Name: 捕捉アッセイを用いたウイルス様粒子(VLP)ベースワクチンに対する抗原中中和感受性エピトープの検出 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-10T13:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 15 s
Description: 学ぶ ウイルス様粒子(VLP)ベースワクチンの抗原中中和感受性エピトープを検出する捕捉アッセイ。広域中和抗体を用いてVLP品質を評価し、効果的なワクチン開発に貢献する手法です。

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この研究は、ドイツ連邦教育研究省からの助成金、ファチッチシューレンの資金プログラムForschung、契約番号13FH767IA6、13FH242PX6 JSからの助成金によって支えられた。図 1 と 2 は、BioRender.com で作成されました。

1. サンプル準備
<ol><li>293-F発現培地において、ML当たり0.5 x 106細胞の低い細胞密度で、単独でまたはenv 30と一緒にギャグをギャグするHIV構造遺伝子を発現する293-F細胞に由来するVLPプロデューサー懸濁液細胞株をシードする。</li>
	<li>37°Cで3〜4日間、シェーカーインキュベーター回転で8%のCO2 を、毎分5cmと135ラウンド(rpm)の軌道で回転させます。</li>
	<li>ペレットは、5分間100xgで遠心分離することにより、プロデューサ細胞を。透明化した上清をフィルター処理し、フッ化ビニリデン(PVDF)膜シリンジフィルターを使用して残留細胞および細胞デブリを除去し、細胞を含まない細胞培養上清(CFSN)を得ます。 注: プロトコルはここで一時停止することができます。CFSNは、4°Cで一晩保存することができます。</li>
	<li>実験に直接CFSNを使用するか、または超遠心分離(112,700 x g、4°C、1.5時間)を採用したCFSNの35 mLからペレットVLPを使用してください。</li>
	<li>超遠心分離時に、上清を捨て、遠心チューブ当たりのトレハロース溶液15%(w/v)の200 μLでVLPペレットを一時停止します。 注:VLPペレットは、肉眼では見えないことが多いです。プロトコルはここで一時停止することができます。VLPは-80°Cで貯えることができる。</li>
	<li>VLP捕獲アッセイの前に、ELISAを用いて、サンプルを含むVLP中のウイルスコアタンパク質濃度を決定する。このステップは、キャプチャアッセイ入力を標準化するために重要です。</li>
</ol>2. VLPキャプチャアッセイ
注: ワークフローの概要を 図 2 に示します。
<ol><li>50 rpmでピペットを上下にピペットするか、50 rpmで混合して、少なくとも5分間、磁気ビーズを吊り下げます。</li>
	<li>一方、bNAbsを含む抗体溶液を調製する。各bNAbの10μgを、抗体結合および洗浄バッファー( 材料表参照)の200 μLで反応ごとに使用します。 注:抗体量は、使用するVLP上のbNAbおよび抗原装飾密度の親和性に応じて変化する可能性があります。</li>
	<li>反応ごとに50μLの磁気ビーズ溶液( 材料表を参照)を使用し、1.5 mL反応チューブにビーズを移します。チューブを磁気分離ラックに置きます。 注: また、強力な単一の磁石を各チューブに使用して、上清からビーズを分離することもできます。</li>
	<li>ビーズがチューブウォールに集まるまで数分待って、すべてのビーズが収集されるようにします。上清を取り除く。</li>
	<li>磁石を取り外し、ステップ2.2で調製したbNAb溶液の200 μLでビーズを一時停止します。室温で50rpmで回転器に30分間混合してインキュベートする。</li>
	<li>反応管を磁気分離ラックに再度入れ、上清を待って取り外します。</li>
	<li>マグネットからチューブを取り出し、200 μLの抗体結合と洗浄バッファーで再懸濁してビーズを洗浄します。</li>
	<li>ステップ 2.4 を繰り返します。できるだけ多くの洗浄バッファーを取り外します。</li>
	<li>ビーズバインド bNAbs にサンプルを追加します。 注:HIV由来粒子を用いた捕獲アッセイのVLP入力は、反応ごとに少なくとも15ngのウイルスコアタンパク質であるべきである。VLP量は、bNAbの親和性、および使用するVLP上の抗原装飾密度に応じて変化し得る。</li>
	<li>ステップ2.9で追加したサンプル量が1mL以下の場合は、PBSを追加してサンプル量を1mLに調整します。ピペットでビーズを軽く吊り下げます。</li>
