によるHIV - 1 V3ループクラウンR2シーケンスの免疫学的に関連する動的第三紀の構造的特徴の評価第一原理折りたたみ

次の実験の全体的な目標は、ARフォールディングを介してHIVのR two株のV three crownペプチド配列の動的構造選好を評価し、その結果をR two株の既知の中和感度と相関させることです。これは、ARボンニを折りたたむためにR 2 V 3ループクラウンの適切なフラグメントを選択することによって達成されます。第2のステップとして、フォールディングのシミュレーションが実行され、R 2クラウンフラグメントの可能なすべての確認を検索し、スタックファイル内で最も可能性の高い確認を記録します。

次に、記録された確認を分析して、R 2 V 3クラウンの動的構造的好みを決定し、その中和感度を説明できる可能性があります。結果は、検索された確認のスタックの二次構造、好み、およびエネルギー分布に基づいて、V 3ループの硬質ベータ鎖位置12〜14の好みを共有する結果が得られます。こんにちは、私はティモシー・カルドゾで、ニューヨーク大学医学部薬理学部の私の研究室からお話ししています。

今日は、GP one 20として知られる免疫原性HIV oneウイルスタンパク質上のフレキシブルループのabioタンパク質フォールディングの手順を紹介します。柔軟なループは、HIV Oneウイルスのこの表面エンベロープ糖タンパク質のV 3ループとして知られており、その先端はV 3ループのクラウンとして知られています。これは私たちが折りたたむ領域です。

私たちの研究室では、この手順を使用して、HIVワクチンの設計を成功させるための生産的な道筋を特定するのに役立てています。それでは始めましょう。この手順を開始するには、in silicoで折りたたむVの3つのクラウンシーケンスを選択します。

このラボの以前の研究では、任意のV 3ループシーケンスの位置10〜22が最良の結果をもたらし、グラフィカルユーザーインターフェースまたはICM Pro MolecularモデリングソフトウェアのGUIのユーザーフレンドリーなプルダウンメニューを使用してアルメニオフォールディング実験を実行することが示されています。まず、この配列に対応するペプチドの3次元原子構造を、コンピュータの仮想空間エースに組み込む必要があります。3次元原子構造を構築するには、ファイルメニューの下に移動して[新規]を選択します。

これにより、いくつかのタブを含む画面が表示されます。ペプチドタブを選択し、テキストボックスに配列を貼り付けるか入力します。[OK]をクリックして、ペプチドの3次元構造を構築します。

構造はICMのグラフィカルウィンドウに表示されます。3次元構造が構築されたら、分子力学メニューに移動し、サイドメニューとしてポップアップする最小化を選択します。サイドメニューから [global] を選択します。

これにより、いくつかの入力フィールドと、デフォルトのパラメーターにすでに選択されているチェックボックスが表示された画面が表示されます。必要に応じて、選択を変更して折り畳むペプチドを選択します。シミュレーションの長さと精度を調整するには、グローバル移動の数とローカルの最小呼び出しの数をそれぞれ変更します。

ペプチドのすべての原子フォールディングに対してallを選択します。次に、[ムービーの保存]を選択して、折り畳みのムービーファイルを作成します。最後に、[適用]をクリックして、グラフィカルウィンドウで折り畳みを開始します。

アルゴリズムは、ペプチドをさまざまな確認に折り畳み始め、確認ごとにペプチドエネルギーを計算して記録します。完了すると、ペプチドの最もエネルギー的に安定な確認、ならびにほぼ同じエネルギーを有する代替の確認が同定され、コンピュータ上で可視化されるペプチドフォールディングを実行する。グーイを使用すると、折り畳みがどのように見えるかを示しますが、V3ループクラウンの折り畳みに理想的なパラメータ選択はできません。

この目的のために、非グラフィカルなコマンドラインから折り畳みを実行するのが最善です スクリプトを使用して、スクリプトは単に一連のテキストコマンドをドキュメントまたはテキストファイルに行ごとに保存し、ICMプログラムに自動的に供給され、コマンドラインのスクリプトを使用してV3ループを折りたたむために次々に実行されます。まず、コンピューターのハードディスクのローカルディレクトリに保存するテキストファイルを書き込みます。前回と同様に、コンピューターの仮想空間でペプチドを構築することから始めます。

