Name: 細胞ベースのELISAアッセイを使用して、HIV-1エンベロープ糖タンパク質三量体の構造評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 10 s
Description: 学ぶ細胞ベースのELISAアッセイを用いてHIV-1エンベロープ糖タンパク質三量体の構造を評価する方法。少量の抗体で高スループット解析が可能であり、ワクチン設計に有用な情報を提供します。

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私たちは彼の寛大なA32の贈り物、17bと、48D、およびC11 mAbの博士ジェームズ·ロビンソンに感謝します。 PGT 121は、NIH AIDS試薬プログラム、エイズ、NIAID、NIH（カタログ番号12343）の事業を通じて得られた。この作品は、科学者が、AFにしてCRCHUM連続グラントによってだけでなく、CIHR触媒グラント＃126630によって＃24639を付与ヤングのFRQS設立により、CIHRオペレーティング＃257792により、イノベーション拠点リーダーの＃29866のためのカナダ財団によってサポートされていましたAFとMRへ。 AFはFRSQ Chercheur Boursierジュニア1フェローシップ＃の24639の受信者である。 MVはCIHR博士研究賞の＃291485によってサポートされていました。

1 1日目 - 細胞培養<ol><li>プレート2×10 4ヒト骨肉腫（HOS）発光読み取りに適した不透明な96ウェル細胞培養プレート中のウェルあたりの細胞。 10％ウシ胎児血清（FBS）および100 U / mlペニシリン - ストレプトマイシンを補充したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）を使用する。 37°C、5％CO 2で翌日までインキュベートする。 </li></ol> 2 2日目 - ポリエチレンイミン（PEI）トランスフェクション<ol><li>以降の手順に従って、トランスフェクションミックスを調製する。同じのEnvでトランスフェクトされるべきである井戸の数に応じて試薬とDNAの量を調整します。 </li><li>チューブA：25mMのHEPESを補充したDMEMμlの5に10ngのTatのコード（例えばPTAT-III 27など）は、プラスミドと150ngのEnvのコードプラスミドを追加します。 </li><li>などpSVIIIなどのTat依存のEnvをコードするプラスミドを使用した場合のTat-コードプラスミドにのみ必要です。 </li><li>チューブB：1から（450 ngのPEIを追加5μlのDMEM中にμgの/μlの溶液）。 </li><li>徹底的に10秒間ボルテックスチューブA.ミックスにチューブBの内容を追加し、トランスフェクション混合物を室温（22℃）で10分間インキュベートする。 </li><li> 96ウェルプレートのウェルあたりトランスフェクション混合物10μlを追加します。 37°C、5％CO 2で48時間インキュベートする。 </li></ol> 3。4日目 - ELISA <ol><li>のEnv /抗体複合体の可能性エンドサイトーシスを最小限にするために、室温ですべての実験を行います。 </li><li>同時に使用されているプレートあたりの洗浄バッファー250ミリリットルを用意してください。洗浄緩衝液は、1×トリス緩衝食塩水（TBS）pH7.5である（50 mMトリス-Clを、pH7.5の、150mMのNaCl）、1mMのMgCl 2および1.8mMのCaCl 2を補充した。 </li><li> 1％脱脂粉乳および洗浄緩衝液に5 mMトリスpH8.0のを追加することによって、プレートあたりブロッキングバッファー125ミリリットルを用意します。 </li><li> 96ウェルプレートから細胞培養培地およびトランスフェクション混合物（上清）を除去する。 </li><li> 100μの追加;ウェルあたりブロッキングバッファーし、室温で20分間インキュベートリットル。 </li><li>上清を除去し、ブロッキング緩衝液で適当な濃度に希釈ウェル当たり抗体（または血清）を50μlを追加。一般的に、11μg/ mlの濃度を使用しています。室温で1時間インキュベートする。 </li><li> 100μlのブロッキング緩衝液、その後、100μlの洗浄緩衝液で洗浄工程を3回繰り返すとウォッシュ3倍。 </li><li>上清を除去し、ブロッキング緩衝液を100μlを追加し、室温で5分間インキュベートする。 </li><li>上清を除去し、ブロッキング緩衝液中で1/3000に希釈した二次抗体を50μlを追加。メーカーの違いに応じた最適な抗体希釈を変更します。 RTで40分インキュベートします。 </li><li> 100μlのブロッキング緩衝液、その後、100μlの洗浄緩衝液で洗浄工程を3回繰り返すとウォッシュ3倍。 </li></ol> 4。データ収集<ol><li>プレートから上清を除去し、ウェル当たり30μlの1×高感度化学発光（ECL）基板を追加します。 </li><li> CHEMを取得1秒間iluminescence信号/ウェル上の製造者の指示に従って、適切なプレートリーダー。時間を読むことは、ハードウェアの違いにより異なる場合があります。 </li></ol>

