell Sci. 125 (15), 3630-3635 (2012).</li>
<li>Banerjee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+hydrogel+modulus+on+the+proliferation+and+differentiation+of+encapsulated+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The influence of hydrogel modulus on the proliferation and differentiation of encapsulated neural stem cells.</a> Biomaterials. 30 (27), 4695-4699 (2009).</li>
<li>Shanbhag, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+Progenitor+Cells+Grown+on+Hydrogel+Surfaces+Respond+to+the+Product+of+the+Transgene+of+Encapsulated+Genetically+Engineered+Fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Neural Progenitor Cells Grown on Hydrogel Surfaces Respond to the Product of the Transgene of Encapsulated Genetically Engineered Fibroblasts.</a> Biomacromolecules. 11 (11), 2936-2943 (2010).</li>
<li>Battista, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+matrix+composition+of+3D+constructs+on+embryonic+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The effect of matrix composition of 3D constructs on embryonic stem cell differentiation.</a> Biomaterials. 26 (31), 6194-6207 (2005).</li>
<li>Tian, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyaluronic+acid+hydrogel+as+Nogo-66+receptor+antibody+delivery+system+for+the+repairing+of+injured+rat+brain%3A+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Hyaluronic acid hydrogel as Nogo-66 receptor antibody delivery system for the repairing of injured rat brain: in vitro.</a> Journal of Controlled Release. 102 (1), 13-22 (2005).</li>
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<li>Baharvand, H., Hashemi, S. M., Kazemi Ashtiani, S., Farrokhi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+into+hepatocytes+in+2D+and+3D+culture+systems+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human embryonic stem cells into hepatocytes in 2D and 3D culture systems in vitro.</a> The International Journal of Developmental Biology. 50 (7), 645-652 (2006).</li>
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<li>Li, Z., Guo, X., Matsushita, S., Guan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+cardiosphere-derived+cells+into+a+mature+cardiac+lineage+using+biodegradable+poly%28N-isopropylacrylamide%29+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Differentiation of cardiosphere-derived cells into a mature cardiac lineage using biodegradable poly(N-isopropylacrylamide) hydrogels.</a> Biomaterials. 32 (12), 3220-3232 (2011).</li>
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<li>Khan, F., Tare, R. S., Kanczler, J. M., Oreffo, R. O. C., Bradley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+cell+manipulation+and+skeletal+tissue+engineering+using+high-throughput+polymer+blend+formulation+and+microarray+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Strategies for cell manipulation and skeletal tissue engineering using high-throughput polymer blend formulation and microarray techniques.</a> Biomaterials. 31 (8), 2216-2228 (2010).</li>
<li>Zhang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+thermoresponsive+and+chemically+defined+hydrogel+for+long-term+culture+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A thermoresponsive and chemically defined hydrogel for long-term culture of human embryonic stem cells.</a> Nature Communications. 4 (1335), (2013).</li>
<li>Medine, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+high-fidelity+hepatotoxicity+models+from+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Developing high-fidelity hepatotoxicity models from pluripotent stem cells.</a> Stem Cells Translational Medicine. 2 (7), 505-509 (2013).</li>
<li>Hay, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unbiased+screening+of+polymer+libraries+to+define+novel+substrates+for+functional+hepatocytes+with+inducible+drug+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Unbiased screening of polymer libraries to define novel substrates for functional hepatocytes with inducible drug metabolism.</a> Stem Cell Research. 6 (2), 92-102 (2011).</li>
<li>Lucendo-Villarin, B., Khan, F., Pernagallo, S., Bradley, M., Iredale, J. P., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintaining+hepatic+stem+cell+gene+expression+on+biological+and+synthetic+substrata%5BTitle%5D)+AND+%22BioResearch+Open+Access%22%5BJournal%5D)">Maintaining hepatic stem cell gene expression on biological and synthetic substrata.</a> BioResearch Open Access. 1 (1), 50-53 (2012).</li>
<li>Hay, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+differentiation+of+hESCs+to+functional+hepatic+endoderm+requires+ActivinA+and+Wnt3a+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Highly efficient differentiation of hESCs to functional hepatic endoderm requires ActivinA and Wnt3a signaling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (34), 12301-12306 (2008).</li>
<li>Szkolnicka, D., Zhou, W., Lucendo-Villarin, B., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pluripotent+Stem+Cell%E2%80%93Derived+Hepatocytes%3A+Potential+and+Challenges+in+Pharmacology%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Pharmecol+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Pluripotent Stem Cell–Derived Hepatocytes: Potential and Challenges in Pharmacology.</a> Annu Rev Pharmecol Toxicol. 53, 147-149 (2013).</li>
<li>Szkolnicka, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+prediction+of+drug-induced+liver+injury+using+stem+cell-derived+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Accurate prediction of drug-induced liver injury using stem cell-derived populations.</a> Stem Cells Translational Medicine. 3 (2), 141-148 (2014).</li>
<li>Medine, C. N., Lucendo-Villarin, B., Zhou, W., West, C. C., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+Generation+of+Hepatocyte-like+Cells+from+Human+Embryonic+Stem+Cell+Populations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Robust Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Embryonic Stem Cell Populations.</a> Journal of Visualized Experiments. (56), (2011).</li>
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<li>Rosu, L., Cascaval, C. N., Ciobanu, C., Rosu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+UV+radiation+on+the+semi-interpenetrating+polymer+networks+based+on+polyurethane+and+epoxy+maleate+of+bisphenol+A%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Photochemistry+and+Photobilogy+A%3A+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Effect of UV radiation on the semi-interpenetrating polymer networks based on polyurethane and epoxy maleate of bisphenol A.</a> Journal of Photochemistry and Photobilogy A: Chemistry. 169 (2), 177-185 (2005).</li>
<li>Yang, X. F., Tallman, D. E., Bierwagen, G. P., Croll, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blistering+and+degradation+of+polyurethane+coatings+under+different+accelerated+weathering+tests%5BTitle%5D)+AND+%22Polymer+Degradation+and+Stability%22%5BJournal%5D)">Blistering and degradation of polyurethane coatings under different accelerated weathering tests.</a> Polymer Degradation and Stability. 77 (1), 103-109 (2002).</li>
</ol>