	<li>室温で回転器にサンプルとビーズを2.5時間インキュベートします。ビーズが懸濁状態に留まり、インキュベーション中に溶液が十分に混合されていることを確認します。</li>
	<li>磁石の上にチューブを置き、上清を取り除きます。</li>
	<li>磁気ビーズを200 μLの洗浄バッファーに吊り下げ、洗浄します( 材料表を参照)。洗浄工程を3回繰り返します。</li>
	<li>100 μL の洗浄バッファーにビーズを吊り下げ、その懸濁液をクリーン(耐熱)反応管に移します。</li>
	<li>チューブを磁気分離ラック( 材料表を参照)に置き、上清を完全に取り外します。</li>
	<li>ステップ 2.16.1-2.16.2 またはステップ 2.16.3-2.16.5 に従って磁気ビーズから VLP を溶出させることによって、変性された SDS-PAGE サンプルを準備します。<ol>
<li>変性されたSDS-PAGEサンプルを調製するには、20-80 μLのレムリバッファー(p55 Gagアッセイ入力の1ng当たり0.8 μL)でビーズを停止し、95°Cで5分間インキュベートします。</li>
		<li>SDS-PAGEを直接進めるか、サンプルを-20 °Cで保管してください。 注意:レムリバッファーは、2-メルカプトエタノールとドデシル硫酸ナトリウムが含まれています。保護手袋と目の保護を着用してください。皮膚、目、衣服との接触を避ける。蒸気を吸入しないでください。風通しの良い空間、例えば、ヒュームフードで働く。 注: プロトコルはここで一時停止することができます。</li>
		<li>あるいは、非変性溶出工程を行い、保存された天然タンパク質構造を有するVLPを得る。</li>
		<li>25 μL の溶出バッファー(ビーズを頻繁に提供)を磁気ビーズに加え、室温で 2~5 分間インキュベートします。</li>
		<li>ビーズを取り出し、溶出管をきれいなチューブに移します。その後のアッセイに溶出物を使用するか、4°Cで保管してください。 注: プロトコルはここで一時停止することができます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 捕捉されたVLPサンプルの分析
注: キャプチャした VLP の分析については、SDS-PAGE を実行し、その後、ウェスタン ブロット分析 31,32 を実行します。
<ol><li>サンプルチューブを磁気ラックに置き、ビーズを溶液から分離します。</li>
	<li>各サンプル10 μLをゲルの個々のウェルに積み込みます。 注:このプロトコルでは、ウイルスp55 Gagコアタンパク質は、HIV Gagに対して向けられたポリクローナルウサギ抗体と、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)抗体に結合された二次ポリクローナルチキン抗ウサギIgGを採用することによって検出されました。ウイルスコアタンパク質を化学発光検出を用いて可視化した。</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63137/63137fig02.jpg"> 図2:無細胞上清を用いたVLP捕獲アッセイの主要なステップの概略図。 (1) VLP捕獲アッセイは、タンパク質G結合磁気ビーズへのHIV-1 bNAbsの結合から始まります。一方、定義されたp55濃度のVLP溶液が調製される。無細胞培養上清は、p55 Gag VLP、宿主細胞タンパク質、および核酸の混合物からなる。(2)bNAbsとVLP溶液に結合された磁気ビーズは、1.5mL反応チューブに移され、その後回転下でインキュベーションが行われます。(3) 抗原表示 VLP は bNAbs コーティングビーズによって捕捉される。これらの免疫複合体を宿主細胞由来の汚染物質から分離することは、磁場中で行われる。(4)上清をピペットで除去し、 ビーズを3回洗浄して非結合VLPを除去する。(5)次のステップでは、bNAbsでコーティングされた磁気ビーズと捕捉されたVLPからなる免疫複合体にタンパク質ローディングバッファーを還元する。(8)タンパク質サンプルはSDS-PAGEに供される。(9)ウエスタンブロット分析は、ウイルスp55 Gagコアタンパク質を検出するために行われる。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63137/63137fig02large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>

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著者らは、利益相反はないと宣言している。