<ol><li>Bures, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunization+with+recombinant+canarypox+vectors+expressing+membrane-anchored+glycoprotein+120+followed+by+glycoprotein+160+boosting+fails+to+generate+antibodies+that+neutralize+R5+primary+isolates+of+human+immunodeficiency+virus+type+1%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS+Res.+Human+Retroviruses%22%5BJournal%5D)">Immunization with recombinant canarypox vectors expressing membrane-anchored glycoprotein 120 followed by glycoprotein 160 boosting fails to generate antibodies that neutralize R5 primary isolates of human immunodeficiency virus type 1.</a> AIDS Res. Human Retroviruses. 16, 2019-2035 (2000).</li>
<li>Koff, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+vaccine+development%3A+challenges+and+opportunities+towards+solving+the+HIV+vaccine-neutralizing+antibody+problem%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">HIV vaccine development: challenges and opportunities towards solving the HIV vaccine-neutralizing antibody problem.</a> Vaccine. 30, 4310-4315 (2012).</li>
<li>Mascola, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunization+with+envelope+subunit+vaccine+products+elicits+neutralizing+antibodies+against+laboratory-adapted+but+not+primary+isolates+of+human+immunodeficiency+virus+type+1%5BTitle%5D)+AND+%22The+National+Institute+of+Allergy+and+Infectious+Diseases+AIDS+Vaccine+Evaluation%22%5BJournal%5D)">Immunization with envelope subunit vaccine products elicits neutralizing antibodies against laboratory-adapted but not primary isolates of human immunodeficiency virus type 1.</a> The National Institute of Allergy and Infectious Diseases AIDS Vaccine Evaluation. 173, 340-348 (1996).</li>
<li>Rerks-Ngarm, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vaccination+with+ALVAC+and+AIDSVAX+to+prevent+HIV-1+infection+in+Thailand%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Vaccination with ALVAC and AIDSVAX to prevent HIV-1 infection in Thailand.</a> N. Engl. J. Med. 361, 2209-2220 (2009).</li>
<li>Roederer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological+and+virological+mechanisms+of+vaccine-mediated+protection+against+SIV+and+HIV%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Immunological and virological mechanisms of vaccine-mediated protection against SIV and HIV.</a> Nature. 505, 502-508 (2014).</li>
<li>Fennie, C., Lasky, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model+for+intracellular+folding+of+the+human+immunodeficiency+virus+type+1+gp120%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Model for intracellular folding of the human immunodeficiency virus type 1 gp120.</a> J. Virol. 63, 639-646 (1989).</li>
<li>Willey, R. L., Bonifacino, J. S., Potts, B. J., Martin, M. A., Klausner, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosynthesis+cleavage%2C+and+degradation+of+the+human+immunodeficiency+virus+1+envelope+glycoprotein+gp160%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Biosynthesis cleavage, and degradation of the human immunodeficiency virus 1 envelope glycoprotein gp160.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85, 9580-9584 (1988).</li>
<li>Bosch, V., Pawlita, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutational+analysis+of+the+human+immunodeficiency+virus+type+1+env+gene+product+proteolytic+cleavage+site%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Mutational analysis of the human immunodeficiency virus type 1 env gene product proteolytic cleavage site.</a> J. Virol. 64, 2337-2344 (1990).</li>
<li>Hallenberger, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+furin-mediated+cleavage+activation+of+HIV-1+glycoprotein+gp160%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Inhibition of furin-mediated cleavage activation of HIV-1 glycoprotein gp160.</a> Nature. 360, 358-361 (1038).</li>
<li>Li, Y., Luo, L., Thomas, D. Y., Kang, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+HIV-1+Env+protein+signal+sequence+retards+its+cleavage+and+down-regulates+the+glycoprotein+folding%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">The HIV-1 Env protein signal sequence retards its cleavage and down-regulates the glycoprotein folding.</a> Virology. 272, 417-428 (2000).</li>
<li>Leonard, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assignment+of+intrachain+disulfide+bonds+and+characterization+of+potential+glycosylation+sites+of+the+type+1+recombinant+human+immunodeficiency+virus+envelope+glycoprotein+%28gp120%29+expressed+in+Chinese+hamster+ovary+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Assignment of intrachain disulfide bonds and characterization of potential glycosylation sites of the type 1 recombinant human immunodeficiency virus envelope glycoprotein (gp120) expressed in Chinese hamster ovary cells.</a> J. Biol. Chem. 265, 10373-10382 (1990).</li>
<li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+study+of+the+N-glycosylation+sites+of+HIV-1+envelope+protein+on+infectivity+and+antibody-mediated+neutralization%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">A systematic study of the N-glycosylation sites of HIV-1 envelope protein on infectivity and antibody-mediated neutralization.</a> Retrovirology. 10 (14), (2013).</li>