DCHはCSO、FibromEdプロダクツ株式会社における取締役、創業者でFibromEd製品株式会社MBおよびJPIにおける株主である創業者の株主である

幹細胞から肝細胞を生成するために使用される現在の方法の多くは、動物由来の未定義のマトリックスに依存している。これらの基板は、アプリケーションに重大な障壁を表す、細胞の機能および安定性に影響を与える、費用がかかり、非常に可変であることができる。そこで、幹細胞由来肝細胞の培養を支持する合成材料のためのスクリーンを行った。私たちは、同定した、堅牢な肝細胞分化アプローチと組み合わせてPHNGAD、MDIおよびエクステンダー、それを重合して形成された単純なポリウレタン（PU134）は、肝細胞の表現型を安定化し、マトリゲル15と比較して細胞の機能を改善する。 一般的に培養に使用される生体マトリクスを、既存およびビトロネクチン22、ラミニン521 23またはマトリゲルのような幹細胞を分化の取扱いは、短期的なメンテナンスのために効果的である。対照的に、PU134コーティングされた表面は、hepatocy優れた基板を提供TE文化。また、表面形状及びポリマー殺菌の最適化は、電池性能、信頼できる性能とスケールでヒト肝臓モデルを提供する上で...

生物学的材料は、広く、多能性幹細胞1の維持および分化に使用されている。可能にしながら、これらの生物学的基質は、多くの場合、未定義の構成要素の無数が含まれています。マトリゲルは、幹細胞の培養および分化のための一般的に使用される基板である。残念ながら、その可変組成は、細胞の機能および表現型に影響を与える。代替、複数の定義された生物学的マトリックスの多様2-7使用されてきたが、それらの動物由来または貧弱な拡張性は、彼らに工業的な製造には適さない候補にする。したがって、定義された組成と信頼できる性能を有する合成代替物の同定は、幹細胞研究の重要な目標である。 未定義の細胞培養基質の制限を克服する試みにおいて、化学と生物学との間の学際的コラボレーションは、細胞表現型をサポートする能力を有する合成材料を同定した。シンセエティックな基板は、スケーラブルであり、費用対効果、および複雑な3次元構造に製造することができ、 生体内環境を模倣する。によるこれらの特性に合成基質は、広く多くの細胞型8-10の分化を支持し、駆動するために使用されてきた。 Advancedおよびハイスループットアッセイは、大規模なライブラリーから、合成材料の迅速なスクリーニングを容易にし、生物医学の研究開発11-13の幅広いアプリケーションとの柔軟な特性を有する新規材料を提供してきました。高いスループットを利用して、高分子マイクロアレイスクリーニング技術は、急速にヒト幹細胞由来の肝細胞の維持に適した単純なポリウレタン（PU134）を同定した。このポリマーは、肝細胞の分化および機能14-16に関して動物由来の基質よりも優れていることが判明した。私たちは、その後の効果をアクセスするための塗布条件、地形や滅菌プロセスを最適化した肝細胞機能と寿命を安定化するポリマーの性能に。これは、セルベースの​​モデリングと再生医療アプリケーションのための肝細胞生物学の基礎を理解することに関して重要な意味を持っている。 ここで説明する技術は、合成ポリマーの表面が細胞表現型を維持するために最適化することができる方法の例を示している。私たちは、効率的な無血清肝細胞分化プロトコルでこの技術の組み合わせは、 インビトロモデリングや再生医療で使用するための肝細胞のスケーラブルな生産を提供する可能性を持っていることを信じています。

