Name: によるHIV - 1 V3ループクラウンR2シーケンスの免疫学的に関連する動的第三紀の構造的特徴の評価第一原理折りたたみ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-15T17:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 50 s
Description: 学ぶHIV-1 R2株V3ループクラウンの動的構造特性を第一原理折りたたみシミュレーションで評価する手法。ベータストランド配座と中和感受性の相関を解析し、ワクチン設計に有用な知見を得る。

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1。方法<ol><li>プロトコルの最初のステップでは、in silicoでフォールドするV3王冠のシーケンスを選択することです。 R2の株について、このフラグメントのシーケンスはKSIPMGPGRAFYTです。 </li><li>この配列に相当するペプチドの三次元原子構造は、コンピュータの仮想空間に構築する必要があります。このためにICMのコマンドは次のとおりです。 buildpep"KSIPMGPGRAFYT" または[ファイル：新規：ペプチドは、プルダウンメニューで選択することができます</li><li>手順のいくつかのパラメータは、検索のステップ数（検索の長さ）、シミュレーションの温度、バイアス合理的な分野、エネルギーの観点から、異なるエネルギーの計算方法の選択に向かって検索を変数に制約を含む検索戦略パラメータを含む、設定されていますと検索がこのようなムービーを記録するかどうかとして記録し、どのように多くの中間得点コンフォメーションする方法を示すパラメータが記録されることが望ましい。すべてのこれらのパラメータは、以前の出版物（www.molsoft.comを参照）によって最適化されています。 </li><li>折りたたみは、次のコマンドを使用して開始されます。 モンテカルロ または[ファイル：新規：ペプチドは、メニュー分子力学プルダウンで選択することができます。最小化：グローバル 前者の場合には、ステップ3からのパラメータは、コマンドラインで一つ一つ設定する必要があります。コマンドが実行される前に、後者のケースでは、最も一般的に選択したパラメータのチェックボックスがペインに提供されています。便宜上、この実験と以前に公表された実験に利用したのと同じ折りたたみICMのスクリプトはここに示されています： <img src="/files/ftp_upload/2118/2118output.jpg" alt="出力" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="出力"> このスクリプトは、テキストフ​​ァイルに保存され、急速にコマンドを使用してコンピュータのオペレーティングシステムのコマンドライン（通常、Linux）から実行できます。 ICM _foldingscript </li></ol> 2。成功の秘訣<ol><li> V3ループは、ほとんどすべての既知の菌株の長さが一定の35アミノ酸であり、アミノ酸の位置は1でシスチン結合元のジスルフィドから始まり、35でシスチン結合に対応するジスルフィドで終了する1〜35に番号が付けられていますので。それがループの一部なので、V3の王冠の境界は慎重に選択する必要があります。大きすぎるフラグメントが選ばれているなら、それは遊離ペプチドであるかのように自由に柔軟なセグメントとして動作する可能性は低い、折り畳みシミュレーションが正しく構造を評価しないように。小さすぎるフラグメントが選択されている場合は、有益な三次構造は、シミュレーションで形成されないことがあります。私たちの以前の研究では、位置10から位置22へのフラグメントは、抗体結合結晶コンフォメーションと相関することを示したので、これは折り畳みのために選択する必要のあるすべてのV3ループの断片です。 </li><li>グラフィカルユーザーインタフェースを使用しているがとプルダウンメニューは、ICMとスクリプト上で使用した特定のV3ループの王冠のフォールディングを使用して、一般的にペプチドの折りたたみに関するユーザーフレンドリーな、成功する前の仕事、単にbuildpepラインにシーケンスを変更および実行することです。コマンドラインから上記スクリプトの使用をお勧めします。 </li></ol> 3。代表的な結果 R2の折りたたみの結果は任意のV3ループの結果の代表的なものである。結果を評価するために、プロジェクトファイルは、（それが上記のスクリプトから"newProject1.icb"という名前になります）選ばれた"と分子力学、スタックは、表示"を開き、必要があります。スタックのコンフォメーションの表が表示されます。スタックのコンフォメーションは、プロット/ヒストグラムアイコンをクリックして、グラフィカルに可視化することができる。 "分子力学、スタック、プレイは"視覚的に折りたたみ式によって発見された立体配座の好みを理解するためにスタックのムービーを作成します。 α-ヘリックスのコンフォメーション、特に明確なβ-ストランドの設定がスタック全体に見られる12から14の位置にある断片で、そして非常に少数- R2のシーケンスの場合は、コンフォメーションは、β-ヘアピン等のV3ループ2に期待されている見られている。さらに、約3単位のエネルギーギャップは、最低エネルギーコンフォメーションと番目に低いエネルギー配座の間に見られる。エネルギーの観点から、この手段時間の1％未満の最低エネルギー配座の構造のみがちらつくていること：折り畳み式の結果は、したがって、R2 V3王冠が硬いのではなく、柔軟性、構造であることを示唆している。そこにコンフォメーションのアンサンブルにおける他の重要な構造的特徴であるが、それらは体系的に理解することが困難である場合があります。 <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> JRFL </td><td> SF162_V3JRFL </td><td> SF162_V3R2 </td></tr><tr><td> 447 - 52D GMT 50 </td><td> 15 </td><td> 0.00061 </td><td> 0.00078 </td></tr></tbody></table> 表1：マスクとマスクされていない設定でJRFLとR2 V3ループの相対的な中和。データは、以前はカルドソT.、 ら。ARHR（200で報告された8）とピンター、A.、 ら。ら J. Virol（2004）。 SF162_V3JRFLが含まれていますJRFL：簡単に言えば、中和活性は、env -欠陥ルシフェラーゼ発現JRFL Envのまたは上記SF162 V3の亜種でシュードpNL4 - 3.Luc.RE -プラスミドで生成されたpsVsを使用して単一サイクルの感染性試験により測定したSF162 V3のループシーケンスの代わりにV3のループシーケンス。 SF162_V3R2はSF162 V3のループシーケンスの代わりにR2のV3のループシーケンスが含まれています。 psVsは、37で1.5時間のための447 - 52D mAbの連続希釈液° Cをインキュベートし、ポリブレンの存在（10 mgの= mL）を96ウェルプレートに播種CD4 + CCR5 + U87標的細胞に添加した。 24時間後、細胞をインキュベーションの追加の24〜48時間で10％FBSおよび10 mg = mLのポリブレンを含むRPMI培地でrefeedの過去過去分詞形れました。ルシフェラーゼ活性はプロメガからアッセイ試薬を用いてマイクロタイタープレートルミノメーター（HARTA、（株））と48〜72時間の感染後に決定された、447 - 52D 50％の中和（GMT50）のための（株）幾何平均力価は、中和曲線から補間により決定され、少なくとも3つの独立したアッセイの平均値である。