<li>Helseth, E., Olshevsky, U., Furman, C., Sodroski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+immunodeficiency+virus+type+1+gp120+envelope+glycoprotein+regions+important+for+association+with+the+gp41+transmembrane+glycoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Human immunodeficiency virus type 1 gp120 envelope glycoprotein regions important for association with the gp41 transmembrane glycoprotein.</a> J. Virol. 65, 2119-2123 (1991).</li>
<li>Haim, H., Salas, I., Sodroski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteolytic+processing+of+the+human+immunodeficiency+virus+envelope+glycoprotein+precursor+decreases+conformational+flexibility%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Proteolytic processing of the human immunodeficiency virus envelope glycoprotein precursor decreases conformational flexibility.</a> J. Virol. 87, 1884-1889 (2013).</li>
<li>Chen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+immune+evasion+at+the+site+of+CD4+attachment+on+HIV-1+gp120%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structural basis of immune evasion at the site of CD4 attachment on HIV-1 gp120.</a> Science. 326, 1123-1127 (2009).</li>
<li>Kwong, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+evades+antibody-mediated+neutralization+through+conformational+masking+of+receptor-binding+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">HIV-1 evades antibody-mediated neutralization through conformational masking of receptor-binding sites.</a> Nature. 420, 678-682 (2002).</li>
<li>Sakai, K., Takiguchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+an+effective+AIDS+vaccine+development%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Toward an effective AIDS vaccine development.</a> Eur. J. Immunol. 43, 3087-3089 (2013).</li>
<li>Veillette, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+with+Cellular+CD4+Exposes+HIV-1+Envelope+Epitopes+Targeted+by+Antibody-Dependent+Cell-Mediated+Cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Interaction with Cellular CD4 Exposes HIV-1 Envelope Epitopes Targeted by Antibody-Dependent Cell-Mediated Cytotoxicity.</a> J. Virol. 88, 2633-2644 (2014).</li>
<li>Wibmer, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+escape+from+HIV-1+neutralizing+antibodies+drives+increased+plasma+neutralization+breadth+through+sequential+recognition+of+multiple+epitopes+and+immunotypes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Viral escape from HIV-1 neutralizing antibodies drives increased plasma neutralization breadth through sequential recognition of multiple epitopes and immunotypes.</a> PLoS Pathogens. 9 (e1003738), (2013).</li>
<li>Kovacs, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+envelope+trimer+elicits+more+potent+neutralizing+antibody+responses+than+monomeric+gp120%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">HIV-1 envelope trimer elicits more potent neutralizing antibody responses than monomeric gp120.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 12111-12116 (2012).</li>
<li>Yuan, W., Bazick, J., Sodroski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+multiple+conformational+States+of+free+monomeric+and+trimeric+human+immunodeficiency+virus+envelope+glycoproteins+after+fixation+by+cross-linker%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Characterization of the multiple conformational States of free monomeric and trimeric human immunodeficiency virus envelope glycoproteins after fixation by cross-linker.</a> J. Virol. 80, 6725-6737 (2006).</li>
<li>Guttman, M., Lee, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+interaction+between+gp41+and+gp120+is+observed+for+monomeric+but+not+oligomeric%2C+uncleaved+HIV-1+Env+gp140%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">A functional interaction between gp41 and gp120 is observed for monomeric but not oligomeric, uncleaved HIV-1 Env gp140.</a> J. Virol. 87, 11462-11475 (2013).</li>
<li>Ringe, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+strongly+influences+whether+soluble+HIV-1+envelope+glycoprotein+trimers+adopt+a+native-like+conformation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Cleavage strongly influences whether soluble HIV-1 envelope glycoprotein trimers adopt a native-like conformation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 18256-18261 (2013).</li>
<li>Desormeaux, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+highly+conserved+layer-3+component+of+the+HIV-1+gp120+inner+domain+is+critical+for+CD4-required+conformational+transitions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">The highly conserved layer-3 component of the HIV-1 gp120 inner domain is critical for CD4-required conformational transitions.</a> J. Virol. 87, 2549-2562 (2013).</li>
<li>Haim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soluble+CD4+and+CD4-mimetic+compounds+inhibit+HIV-1+infection+by+induction+of+a+short-lived+activated+state%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Soluble CD4 and CD4-mimetic compounds inhibit HIV-1 infection by induction of a short-lived activated state.</a> PLoS Pathogens. 5 (e1000360), (2009).</li>
<li>Haim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+intrinsic+reactivity+of+the+HIV-1+envelope+glycoproteins+to+CD4-independent+infection+and+global+inhibitor+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Contribution of intrinsic reactivity of the HIV-1 envelope glycoproteins to CD4-independent infection and global inhibitor sensitivity.</a> PLoS Pathogens. 7 (e1002101), (2011).</li>