<table><tbody><tr><td colspan="4">ポリマーPU134コーティングカバースリップの合成、調製、コーティング、および特性評価</td></tr><tr><td></td><td>Shaker Edmun B&uuml;hler</td><td>KS-15</td><td></td></tr><tr><td>照射器</td><td>CIS Biointernational</td><td>IBL 637&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>スピンコーター</td><td>スペシャルティコーティングシステム</td><td>P-6708</td><td></td></tr><tr><td>走査型電子顕微鏡&nbsp;</td><td>フィリップス</td><td>XL30CPSEM</td><td></td></tr><tr><td>原子間力顕微鏡</td><td>DimensionV ナノスコープ、VEECO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>p4-GLO CYP3A4</td><td>Promega</td><td>V8902</td><td></td></tr><tr><td>UV 電球</td><td>ESCO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoScope 分析ソフトウェア</td><td>VEECO</td><td></td><td>バージョン 1.20</td></tr><tr><td>蛍光顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td>TH45200</td><td>Volocity 4 ソフトウェア</td></tr><tr><td>組織培養プレート</td><td>コーニング、英国&nbsp;</td><td>3527</td><td></td></tr><tr><td>スライド科学</td><td>研究所用品</td><td>MIC3308</td><td></td></tr><tr><td>ジエチレングリコール</td><td>シグマ&ndash;Aldrich</td><td>93171</td><td></td></tr><tr><td>1,6-ヘキサンジオール</td><td>シグマ&ndash;アルドリッチ</td><td>240117</td><td></td></tr><tr><td>ネオペンチルグリコール</td><td>シグマ&ndash;アルドリッチ</td><td>408255</td><td></td></tr><tr><td>アジピン酸</td><td>シグマ&ndash;Aldrich</td><td>9582</td><td></td></tr><tr><td>無水N,N-ジメチルホルムアミド</td><td>シグマ&ndash;アルドリッチ</td><td>227056</td><td></td></tr><tr><td>ジエチルエーテル</td><td>シグマ&ndash;アルドリッチ</td><td>676845</td><td></td></tr><tr><td>チタン(IV)ブトキシド&nbsp;</td><td>シグマ&ndash;アルドリッチ</td><td>244112</td><td></td></tr><tr><td>1,4-ブタンジオール&nbsp;</td><td>シグマ&ndash;Aldrich</td><td>493732</td><td></td></tr><tr><td>真空オーブン</td><td>Thermoscientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4,4'-Methylenebis (フェニルイソシアネート)</td> <td>Sigma &ndash;アルドリッチ</td><td>101688</td><td></td></tr><tr><td>テトラヒドロフラン</td><td>シグマ&ndash;Aldrich</td><td>401757</td><td></td></tr><tr><td>スパッタコーター</td><td>Bal-Tec SCD 050</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Inmunostaining</td></tr><tr><td>Phosphate buffer saline (-MgCl2, -CaCl2)</td><td>Gibco</td><td>10010031</td><td>室温で保存</td></tr><tr><td>PBST, PBS 0.1% TWEEN 20&nbsp;</td><td>&nbsp;サイエンティフィック・ラボラトリー・サプライズ・リミテッド</td><td>EC607&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>メタノール</td><td>&nbsp;Scientific Laboratory Supplies Ltd</td><td>CHE5010</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>Sigma-Aldrich, UK</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>MOWIOL 488 DAPI</td><td>Calbiochem</td><td>475904</td><td>メーカーの指示に従ってトリスHClとグリセロールで構成</td></tr><td colspan="4">Cell culture and Functional assayCYP3A activity pGLO kit Promega V8902 <tr></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ヘパトチーム</td><td>Gibco</td><td>17705021</td><td></td></tr><tr><td>TryLE express</td><td>Life Technologies</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/12604013">12604013</a></td><td></td></tr></tbody></table>