<ol><li>Almond, D., Kimura, T., Kong, X., Zolla-Pazner, S. &amp, Cardozo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+characterization+of+the+V3+loop+crown%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Therapy%22%5BJournal%5D)">Dynamic characterization of the V3 loop crown.</a> Antiviral Therapy. 12, 13-31 (2007).</li>
<li>Almond, D., Kimura, T., Kong, X., Swetnam, J., Zolla-Pazner, S., Cardozo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+conservation+predominates+over+sequence+variability+in+the+crown+of+HIV+type+1%27s+V3+loop%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS+Res+Hum+Retroviruses%22%5BJournal%5D)">Structural conservation predominates over sequence variability in the crown of HIV type 1's V3 loop.</a> AIDS Res Hum Retroviruses. 26, (2010).</li>
<li>Abagyan, R., Totrov, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biased+probability+Monte+Carlo+conformational+searches+and+electrostatic+calculations+for+peptides+and+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Biased probability Monte Carlo conformational searches and electrostatic calculations for peptides and proteins.</a> J Mol Biol. 235, 983-1002 (1994).</li>
<li>Quinnan, G. V., Zhang, P. F., Fu, D. W., Dong, M., Alter, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+characterization+of+HIV+type+1+envelope+protein+associated+with+a+broadly+reactive+neutralizing+antibody+response%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS+Res+Hum+Retroviruses%22%5BJournal%5D)">Expression and characterization of HIV type 1 envelope protein associated with a broadly reactive neutralizing antibody response.</a> AIDS Res Hum Retroviruses. 15, 561-5670 (1999).</li>
<li>Zhang, P. F., Bouma, P., Park, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+variable+region+3+%28V3%29+mutation+determines+a+global+neutralization+phenotype+and+CD4-independent+infectivity+of+a+human+immunodeficiency+virus+type+1+envelope+associated+with+a+broadly+cross-reactive%2C+primary+virus-neutralizing+antibody+response%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">A variable region 3 (V3) mutation determines a global neutralization phenotype and CD4-independent infectivity of a human immunodeficiency virus type 1 envelope associated with a broadly cross-reactive, primary virus-neutralizing antibody response.</a> J Virol. 76, 644-655 (2002).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