<li>Thali, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+changes+in+gp120-CD4+binding+affinity+on+human+immunodeficiency+virus+type+1+envelope+glycoprotein+function+and+soluble+CD4+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Effects of changes in gp120-CD4 binding affinity on human immunodeficiency virus type 1 envelope glycoprotein function and soluble CD4 sensitivity.</a> J. Virol. 65, 5007-5012 (1991).</li>
<li>Medjahed, H., Pacheco, B., Desormeaux, A., Sodroski, J., Finzi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+HIV-1+gp120+major+variable+regions+modulate+cold+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">The HIV-1 gp120 major variable regions modulate cold inactivation.</a> J. Virol. 87, 4103-4111 (2013).</li>
<li>Thali, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+conserved+human+immunodeficiency+virus+type+1+gp120+neutralization+epitopes+exposed+upon+gp120-CD4+binding%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Characterization of conserved human immunodeficiency virus type 1 gp120 neutralization epitopes exposed upon gp120-CD4 binding.</a> J. Virol. 67, 3978-3988 (1993).</li>
<li>Finzi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topological+layers+in+the+HIV-1+gp120+inner+domain+regulate+gp41+interaction+and+CD4-triggered+conformational+transitions%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Topological layers in the HIV-1 gp120 inner domain regulate gp41 interaction and CD4-triggered conformational transitions.</a> Mol. Cell. 37, 656-667 (2010).</li>
<li>Kassa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transitions+to+and+from+the+CD4-bound+conformation+are+modulated+by+a+single-residue+change+in+the+human+immunodeficiency+virus+type+1+gp120+inner+domain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Transitions to and from the CD4-bound conformation are modulated by a single-residue change in the human immunodeficiency virus type 1 gp120 inner domain.</a> J. Virol. 83, 8364-8378 (2009).</li>
<li>Xiang, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutagenic+stabilization+and%2For+disruption+of+a+CD4-bound+state+reveals+distinct+conformations+of+the+human+immunodeficiency+virus+type+1+gp120+envelope+glycoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Mutagenic stabilization and/or disruption of a CD4-bound state reveals distinct conformations of the human immunodeficiency virus type 1 gp120 envelope glycoprotein.</a> J. Virol. 76, 9888-9899 (2002).</li>
<li>Mouquet, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex-type+N-glycan+recognition+by+potent+broadly+neutralizing+HIV+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Complex-type N-glycan recognition by potent broadly neutralizing HIV antibodies.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 3268-3277 (2012).</li>
<li>Julien, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broadly+neutralizing+antibody+PGT121+allosterically+modulates+CD4+binding+via+recognition+of+the+HIV-1+gp120+V3+base+and+multiple+surrounding+glycans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Broadly neutralizing antibody PGT121 allosterically modulates CD4 binding via recognition of the HIV-1 gp120 V3 base and multiple surrounding glycans.</a> PLoS Pathogens. 9 (e1003342), (2013).</li>
<li>Walker, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broad+neutralization+coverage+of+HIV+by+multiple+highly+potent+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Broad neutralization coverage of HIV by multiple highly potent antibodies.</a> Nature. 477, 466-470 (2011).</li>
<li>Moore, J. P., Willey, R. L., Lewis, G. K., Robinson, J., Sodroski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological+evidence+for+interactions+between+the+first%2C+second%2C+and+fifth+conserved+domains+of+the+gp120+surface+glycoprotein+of+human+immunodeficiency+virus+type+1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Immunological evidence for interactions between the first, second, and fifth conserved domains of the gp120 surface glycoprotein of human immunodeficiency virus type 1.</a> J. Virol. 68, 6836-6847 (1994).</li>
<li>Robinson, J. E., Yoshiyama, H., Holton, D., Elliott, S., Ho, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+antigenic+sites+on+HIV+gp120+identified+by+a+panel+of+human+monoclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biochem.+Suppl%22%5BJournal%5D)">Distinct antigenic sites on HIV gp120 identified by a panel of human monoclonal antibodies.</a> J. Cell. Biochem. Suppl. 16E (Q449), (1992).</li>
<li>Bonsignori, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody-Dependent+Cellular+Cytotoxicity-Mediating+Antibodies+from+an+HIV-1+Vaccine+Efficacy+Trial+Target+Multiple+Epitopes+and+Preferentially+Use+the+VH1+Gene+Family%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity-Mediating Antibodies from an HIV-1 Vaccine Efficacy Trial Target Multiple Epitopes and Preferentially Use the VH1 Gene Family.</a> J. Virol. 86, 11521-11532 (2012).</li>
<li>Brand, D., Srinivasan, K., Sodroski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determinants+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+entry+in+the+CDR2+loop+of+the+CD4+glycoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Determinants of human immunodeficiency virus type 1 entry in the CDR2 loop of the CD4 glycoprotein.</a> J. Virol. 69, 166-171 (1995).</li>
</ol>