VLP捕獲アッセイに先立ち、VLPプロデューサー細胞株におけるVLPの形成と標的抗原の発現を評価する。インストゥルメンタル法は、CFSNおよびペレットVLPsの抗原およびウイルスコアタンパク特異的ELISAと同様に、抗原の細胞表面発現のフローサイトメトリック解析である。
VLP捕獲アッセイの重要なステップは、捕獲抗体を用いたビーズのコーティングである - ここでbNAbs - と抗体コーティングビーズによる抗原陽性VLPのその後の捕獲。抗体とのビーズのコーティングに成功した場合、共役免疫グロブリン(Ig)結合タンパク質の選択に依存します。ドナー種と同様に、抗体のIgクラスは、プロテインG-またはプロテインA結合ビーズが好ましいかどうかを決定する。ほとんどの種およびIgクラスでは、プロテインGは選択のリガンド33です。プロテインA/Gコンジュゲートビーズの代替として、ビオチン化抗体をコーティングするためのストレプトアビジンビーズが利用可能です。ビーズは、抗体と共有結合することもできる。
抗体コーティングビーズによるVLPsの捕獲は、完全な混合、十分なインキュベーション時間、抗原の豊富さ、および捕捉抗体の親和性に依存する。我々の経験では、VLPサンプルとの抗体被覆ビーズの完全な混合は、室温または4°Cで少なくとも2時間回転下の1.5mLチューブで>500 μLの体積を利用することによって最もよく達成される。 もう 1 つの潜在的な問題は、サンプル内の VLP の量が少なすぎるという問題です。標的抗原に強く結合する抗体の場合、VLP入力は、通常、ウェスタンブロット分析を利用して、ウイルスコアタンパク質の容易に検出可能な量を可能にする、Gagタンパク質の15ngと低い。しかし、低親和性抗体は、より高い入力量、例えば、Gagタンパク質の100ngを必要とし、決定的な結果を得る(図3、bNAb3)。
いくつかの表面抗原は、プロテアーゼ分解を起こしやすい。ここでは、4°CでVLPサンプルにプロテアーゼ阻害剤を添加し、インキュベーションすることを推奨します。 ビード結合抗体に対する宿主細胞タンパク質およびVLPの非特異的接着はめったに観察されず、モックおよびハゲVLPサンプルおよびアイソタイプ対照抗体を用いてここで示したように、適切な陰性対照を利用して除外されるべきである。非特異的結合を低減する戦略としては、洗浄バッファー34における洗浄工程の延長及びカゼインの添加が挙げられる。さらに、捕捉アッセイは、抗原表示VLP量に対する抗体の最適比を決定することによっても改善され得る。
VLP捕獲アッセイの最後のステップでは、Laemmliバッファーを減らして沸騰させることによりビーズからの免疫複合体の溶出について説明する。このステップの間に、VLPは分解され、捕獲抗体および標的抗原はビーズから分離される。特に、その後のウェスタンブロット分析で使用される一次抗体のドナー種は、二次抗ドナーIgG HRP共役抗体による捕捉抗体の意図しない検出を避けるために、捕捉抗体のドナーと異なっている。
ここで提示されるVLP捕獲アッセイはVLP表面に表示される構造無傷の標的抗原の中和感受性のエピトープを検出する使いやすく敏感な方法を提供する。しかし、捕捉アッセイは直接エピトープ定量を可能にしない。bNAbsで行われるELISAは、この目的のために役立つものであり、特に検査されたVLPが動物モデル35を採用した前臨床試験で使用されることを意図している場合は、並行して行われるべきである。これは、抗原の量が免疫動物における中和抗体応答の引き起こしと直接相関することができるので、ブタチルコウイルス2型(PCV2)ワクチン36に示されるように極めて重要である。
理想的なワクチンは、ビリオン表面上の中和感受性エピトープを標的とするbNAbsの引き起こしをもたらすべきである。これらのエピトープの分析は、特に粒子状ワクチン表面上の完全な構造的完全性を参照することは、潜在的なワクチン候補を特定するために重要である。これはHIV由来VLPの場合だけでなく、開発中の他の多くのVLPワクチンにも当てはまる37です。著名なVLPベースのワクチンは、例えば、ヒトパピローマウイルス(HPV)のような非エンベロープまたはキャプシド親ウイルスに由来する。1つの構造的コアタンパク質、すなわちp55 Gagによって形成され、VLPプロデューサー細胞に由来する膜によって包まれたHIV-1粒子とは異なり、HPV粒子は1つまたは2つの構造的コアタンパク質38,39で構成されています。同様に、そしてここで、エンベロープされたVLPのために提示されるように、VLP捕獲アッセイは、非エンベロープVLPの中和感受性エピトープの検出にも適用可能である。