最適化された合成表面を使用した肝細胞表現型の安定化

Stabilizing Hepatocellular Phenotype Using Optimized Synthetic Surfaces

現在、細胞生物学における主要な制限の一つは、分化した細胞表現型を維持することです。生物学的マトリックスは、初代幹細胞および多能性幹細胞由来の肝細胞の培養と維持に一般的に使用されます。生物学的マトリックスは有用ですが、肝細胞の短期間の培養を可能にするため、広範な適用が制限されます。私たちは、合成ポリマーコーティングを使用して制限を克服することを試みました。ポリマーは、生体材料の中で最も広範なクラスの1つであり、幅広い機械的、物理的、化学的特性を備えており、目的に合わせて微調整できます。重要なことは、このような材料は、品質保証された基準に合わせてスケーリングし、バッチ間の一貫性を示すことができるということです。これは、医薬品検査業界での高スループットスクリーニングや細胞ベースの治療のために細胞を増殖させる場合に不可欠です。ポリウレタン(PU)は、細胞培養で有望視されている材料の1つのグループです。安定した表現型を示すヒト肝細胞の長期培養のためのポリウレタンコーティング表面の最適化における最近の進歩が紹介され、議論されています。

ポリマー溶媒は、ポリマーコーティングされた表面の形状に影響を与える ポリウレタン134は、トルエンまたはテトラヒドロフランまたはジクロロメタンとの単独または組み合わせのいずれかで、クロロホルムに溶解し、ガラススライドは、異なる製剤でスピンコートした。走査電子顕微鏡（SEM）および原子間力顕微鏡（AFM）は、ポリマーコーティング（ 図1）の物性を特徴付けるために使用された。トルエンやクロロホルムを使用して得られたコーティングは、PU134沈殿（ 図1A）で塗布ムラを実証する、均質ではなかった。対照的に、テトラヒドロフラン、はるかに均一な表面のスピンコーティングが可能な適切な溶媒（ 図1A）であった。表面形状は、正方形（RMS）と、平均粗さ（Ra）が平均平方根を用いてAFMにより測定した。 PU134溶解テトラヒドロフラン目と比較して粗さの40％の減少を示したE他の溶媒（ 図1Bおよび1C）。</st...

この記事では、ヒト肝細胞を由来幹細胞の長期、安定的な培養のためにポリマーコーティングされた表面の開発に注力していきます。

Currently, one of the major limitations in cell biology is maintaining differentiated cell phenotype. Biological matrices are commonly used for culturing ...