著者らは、利害の衝突を宣言しません。

このアッセイは、HIV-1 Envの三量体が細胞表面で発現を特異的mAbの相互作用を検出するために最適化される。プロトコルが確立されると、それは全体的に低い材料コストおよび抗体の少ない量で高いスループットを培地で使用することができる。このアッセイは、トランスフェクションに基づいているので、容易にEnvのコンホメーションに及ぼす影響を研究するために、CD4のような細胞タンパク質の同時発現に適合させることができる。 しかしながら、このプロトコルのトランスフェクションベースはまた、最も重要な落とし穴の一つであることを意味する。最初に、この技術を用いて研究されるべき抗原は、独立した発現ベクターで利用可能であることが要求される。このように、さまざまな臨床ソースまたはプロウイルス構築物からのEnv遺伝子は、哺乳動物発現ベクターにサブクローニングされる必要がある。完全長のプロウイルス構築物（Veillette ら 18を参照）、この技術においても使用することができるが、これはまた、行為を意味アイブウイルス粒子の産生は、このように適切な生物学的封じ込め施設で...

三量体ウイルスエンベロープ糖タンパク質（Envの）によって媒介されるヒト免疫不全ウイルス1型（HIV-1）のエントリは、感染サイクルの第一段階である。ビリオンの表面に提示のみさらさウイルス抗原なので、Envの三量体は、中和および非中和抗体を誘発する。このように、ワクチンの免疫原の設計のための興味深い候補を表わす。しかし、可溶性または組換え形態におけるのEnvを用いたワクチン接種試験は最も主要なHIV-1に対する最小限の有効性応答を誘発し1-3を分離します。それにもかかわらず、RV144ワクチン臨床試験4で観察された部分的な有効性は、免疫原候補として、HIV-1のEnvに興味をリニューアルしました。これは、ワクチン誘発抗-ENV抗体はSIVとHIV 5挑戦に対する保護のある程度を生成するのに十分であったことを記述した最近の研究によって確証された。 小胞体内で合成された後、Envのglycoprote前駆体のgp160に、ウィルス融合プロセスを燃料する能力にとって重要なさまざまな翻訳後修飾を受ける。のEnv前駆体は、gp120-gp41の ​​リエゾンを維持し非共有相互作用で、その細胞質外gp120およびgp41の ​​膜貫通サブユニット6-10に切断される前に、三量体で適切に関連付ける倍なければなりません。感染した細胞の機構も大きく、その総質量11,12の約​​50％を占めたEnvをグリコシル化する責任があります。良い異なるコンホメーションを理解することの重要性を強調し、Envのが適応し、それ以外の場合は15〜19を暴露される特定の高度に免疫原性エピトープを非表示にすることを可能にすると考えられている準安定性を提供しながら、得られた複合体構造は、Envのは13,14立体構造的に柔軟であることを可能にするネイティブのEnv三量体によってサンプリング。 今日までに、いくつかの技術が開発され、首尾よくEnvのコンホメーションchのを研究するために使用されているアンジェス。しかし、それらは多くの場合、特定のEnvコンテキストに限定されるものでは、その限界が異なります。例えば、表面プラズモン共鳴またはコンフォメーション特異的モノクローナル抗体を用いた免疫沈降アッセイ（mAb）は、どちらかは、それらの三量体形態20,21からの免疫遺伝学的に異なることが知られている単量体の可溶性または可溶化のEnv分子に依存している。最近の研究ではまた、切断は主に抗体14,22,23を非中和により認識されるエピトープの露出をもたらしたEnvのコンフォメーションに影響を与えることを示唆している。 ここでは詳細にcellularly発現さのEnv三量体18,24-26のコンフォメーションの迅速かつ容易な決定を可能にする方法が記載されている。ヒトの付着性細胞株におけるのEnvの一過性トランスフェクション後のEnv特異的抗体の結合は、単純な化学発光反応を用いて検出される。この技術は、コンフォメーションdepenの立体配座優先性を特徴付けるために使用することができる凹み抗体。したがって、このアッセイは、堅牢で柔軟性の高い検出方法を提供する。