捕獲アッセイの代替として、VLPサンプルは、天然のPAGEに直接行い、続いて、bNAbsおよびHRP40に結合された適切な二次抗体を使用したウェスタンブロット分析を行うことができる。しかし、HIV Env装飾VLPの分析では、VLP当たりの抗原タンパク質の数が少ないため、このアッセイの感度が低くなります。対照的に、この捕獲アッセイは、3,500個以上のGagタンパク質がVLP27を形成するHIV由来VLPの場合に、VLP当たりの大量に豊富なコアタンパク質の検出を容易にする。これにより、Vlps上の低密度でも表示されるEnvのエピトープの非常に敏感な間接検出が可能になります。
VLPsの表面抗原における中和感受性エピトープを調べる方法は限られている。VLPsに表示される抗原の標識は、エピトープ特異的抗体フルオロフォアコンジュゲートと、ナノ粒子追跡解析(NTA)によるその後の検出により可能であり、VLPの検出と定量化が可能です。この方法は、細胞表面マーカー41を提示するエキソソームについても正常に開発され、最適化されている。また、表面プラズモン共鳴(SPR)分光法により、VLPs上に提示された非共役中和抗体と同結合エピトープとの相互作用を解析することができます。より高いスループット分析には適していないが、VLPは、金粒子とそれに続く透過電子顕微鏡(TEM)検査42に結合されたbNAbsで標識することもできる。
結論として、VLP捕獲アッセイは、いくつかのかなりの利点を提供する:(i)VLPs表面上の中和感受性エピトープの構造的完全性の評価、(ii)VLPs上の低密度で表示された場合でも抗原の敏感かつ間接的な検出、および(iii)この方法はコスト集約的な分析装置を必要としない。

ウイルス様粒子(VLPs)は、ウイルスゲノムを欠いている間にネイティブのウイルス粒子構造に似ており、高い安全性プロファイルを提供します1,2。VLPsは、免疫原性が高いために開発が進まなくなっている個々のクラスのワクチンを表す3,4,5,6,7です。これは特に膜包絡VLPの場合、相同性ウイルス表面抗原だけでなく、腫瘍抗原などの異種抗原の表示も可能にする8,9,10。図1は、包絡された抗原装飾VLPの構造の例示的な概観図を示す。VLPベースのワクチンの開発過程では、VLP表面に表示されるそれぞれの標的抗原の解析を可能にするアッセイが不可欠です。このようなアッセイは、粒子状ワクチンの組成を解明するのに役立つべきである:(i)VLPsはそれぞれの表面抗原で飾られていますか?(ii) 表面抗原は、中和抗体(bNAbs)および(iii)のエピトープ認識によって示されるように、VLP形成を媒介するウイルスタンパク質の検出によりVLPの構造的完全性を確認することができるように、その天然構造を保持していますか?
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63137/63137fig01.jpg"> 図1:膜に包み込んだVLPの模式図。 VLPsは、未熟な前駆体Gagコアタンパク質によって形成され、宿主細胞由来の脂質膜によって囲まれる。抗原は、例えば、エンベロープ糖タンパク質を、脂質膜に取り込まれ、VLPの表面(右側)に表示される。抗原特異的抗体は抗原を認識します。左には、抗原装飾のないハゲVLPが示されている。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63137/63137fig01large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
特にヒト免疫不全ウイルス1型(HIV-1)のウイルス群特異的抗原(Gag)コア前駆体タンパク質p55によって形成されたVLPは、多数の抗体としてワクチン開発における抗原表示用の足場が好ましく、ELISAキットが利用可能であり、これらのVLPs11,12の定量化を可能にする。HIV-1エンベロープ糖タンパク質(Env)、すなわち、膜貫通タンパク質gp41(gp41-TM)および可溶性表面ユニットgp120(gp120-SU)形成ヘテロダイマーは、粒子の膜エンベロープに組み込まれ、HIV感染に対するワクチンの開発に重要な標的抗原である13,14,15.これらの標的抗原における中和感受性エピトープの表示は、ワクチン中で広く中和抗体応答を引き出す前提条件である。Gagタンパク質に対するT細胞応答に加えて、これはHIV感染に対する保護の重要な相関性16と考えられる。その結果、標的抗原候補で装飾されたVLPの設計と製造に際して、表示された抗原の品質のその後の分析は、ワクチン開発の過程における重要なステップを表す。
