細胞ベースのELISAアッセイを使用して、HIV-1エンベロープ糖タンパク質三量体の構造評価

次の実験の全体的な目標は、モノクローナル抗体によるRIC HIV One Envelope糖タンパク質またはENV確認を調べることです。これは、最初に接着細胞をトランスセクトして、細胞表面でキメラHIV one E NVタンパク質を発現させることによって達成されます。第2のステップとして、細胞を抗ENVモノクローナル抗体とインキュベートし、エピトープ曝露に応じてENVに結合します。

次に、HRP標識二次抗体を添加して、化学発光アッセイによる抗体相互作用を定量します。VNV結合抗体の相対レベルを示す結果が得られ、それぞれについて取得された相対的な光単位に基づいています。さて、この技術が事実に基づくタイイングなどの既存の方法よりも優れているのは、この技術が少量の抗体で、高スループットで、研究室のポスドクがこの技術を実行することができることです。

この実験では、トランスフェクションプレートの1日前にヒト骨肉腫細胞を、ウェルあたり10〜4番目の細胞の2倍に使用します。不透明な96ウェル細胞培養プレートで、発光読み取りに適しています。ウシ胎児血清とペニシリンストレプトマイシンを添加した使用済みデルコス改変ワシ培地は、翌日に摂氏37度と二酸化炭素5%で細胞を一晩インキュベートします。

トランスフェクション混合物を調製します。まず、2つのチューブ、2つのベイ、2つのBから2つのベイを配置します。25ミリモルのヒッピーを補充した5マイクロリットルのDMEMを加え、続いて10ナノグラムのtatおよびコーティングプラスミド、およびプラスミドをコードする150ナノグラムのキメラHIVワンエンベロープ糖タンパク質を追加します。

TATコードプラスミドは、5マイクロリットルのDMMと450ナノグラムのポリエタリンまたはPEIで、プラスミドを2つのBにコードするTAT依存性HIV1エンベロープ糖タンパク質を使用する場合にのみ必要であることに注意してください。試薬とDNAの量は、同じHIV One Envelope糖タンパク質をトランスフェクションするウェルの数に応じて調整する必要があります。次に、2つのBの中身を2つのベイに加え、10秒間ボルテックスして完全に混合します。

トランスフェクションミックスを室温で10分間インキュベートします。10分後、96ウェルプレートのウェルあたり10マイクロリットルのトランスフェクションミックスを添加し、摂氏37度および5%の炭素酸化物で48時間インキュベートします。モノクローナル抗体によるキメラHIV1エンベロープ糖タンパク質の認識を研究するためのAli SAは、ヒト骨肉腫細胞のトランスフェクションの2日後に行われます。

同時に使用するプレートごとに250ミリリットルの洗浄バッファーを準備します。125%の脱脂粉乳と5ミリモルのトリスpH 8.0を洗浄バッファーに加えることにより、プレートあたり125ミリリットルのブロッキングバッファーを準備します。細胞培養培地とトランスフェクションミックスを96ウェルプレートから取り出します。

ウェルあたり100マイクロリットルのブロッキングバッファーを添加し、20分間インキュベートします。室温で上清を除去し、ブロッキングバッファーで適切な濃度に希釈したウェルあたり50マイクロリットルの抗体を加えます。室温で1時間インキュベートします。

100マイクロリットルのブロッキングバッファーで3回洗浄し、その後、洗浄プロセスを3回繰り返します。100マイクロリットルのブロッキングバッファーで3回洗浄し、最後の洗浄後に100マイクロリットルの洗浄バッファーで3回洗浄します。サテを取り外します。

100マイクロリットルのブロッキングバッファーを加え、5分間インキュベートします。室温で上清を除去し、ブロッキングバッファーに1〜3000に希釈した50マイクロリットルの二次抗体を加えます。40分後に室温で40分間インキュベートします。

100マイクロリットルのブロッキングバッファーで3回洗浄し、続いて100マイクロリットルの洗浄バッファーで3回洗浄します。データ取得用のサンプルを調製するには、96ウェルプレートから上清を取り除き、ウェルごとに1×1の増強化学発光基質を30マイクロリットル追加します。適切なプレートリーダーでウェルあたり1秒間の化学発光シグナルを取得します。

製造業者の指示に従って、エンベロープ糖タンパク質またはENV上のCD4Iエピトープの曝露に対する可溶性CD4またはSCD4の影響は、CD4とENVとのアッセイ相互作用により、共受容体結合部位と重複する17Bおよび48Dエピトープを露出するENV確認変化を誘導するが、抗体2G12を認識する外部ドメインには影響を与えない。NV確認における点変異の影響を評価するために、2つのENV変異体が、CD 4結合確認を自発的にサンプリングする傾向が低いH 66 Aと、NVがCD4結合状態になりやすいS3 75 Wを使用しました。生データを発現レベルに応じて正規化すると、H 66 AはCD 4 I 17 Bの認識を減少させるのに対し、S3 75 Wは17 B信号を増強し、H 66の表現型を回復するのに十分であることが明らかになる。

CD four expressorの量を増やしてトランスフェクトした細胞をアッセイする変異体。NVの青いバーとともに、CD four Iモノクローナル抗体、A three、two、およびC 11のシグナルの増加が明らかになり、ENV糖タンパク質の内部ドメインに不連続なエピトープが認識されました。2つのG 12抗体によるGP one 20 ENV認識は影響を受けませんでした。

最後に、生データを2つのG12に正規化し、ENVがCDと相互作用する能力が低下したCD4変異体でCOTトランスフェクションされたときに32およびC11変調が存在しないことは、増加したシグナルがE NV CD4相互作用に依存していることを示している。