<table><tbody><tr><td>HOS cells</td><td>ATCC</td><td>CRL-1543</td><td></td></tr><tr><td>White Opaque Tissue Culture Plate, 96-well, Flat Bottom BD</td><td></td><td>353296</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylenimine, linear, 25,000 MW</td><td>Polysciences</td><td>23966</td><td>Prepared in 1 mg/ml solution</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Invitrogen</td><td>11995</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ Anti-human IgG, Peroxidase Conjugated</td><td>Pierce</td><td>31413</td><td></td></tr><tr><td>強化化学発光基質</td><td>PerkinElmer</td><td>NEL105001EA</td><td></td></tr><tr><td>TriStar LB 941、プレートリーダー</td><td>Berthold Technologies</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

細胞ベースのelisaアッセイを使用して、hiv-1エンベロープ糖タンパク質三量体の構造評価

Conformational Evaluation of HIV-1 Trimeric Envelope Glycoproteins Using a Cell-based ELISA Assay

HIV-1エンベロープ糖タンパク質（Env）は、標的細胞へのウイルスの侵入を媒介し、感染サイクルに不可欠です。これらの糖タンパク質が、その構造変化を通じて融合プロセスをどのように促進できるかを理解することは、ワクチン戦略のためのより優れた、より効果的な免疫原の設計につながる可能性があります。ここでは、モノクローナル抗体による三量体HIV-1 Envの認識を研究することができる細胞ベースのELISAアッセイについて説明します。トランスフェクションした細胞の表面でHIV-1三量体Envを発現させた後、コンフォメーション特異的抗Env抗体を細胞とインキュベートします。次に、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識二次抗体と単純な化学発光反応を使用して、結合した抗体を検出します。このシステムは柔軟性が高く、可溶性CD4または細胞タンパク質によって誘発されるEnvコンフォメーション変化を検出できます。最小限の材料で済み、高度に専門化された機器やノウハウは必要ありません。したがって、この手法は、新たに単離された抗体などの抗原および抗体の中スループットからハイスループットのスクリーニングに確立できます。

上記した一般的手順を用いて、野生型（wt）又は変異EnvのいずれかでたCD4iエピトープの露出に対する可溶性CD4（sCD4を）と共発現細胞のCD4の影響をアッセイするためのプロトコルを適合18,24前述したように、 25,28。 図1は、一般的な手順とsCD4を持つまたは携帯CD4 18の共発現による治療後のたCD4iエピトープの露出を表しています。 図2では、私たちは18,24期待どおり外ドメインを認識するモノクローナル抗体2G12は、この処理によって影響を受けないのに対し、たCD4iモノクローナル抗体17b及びコレセプター結合部位24,29と重なる 48dがエピトープを露出させたEnv立体構造変化を誘導するためのsCD4を使用していました。 図3に示すように、Envのコンホメーションにおける点変異の影響もまた、このアッセイを用いて評価することができる。ここでは減少を...

抗体の中和を評価し、効果的なワクチン免疫原の設計を導くためには、ウイルス表面抗原のコンフォメーションを理解する必要があります。ここでは、トランスフェクションされた細胞の表面に発現する三量体HIV-1 Envを特異的な抗Env抗体によって認識する研究を可能にする細胞ベースのELISAアッセイについて説明します。

細胞ベースのELISAアッセイを使用して、HIV-1エンベロープ糖タンパク質三量体の構造評価

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins ...