のab initioの折りたたみは、三次構造上の特性、順次個々のアミノ酸の研究から明らかでないかもしれないの効果を明らかにする。 R2 V3ループ王冠のいくつかの以前に無名の構造特性は、フォールディングシミュレーションによって明らかにされています。これらの観測された構造的な好みは、中和とhyperinfectivity 5〜感度すなわち、R2のひずみの観測機能的特性と相関することがあります。 最初に、位置12から14時R2のV3の王冠のN末端側半分の明確なβ-ストランドの傾向が観察される。これはR2の歪みの珍しいイソロイシン - プロリン-メチオニン（IPM）のシーケンスの位置です。結晶447 - 52Dの構造、2219、Be48、2557、2558とV3ループペプチドに結合した537 - Dの抗V3ループの抗体から、V3ループの位置12〜14、バインドされたときに、これらの抗体によって結合し、とされ​​ていますセグメントは、地元のβ-鎖コンフォメーションを採用しています。折り畳みシミュレーションはこのようにR2 V3ループ王冠は既知の抗V...

<table><tbody><tr><td>ICM-Pro</td><td>Molsoft LLC</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

によるhiv - 1 v3ループクラウンr2シーケンスの免疫学的に関連する動的第三紀の構造的特徴の評価第一原理折りたたみ

Assessment of Immunologically Relevant Dynamic Tertiary Structural Features of the HIV-1 V3 Loop Crown R2 Sequence by ab initio Folding

HIV - 1の抗原の多様性は、長い間ワクチンの設計への障害となっており、この変動は、特にウイルスの表面のエンベロープ糖タンパク質のV3ループの中で発音されます。我々は以前、ダイナミック、シーケンス変数が、V3ループの王冠と提案した免疫学的に関連するβ-ヘアピン三次構造へのHIV - 1ウイルスの人口全体に制約されます。重要なのは、別のV3ループの王冠のシーケンスの数千は結晶学やNMRによることが困難または不可能なウイルスの多様性全体の動向の3次元構造解析を行う、HIV - 1ウイルスの循環でもあります。 V3王冠1、2の折り畳みと私たちの以前の成功した研究では、ICM - Proの分子モデリングのソフトウェアパッケージ（Molsoft LLC、ラホーヤ、カリフォルニア州）でアクセス可能なのab initioのアルゴリズム3を使用して示唆されたV3ループの王冠、特にから位置10から22、それは溶液中で自由に折りたたみ式の制約のないペプチドであるかのように大規模な程度に動作するように十分にその隣接茎の柔軟性と長さから利益を得る。 60,000個々の株のV3ループのちょうどこの部分のような、急激なのab initioフォールディングとして+循環HIV - 1株は、有益なことができます。ここで、我々は、そのユニークな特性の構造的基盤への洞察を得るためにR2株のV3ループを折ら。 R2は、患者の血清およびモノクローナル抗体4,5による中和にこの株の絶妙な感度の責任であると考えられる稀なV3のループシーケンスを負いません。ひずみCD4非依存性感染症を媒介とは、広く中和抗体を誘発するために表示されます。我々は、折りたたみの結果の評価がR2のために観察された免疫学的活動と折りたたみで観測された構造を関連付けるための有益なことができる方法を示しています。

HIV - 1の表面のエンベロープ糖タンパク質（gp120の）の別のV3のループシーケンスの冠の領域は、構造的にポジションのインシリコのフォールディングにによって多くのケースで特徴づけることができる最新鋭のを使用してループの10から22<em&gt;第一原理</em&gt;折りたたみア​​ルゴリズム。ここでは、HIV - 1のR2株、不可解な機能特性を持つユニークな中和感受性株からのV3ループのこの地域の折りたたみと評価を示しています。

によるHIV - 1 V3ループクラウンR2シーケンスの免疫学的に関連する動的第三紀の構造的特徴の評価第一原理折りたたみ

HIV-1の抗原多様性は、長年ワクチン設計の妨げとなってきており、この変動性は特にウイルスのV3ループにおいて顕著である...