この手順の目的は、幹細胞由来ヒト肝細胞を長期にわたって安定して培養できるよう、ポリマーコーティング表面を最適化することです。まず、ポリウレタン1 3 4（PU 1 3 4）を合成します。次に、PU 1 34を溶解させるための適切な溶媒を選択します。次に、ガラスカバースリップへのPU 1 3 4のスピンコーティング工程を最適化します。最終ステップでは、PU 1 34をコーティングしたガラスカバースリップの滅菌手順を最適化し、最終的に走査電子顕微鏡、原子間力顕微鏡、および薬物代謝アッセイを用いて、PU 1 34ポリマーコーティングが幹細胞由来肝細胞の機能に及ぼす影響を検証します。本手法の、肝細胞を保持する尿路系（URI）強力幹細胞の培養に従来のマトリックスを用いる方法に対する主な利点は、これらの合成材料を目的に応じて微調整でき、品質保証基準に基づいたスケールアップが可能である点にあります。さらに、ロット間の整合性も確保されています。この手法の意義は肝疾患の治療へと広がっており、合成ポリマーの表面を最適化することで細胞表現型を維持できることを示す一例となります。本手順の実演は、私の研究室のポストドクターであるJeffrey Walton博士が行います。本手順を開始する前に、1,6-ヘキサンジオール、ジエチレングリコール、およびネオペンチルグリコールのモノマーを、真空オーブンを用いて40 °Cで48時間熱処理します。残留水分を除去するため、各モノマー22 mmolとアジピン酸55 mmolを、ディーン・スターク装置に接続され、マグネチックスターラーを備えた2口丸底フラスコに加えます。その後、装置全体を真空状態にし、フラスコへの化学物質の添加時に水分を吸収しないようにするため、ガラス器具を40 °Cで6時間緩やかに加熱します。装置をオーブンから取り出し、系内を窒素状態で保持した後、触媒となる四酸化チタンを0.0055 moles、シリンジを用いてフラスコに滴下します。反応混合物を180 °Cで24時間撹拌し、残留水をディーン・スターク・トラップで回収します。生成物を室温まで冷却させます。次に、3.2 millimole（1当量）のポリオール P-H-N-G-A-G と、6.4 milli mole（2当量）の4,4'-メチレンビスフェニルイソシアネートを、12 milliliters の脱水DMFとともに、ディーン・スターク装置に接続しマグネチックスターラーバーを備えた2口丸底フラスコに入れます。窒素雰囲気下、70 °Cで反応混合物を攪拌します。次に、シリンジを用いて触媒の四酸化チタンを最終濃度が0.8%になるまで滴下します。1時間後、共重合体を得るために、鎖延長剤の1,4-ブタンジオールを1当量添加します。温度を90 °Cに上げ、窒素雰囲気下で24時間撹拌します。反応混合物が室温まで冷却されたら、ポリウレタン生成物の沈殿が観察されるまで、ジエチルエーテルを反応混合物に滴下します。反応混合物を遠心管に移し、5,300 ×gで5分間遠心分離します。上清をデカンテーションで取り除いた後、溶媒が蒸発するまで室温で乾燥させます。次に、200 mgのPU 1 34をガラス瓶に量り取ります。試料を、クロロフォーム、またはクロロフォームとトルエンを1:1の比率で混合した溶媒、あるいはテトラヒドロフラン、またはテトラヒドロフランとクロロメタンを1:1の比率で混合した溶媒を用いて、最終濃度2%に希釈します。シェーカーを使用し、室温で毎分200回の速度で20分間激しく振とうし、溶液が均一になり、沈殿が見られなくなるまで混合します。完了後、約15 mm角のガラスカバースリップをスピンコーターに配置します。ピペットを用いて、PU 1〜4溶液50 µLをカバースリップに滴下し、各カバースリップを23 ×gで7秒間スピンさせます。その後、滅菌前に室温で少なくとも24時間、カバースリップを風乾させます。この時点で、ラボ用放射線照射装置を用い、10 Gyの線量で12分間、各ポリマーコーティング済みカバースリップにガンマ線を照射します。あるいは、各ポリマーコーティング済みカバーガラスを、30ワットのUVランプを用いて、両面それぞれ16分間UV照射します。終了後、カバーガラスのサイズに適した組織培養プレートにポリマーコーティング済みカバーガラスを配置します。ヒト胚性幹細胞株を培養・分化させた後、解離剤を用いて細胞を回収し、分化プロセスの9日目に、無血清培地と共にPU 1 34コーティング済みカバーガラス上に再播種し、走査電子顕微鏡で観察します。異なるコーティングを施したガラスカバースリップの画像から、トルエンまたはクロロホルムによるコーティングは均質ではなく、PE 1 34の沈殿を伴う不均一なコーティングであることが示されました。対照的に、テトラヒドロフランでは、より均一な表面のスピンコーティングが可能となりました。さらに、異なるポリマーコーティングの原子間力顕微鏡分析により、他の溶媒と比較してテトラヒドロフランに可溶化したP 1 34の粗さが40%減少しており、より均一なPU 1 34コーティングであることが実証されました。生物学的応用として肝内胚葉分化を誘導したところ、9日目に肝芽細胞様細胞が現れ、大部分の細胞がcytokeratin 19、alpha feta protein、およびhepatocyte nuclear factor for alphaを発現し、代謝機能の指標として低レベルのalbuminが認められました。異なるポリマーコーティング表面への再播種から4日後に、シトクロムP450の機能を評価しました。THFMPU 1,3,4コーティング表面に再播種した細胞において、代謝活性が2倍に増加したことが観察されました。これらの結果は、ヒト胚性幹細胞由来肝細胞の代謝活性が、より均一なP1,34コーティング面によって向上することを示しています。コントラスト画像では、UV照射後またはガンマ照射後に顕著な差は見られず、これは走査型電子顕微鏡分析によってさらに確認されました。ガンマ線照射PU 1 34コートガラスカバースリップに再播種したヒト胚性幹細胞由来肝細胞は、UV照射PU 1 34コートガラスカバースリップに再播種した細胞と比較して、CYP3A活性が3倍に増加しました。これらの観察結果は、ガンマ線照射が最適な滅菌手法であることを示しています。この手順を行う際は、異なるスピンコートCLO間でのコーティングの均一性を確認することが重要である点に留意してください。また、化学溶媒器具を取り扱う際は極めて危険であることに注意してください。この手順を実施する際は、常に安全ゴーグルの着用などの対策を講じてください。

stabilizing-hepatocellular-phenotype-using-optimized-synthetic

Research

JoVE Journal

Chemistry

化学

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学ぶ ポリウレタン134合成とスピンコーティングによる肝細胞培養表面の最適化。iPS細胞由来ヒト肝細胞の長期安定培養と代謝機能向上を実現する手法です。

最適化された合成表面を使用した肝細胞表現型の安定化

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