次の実験の全体的な目標は、モノクローナル抗体によるRIC HIV One Envelope糖タンパク質またはENV確認を調べることです。これは、最初に接着細胞をトランスセクトして、細胞表面でキメラHIV one E NVタンパク質を発現させることによって達成されます。第2のステップとして、細胞を抗ENVモノクローナル抗体とインキュベートし、エピトープ曝露に応じてENVに結合します。次に、HRP標識二次抗体を添加して、化学発光アッセイによる抗体相互作用を定量します。VNV結合抗体の相対レベルを示す結果が得られ、それぞれについて取得された相対的な光単位に基づいています。さて、この技術が事実に基づくタイイングなどの既存の方法よりも優れているのは、この技術が少量の抗体で、高スループットで、研究室のポスドクがこの技術を実行することができることです。この実験では、トランスフェクションプレートの1日前にヒト骨肉腫細胞を、ウェルあたり10〜4番目の細胞の2倍に使用します。不透明な96ウェル細胞培養プレートで、発光読み取りに適しています。ウシ胎児血清とペニシリンストレプトマイシンを添加した使用済みデルコス改変ワシ培地は、翌日に摂氏37度と二酸化炭素5%で細胞を一晩インキュベートします。トランスフェクション混合物を調製します。まず、2つのチューブ、2つのベイ、2つのBから2つのベイを配置します。25ミリモルのヒッピーを補充した5マイクロリットルのDMEMを加え、続いて10ナノグラムのtatおよびコーティングプラスミド、およびプラスミドをコードする150ナノグラムのキメラHIVワンエンベロープ糖タンパク質を追加します。TATコードプラスミドは、5マイクロリットルのDMMと450ナノグラムのポリエタリンまたはPEIで、プラスミドを2つのBにコードするTAT依存性HIV1エンベロープ糖タンパク質を使用する場合にのみ必要であることに注意してください。試薬とDNAの量は、同じHIV One Envelope糖タンパク質をトランスフェクションするウェルの数に応じて調整する必要があります。次に、2つのBの中身を2つのベイに加え、10秒間ボルテックスして完全に混合します。トランスフェクションミックスを室温で10分間インキュベートします。10分後、96ウェルプレートのウェルあたり10マイクロリットルのトランスフェクションミックスを添加し、摂氏37度および5%の炭素酸化物で48時間インキュベートします。モノクローナル抗体によるキメラHIV1エンベロープ糖タンパク質の認識を研究するためのAli SAは、ヒト骨肉腫細胞のトランスフェクションの2日後に行われます。同時に使用するプレートごとに250ミリリットルの洗浄バッファーを準備します。125%の脱脂粉乳と5ミリモルのトリスpH 8.0を洗浄バッファーに加えることにより、プレートあたり125ミリリットルのブロッキングバッファーを準備します。細胞培養培地とトランスフェクションミックスを96ウェルプレートから取り出します。ウェルあたり100マイクロリットルのブロッキングバッファーを添加し、20分間インキュベートします。室温で上清を除去し、ブロッキングバッファーで適切な濃度に希釈したウェルあたり50マイクロリットルの抗体を加えます。室温で1時間インキュベートします。100マイクロリットルのブロッキングバッファーで3回洗浄し、その後、洗浄プロセスを3回繰り返します。100マイクロリットルのブロッキングバッファーで3回洗浄し、最後の洗浄後に100マイクロリットルの洗浄バッファーで3回洗浄します。サテを取り外します。100マイクロリットルのブロッキングバッファーを加え、5分間インキュベートします。室温で上清を除去し、ブロッキングバッファーに1〜3000に希釈した50マイクロリットルの二次抗体を加えます。40分後に室温で40分間インキュベートします。100マイクロリットルのブロッキングバッファーで3回洗浄し、続いて100マイクロリットルの洗浄バッファーで3回洗浄します。データ取得用のサンプルを調製するには、96ウェルプレートから上清を取り除き、ウェルごとに1×1の増強化学発光基質を30マイクロリットル追加します。適切なプレートリーダーでウェルあたり1秒間の化学発光シグナルを取得します。製造業者の指示に従って、エンベロープ糖タンパク質またはENV上のCD4Iエピトープの曝露に対する可溶性CD4またはSCD4の影響は、CD4とENVとのアッセイ相互作用により、共受容体結合部位と重複する17Bおよび48Dエピトープを露出するENV確認変化を誘導するが、抗体2G12を認識する外部ドメインには影響を与えない。NV確認における点変異の影響を評価するために、2つのENV変異体が、CD 4結合確認を自発的にサンプリングする傾向が低いH 66 Aと、NVがCD4結合状態になりやすいS3 75 Wを使用しました。生データを発現レベルに応じて正規化すると、H 66 AはCD 4 I 17 Bの認識を減少させるのに対し、S3 75 Wは17 B信号を増強し、H 66の表現型を回復するのに十分であることが明らかになる。CD four expressorの量を増やしてトランスフェクトした細胞をアッセイする変異体。NVの青いバーとともに、CD four Iモノクローナル抗体、A three、two、およびC 11のシグナルの増加が明らかになり、ENV糖タンパク質の内部ドメインに不連続なエピトープが認識されました。2つのG 12抗体によるGP one 20 ENV認識は影響を受けませんでした。最後に、生データを2つのG12に正規化し、ENVがCDと相互作用する能力が低下したCD4変異体でCOTトランスフェクションされたときに32およびC11変調が存在しないことは、増加したシグナルがE NV CD4相互作用に依存していることを示している。

conformational-evaluation-hiv-1-trimeric-envelope-glycoproteins-using

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

によるHIV - 1 V3ループクラウンR2シーケンスの免疫学的に関連する動的第三紀の構造的特徴の評価第一原理折りたたみ

我々はTAT -応答LTR、HIV - 1 TAT -とRev依存的にレポーター遺伝子の発現を調節することができるREV...