本実験の全体的な目的は、AR foldingを用いてHIVのR2株におけるV3ループ冠ペプチド配列の動的な構造上の好みを評価し、その結果をR2株の既知の中和感度と相関させることです。これは、AR bonniでフォールディングさせるために、R2 V3ループ冠の適切な断片を選択することによって達成されます。第二のステップとしてフォールディングのシミュレーションを行い、R2冠断片のあらゆる可能なコンフォメーションを探索し、最も可能性の高いコンフォメーションをスタックファイルに記録します。次に、記録されたコンフォーメーションを解析し、中和感受性を説明し得るR2V3クラウンの動的な構造的優先性を決定します。二次構造、優先性、および探索したコンフォーメーションスタックのエネルギー分布に基づき、V3ループの12番目から14番目の位置にある剛直なβストランドへの優先性が示される結果が得られます。こんにちは、ニューヨーク大学医学部薬理学部の研究室からお話ししております、Timothy Cardozoです。本日は、GP120として知られる免疫原性HIV-1ウイルスタンパク質のフレキシブルループにおけるin vitroタンパク質折畳みの手順をご紹介します。このフレキシブルループは、HIV-1ウイルスの表面エンベロープ糖タンパク質のV3ループとして知られており、その先端部分はV3ループのクラウンと呼ばれています。今回は、この領域の折畳みを行います。当研究室では、効果的なHIVワクチン設計に向けた有用な経路を特定するために、この手順を用いています。それでは、始めていきましょう。まず、in silicoでフォールディングさせるV3ループ配列を選択してください。当研究室による先行研究では、任意のV3ループ配列の10番目から22番目の位置が最良の結果を示すことが示されています。ICM Pro分子モデリングソフトウェアのグラフィカルユーザーインターフェース（GUI）にある使いやすいプルダウンメニューを使用して、アルメニオ・フォールディング実験を実行します。まず、この配列に対応するペプチドの三次元原子構造をコンピュータの仮想空間内に構築する必要があります。三次元原子構造を構築するには、「File」メニューから「New」を選択します。これにより、複数のタブが表示された画面が開きます。「peptide」タブを選択し、テキストボックスに配列を貼り付けるか入力してください。「OK」をクリックして、ペプチドの三次元構造を構築します。構造がICMのグラフィカルウィンドウに表示されます。3次元構造の構築が完了したら、分子力学メニューから「minimize」を選択すると、サイドメニューが表示されます。そのサイドメニューから「global」を選択してください。これにより、いくつかの入力フィールドと、デフォルトのパラメータが既に選択されたチェックボックスが表示された画面が開きます。必要に応じて、選択を変更して折りたたむペプチドを選択してください。グローバルムーブの回数およびローカル最小値探索（local min call）の回数をそれぞれ変更することで、シミュレーションの長さと精度を調整します。ペプチドの全原子折り畳み（all atom folding）をすべて選択します。次に、「save movie」を選択して、折り畳みのムービーファイルを作成します。最後に、「apply」をクリックして、グラフィカルウィンドウで折り畳みを開始します。アルゴリズムはペプチドをさまざまなコンフォメーションに折り畳み始め、それぞれのコンフォメーションについてペプチドエネルギーを算出して記録します。完了後、エネルギー的に最も安定したペプチドのコンフォメーション、およびほぼ同等のエネルギーを持つ代替コンフォメーションが特定され、コンピューター上で可視化されます。ペプチド折り畳みの実行において、GUIを使用することで折り畳みの様子を確認できますが、V3ループクラウンの折り畳みに最適なパラメータ選択を行うことはできません。この目的のためには、グラフィカルではないコマンドラインからスクリプトを用いてフォールディングを行うのが最適です。スクリプトとは、単に一連のテキストコマンドをドキュメントやテキストファイルに一行ずつ保存したものであり、これらをICMプログラムに自動的に読み込ませ、順次実行することで、コマンドラインスクリプトを用いてV3ループをフォールディングさせます。まず、コンピュータのハードディスク内のローカルディレクトリに保存するためのテキストファイルを作成します。前述と同様に、まずはコンピュータの仮想空間内でペプチドを構築することから始めてください。次に、シミュレーションに名前を付け、自由変数の数を設定します。ここで言う自由変数とは、フォールディングにおいて回転可能な状態で残されたペプチド中の化学結合のことです。続いて、V3ループの最適なフォールディングを得るために、シミュレーションを実行する時間を指定します。この時間は、前段階で特定した自由変数の数によって決まります。