次に、シミュレーションに名前を付け、フリー変数の数を設定します。これは、フォールディング内で自由に回転できるペプチド内の化学結合です。次に、V 3 ループの最適な折り畳みのためにシミュレーションを実行する時間を指定します。これは、実験での確認検索の精度を決定するために前のステップで特定された自由変数の数に依存し、各ローカル最小値で実行される検索ステップの数を設定します。

次に、以前の研究に基づいてシミュレーション用に最適化された他のパラメーター (温度最小化、勾配、確率分布など) を設定します。実験パラメータの設定に続いて、折り畳み中に使用されるエネルギー計算を示します。ここで、Vander ViのエネルギーはVW内部ペプチドによって示されます。

エネルギーは14で示され、水素結合エネルギーはHB静電で示されます。エネルギーはエル・サルベーションで示されます。エネルギーは SF で表され、エントロピーは EN で表されます。検索する優先バックボーンとサイドチェーンの角度、開始確認など、最終設定を指定します。

最後に、実行するコマンドを記述して計算を保存します。スクリプトが書き込まれ、テキストファイルとして保存されたら、コンピューターのオペレーティングシステムのコマンドローンプロンプトから実行します。以前と同様に、ペプチドの最もエネルギー的に安定した確認と、同等のエネルギーを持つ代替の確認が特定され、コンピューター上で視覚化するためにプロジェクトファイルに保存されます。

計算が完了したら、EEプルダウンメニューからファイルを開くを選択してファイルを開きます。ワークスペースパネルで分子の横にあるチェックボックスをクリックして分子を表示し、分子力学スタックビューを選択します。フォールディングから上位のペプチド確認のエネルギーランクスタックを表示するには、スタックパネルの右下隅にあるプロットツールをクリックして結果をプロットします。

最初に結果のウィンドウで[OK]をクリックし、次にプロットの中央のタブをクリックしてから、[best confo]というプロットのタブをクリックします。次に、検索結果のスタックテーブルの最初の行(検索で見つかった最も低いエネルギー確認)をクリックします。ペプチド構造は、グラフィカルウィンドウで最も低いエネルギーの確認に再配置されます。

この確認を分析して、特にペプチドの最初の5つの位置におけるベータ鎖様またはαヘリックス特性を確認します。シーケンス内のこの領域を選択し、画面の左上にあるスティックアイコンをクリックして、すべての原子を表示します。次に、エネルギー結果のスタックを分析して、最適な確認をプロットする必要があります。

最も低いエネルギーの確認が他の確認から大きなギャップで区切られている場合、それは剛性構造への傾向を示しています。結果を評価するには、プロジェクトバイアルを開き、分子力学スタックビューを選択すると、スタック確認のテーブルが表示されます。スタックの確認を視覚化するには、プロットヒストグラムアイコンをクリックします。

最後に、分子力学スタックプレイをクリックして、スタックでムービーを作成し、ここで折り畳みによって明らかになった確認の好みを視覚化します。R 2 フォールディングの結果を示します。確認はアルファヘリカルではなく、特に残基12〜14のフラグメントにおいて、V 3ループクラウンについて予想されるランダムコイルです。

V threeループでは、スタック全体で明確なベータ鎖の確認選好が見られ、アルファヘリカルの確認はほとんど観察されません。局所ベータ鎖の確認は、その延長された線形形状によって認識されます。これは、R two株の珍しいイソロイシンプロリンメチオニン配列の位置であり、この位置にあるHIV株のまれな配列であり、R twoの異常な特徴の原因であると仮定されているものです。

さらに、最も低いエネルギー確認と2番目に低いエネルギー確認との間には、ほぼ3単位のエネルギーギャップが見られます。したがって、この構造は、最低エネルギーの確認が1%未満の時間しかちらつきません。これは、R 2 V 3クラウンとその位置12〜14での局所ベータ株の確認が、本質的に完全に柔軟であるというよりも、より剛性の高い構造を持っていることを示唆しています。ICMソフトウェアに実装されているabioアルゴリズムを使用してV 3ループクラウン配列をフォールディングする方法と、HIVウイルスのR two株を使用して結果を分析する方法を示しました。

例えば、この手順を行う際には、V 3クラウンのフラグメントに対応するフォールディングペプチドの同一性を慎重に選択することが重要であり、分子モデラーの専門家の相談を受けて、確認の好みやエネルギーに関する結果を解釈することも重要です。というわけで、これだけです。ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。