緑色蛍光タンパク質を発現するリビジョンに依存するレンチウイルスベクターを用いたHIV - 1陽性細胞の特定のマーキング

プロトコルは、低温電子トモグラフィーと三次元画像処理を用いた膜タンパク質の構造を決定するためにハイスループットなアプローチを説明します。それは、試料の準備の詳細、データ収集、データ処理や解釈をカバーし、アプローチの代表的なターゲット、HIV -...

低温電子断層撮影と自動化されたサブ断層アベレージングを使用して、HIVエンベロープ糖タンパク質の分子構造の決定

ナノモル親和性HIV - 1BA - Lのgp120に対するいくつかの2'...

siRNA導入のための細胞型に特異的な抗HIV gp120のアプタマーの開発

この資料では、全内部反射蛍光（全反射）顕微鏡による平面脂質二重層をサポートしてガラス基板上にHIV-1エンベロープによって誘導されるウイルス学的シナプスの形成を可視化する方法について説明します。方法はまた、HIV-1エンベロープ誘発性ウイルス学的シナプス形成時に発生するシグナル伝達分子の活性化および再配布を検出する免疫​​蛍光染色と組み合わせることができます。...

合成脂質二重膜上でHIV-1エンベロープ誘発性ウイルス学的シナプスとシグナリングのイメージング

ここでは、コムギ胚芽ベースのin vitro翻訳システムで合成されたYFPタグ付きGagと電気形成技術によって調製されたGUVを使用して、HIV-1 Gagと脂質膜との間の相互作用を視覚的に分析するin vitro膜結合アッセイを示します。...

巨大単層ベシクル（GUV）膜への結合HIV-1のGagの可視化

96 遺伝子の発現を量的に方法論が説明し、単一セルがex vivo、差動の同定を可能にする 18 の表面タンパク質は感染していない細胞を基準にしてウイルスに感染した細胞の遺伝子そして蛋白質を表明しました。+ T 研究 SIV 感染 CD4...

MRNA およびサル免疫不全ウイルス感染 cd4 表面タンパク質発現の単一細胞定量+ T 細胞孤立したアカゲザルから

HIV 1 融合を介して流れ cytometry または蛍光顕微鏡による検出可能な緑の蛍光蛋白質の表現を報告する細胞に基づく試金を記述します。無料のセル、セルを感染システムでウイルスのエントリ (特にの融合手順)...

高スループットの Cre Lox 活性化ウイルスの膜融合アッセイの HIV-1 ウイルス膜融合阻害剤を識別するために

ここでは、抗原表示ウイルス様粒子(VLPs)上の中和エピトープを検出するプロトコルを提示する。ヒト免疫不全ウイルス(HIV)由来VLPの免疫沈降は、G結合型磁気ビーズのタンパク質に結合したエンベロープ糖タンパク質特異的モノクローナル抗体を用いて行う。捕獲されたVLPは、その後、SDS-PAGEおよびウイルスコアタンパク質Gag特異的抗体を採用したウェスタンブロット分析を行う。...

捕捉アッセイを用いたウイルス様粒子(VLP)ベースワクチンに対する抗原中中和感受性エピトープの検出

ここでは、デュアルレポーターフローサイトメトリーシステムを使用して、アンジオテンシン変換酵素-2結合磁気マイクロスフェアによって捕捉された無傷の重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2(SARS-CoV-2)ウイルス粒子上の2つのユニークなスパイクタンパク質エピトープを同時に検出する、新たに開発されたマルチプレックス蛍光免疫測定法について説明します。...

マルチプレックスデュアルレポーター法によるウイルス粒子上の表面タンパク質エピトープのプロファイリング

ここでは、特にHIV-1感染に重点を置いて、小胞体(ER)ストレスとアンフォールデッドタンパク質応答(UPR)の活性化を決定するためのいくつかの確立された方法について説明します。この記事では、ER ストレス/UPR が HIV-1...

HIV-1感染T細胞における小胞体ストレスとアンフォールドタンパク質応答の測定とHIV-1複製におけるその役割の解析

学ぶ細胞ベースのELISAアッセイを用いてHIV-1エンベロープ糖タンパク質三量体の構造を評価する方法。少量の抗体で高スループット解析が可能であり、ワクチン設計に有用な情報を提供します。

細胞ベースのELISAアッセイを使用して、HIV-1エンベロープ糖タンパク質三量体の構造評価

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