実験におけるコンフォメーション探索の精度を決定するため、各局所安定点（ローカルミニマム）で実行する探索ステップ数を設定してください。次に、温度最小化、勾配、および確率分布など、先行研究に基づいてシミュレーション用に最適化されたその他のパラメータを設定します。実験パラメータの設定後、フォールディング中に使用するエネルギー計算を指定します。ここでは、Vander Vi's energyをVW internal peptideで指定します。エネルギーは14で示され、水素結合エネルギーはHB、静電エネルギーはEl、溶媒和エネルギーはSF、エントロピーはENでそれぞれ表されます。探索対象とする優先的な主鎖および側鎖の角度、ならびに開始コンフォメーションを含む最終設定を指定してください。最後に、計算を実行し、保存するためのコマンドを記述します。スクリプトを記述してテキストファイルとして保存したら、コンピュータのオペレーティングシステムのコマンドプロンプトからそれを実行してください。前述と同様に、ペプチドの最もエネルギー的に安定なコンフォメーションおよび同等のエネルギーを持つ代替コンフォメーションが特定され、コンピュータ上で可視化するためにプロジェクトファイルに保存されます。計算が完了したら、EEプルダウンメニューから「file open」を選択してファイルを開きます。ワークスペースパネルにある分子の隣のチェックボックスをクリックして分子を表示し、「molecular mechanics stack view」を選択します。フォールディングによる上位ペプチドコンフォメーションのエネルギー順スタックを表示するには、スタックパネルの右下にあるプロッティングツールをクリックして結果をプロットします。まず、表示されたウィンドウで「OK」をクリックし、次にプロットの中央にある「best confo」タブをクリックします。その後、結果のスタックテーブルの最初の行（検索で見つかった最低エネルギー配座）をクリックします。すると、グラフィカルウィンドウ内のペプチド構造が、最低エネルギー配座に再配置されます。このコンフォメーションについて、特にペプチドの最初の5残基において、βストランド様またはαヘリックス様の特性があるか解析します。配列のこの領域を選択し、画面左上のスティックアイコンをクリックしてすべての原子を表示させます。次に、エネルギー結果のスタックを解析し、最適なコンフォメーションをプロットする必要があります。最低エネルギーのコンフォメーションが他のコンフォメーションから大幅に離れている場合、それは構造が硬い傾向にあることを示しています。結果を評価するには、プロジェクトバイアルを開き、[molecular mechanics stack view]を選択します。すると、スタックコンフォメーションの表が表示されます。プロットヒストグラムアイコンをクリックして、スタックコンフォメーションを可視化してください。最後に、molecular mechanics stack playをクリックしてスタックのムービーを作成し、ここでのフォールディングによって明らかになった構造上の優先性を視覚化します。R2のフォールディングの結果が表示されます。構造はαヘリックスではなく、V3ループクラウンで予想される通りランダムコイルとなっており、特に12番目から14番目の残基のフラグメントにおいて顕著です。V3ループでは、スタック全体にわたって明確なβストランドの構造的優先性が認められ、αヘリックス構造はほとんど観察されません。局所的なβストランド構造は、その伸長した直線的な形状によって認識されます。ここはR2株に見られる特異なイソロイシン-プロリン-メチオニン配列の位置であり、この部位におけるHIV株の中では稀な配列であり、R2の特異な性質の原因であると仮説を立てられています。さらに、最低エネルギー構造と2番目に低いエネルギー構造との間には、ほぼ3ユニットのエネルギーギャップが見られます。したがって、構造が最低エネルギー構造以外に変動するのは1%未満であり、R2V3クラウンおよび12番目から14番目の位置における局所的なベータストレイン構造は、完全に柔軟であるというよりも、より剛直な構造を持っていることが示唆されます。以上で、ICMソフトウェアに実装されたabioアルゴリズムを用いてV3ループクラウン配列をフォールディングさせる方法と、HIVウイルスのR2ストレインを用いてその結果を解析する方法について解説しました。例として、本手順を行う際は、V3ループの断片に対応するフォールディングペプチドの配列を慎重に選択することが重要です。また、構造的な優先性とエネルギーに関する結果の解釈については、分子モデラーの専門的な助言を受けることが重要です。以上となります。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。

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