免疫沈降法(IP)は、タンパク質相互作用の検出およびタンパク質複合体の精製を小さな尺度17で広く使用されている技術です。バレットら1960年にIPの開発について最初に報告されましたが、この方法は常に改善されています。IPは、ビーズに結合して固定化した抗原特異的抗体(ベイト)を用いることで、標的抗原(獲物)を溶液から捕捉し、単離することを可能にする18,19個。このプロトコルでは、膜に包まれるp55 Gag形成VLPを獲物として使用する古典的なIPアプリケーションのバリエーションを実証し、VLPの表面に表示されるエンベロープタンパク質中の中和感受性エピトープを餌タンパク質として認識するbNAbsを挙げることができる。このVLP捕獲アッセイの成功した適用は、試験された抗原陽性VLPがワクチン接種された人々の中和B細胞応答を引き出すことができるかどうかの予測を容易にする。VLPベースのワクチン候補のこのような免疫原性特性は、小動物モデル20,21,22においてしばしば実証される。
新たに開発されたVLPワクチン候補の品質を評価するために、VLP捕捉アッセイが5,23,24に成功した。ただし、公開されるメソッドの数は制限されます。ここで提示されるVLP捕獲アッセイは、哺乳類由来抗体のFc領域に結合するタンパク質G結合ビーズに対するEnv特異的bNAbsの固定化から始まります。選択した抗体の固定化のための典型的なマトリックスはアガロースまたは磁気ビーズである。しかし、磁気ビーズは、高スループットアプリケーション25に有利です。次のステップでは、標的抗原を表示するVLPがbNAbコーティングビーズによって捕捉される。Env陽性VLPと固定化されたbNAbsからなる形成された免疫複合体は、磁石を用いて容易に濃縮される。単離された免疫複合体は、最後のステップで溶出されます。その後、VLPを生化学的に特徴づけることができる。ここでは、p55 Gagウイルスコアタンパク質特異的抗体を用いたウェスタンブロット分析を行い、沈殿した標的Env抗原が中和感受性エピトープを収容しているだけでなく、Gag形成されたVLPにも表示されていることを実証しました。さらに、ウイルスコアGagタンパク質の検出は、GAGタンパク質がVLPのEnvよりも豊富であるため、キャプチャアッセイの感度を高める。HIV-1では、Envタンパク質は1桁または2桁の数値26にのみ存在し、3,500以上のGag分子がparticle27のコアを形成します。
VLPキャプチャアッセイは、タンパク質とタンパク質相互作用の検査のための他の技術と比較して、高価な分析機器にアクセスできない研究所のための代替方法を提供します。例えば、透過型電子顕微鏡分析(TEM)、表面プラズモン共鳴分光法(SPR)、ナノ粒子追跡解析(NTA)はコストを要するコストがかかる。ここで提示される捕獲アッセイはまた、後で捕捉された抗原陽性VLP試料の主観を更なるタンパク質特性化、例えばゲル電気泳動、免疫ブロッティング、電子顕微鏡法、質量分析(MS)をそれぞれ採用することを可能にする。VLP捕捉アッセイ中に標的抗原の天然構造が保存されていることを考えると、ネイティブPAGEおよびそれに続く免疫ブロット法の性能も利用できる。
VLP捕獲アッセイは、中和感受性エピトープを曝露する標的抗原を用いたVLPの装飾を調べるのに使いやすく、敏感な方法であり、将来のワクチン候補としての有用性を表している。

<table><tbody><tr><td>1.5 mL反応チューブ</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>gibco</td><td>70011044</td><td></td></tr><tr><td>4%&ndash;15% Mini-PROTEAN TGX stain-free protein gels</td><td>BioRad</td><td>4568085</td><td></td></tr><tr><td>抗体 (bnAbs)</td><td>Polymun Scientic</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isotype control antibody</td><td>invitrogen (Thermo Fisher Scientific)</td><td>02-7102</td><td></td></tr><tr><td>Chemidoc XRS+ イメージングシステム</td><td>BioRad</td><td>1708265</td><td></td></tr><tr><td>Chicken anti-rabbit IgG HRP-coupled</td><td>Life technologies</td><td>A15987</td><td>1:5000 TBS-T + 2 % (w/v) 粉ミルク</td></tr><tr><td>Dynabeads Protein G 免疫沈降キット</td><td>invitrogen (Thermo Fisher Scientific)</td><td>10007D</td><td>にはバッファーと洗浄液が含まれています</td></tr><tr><td>FreeStyle 293-F 細胞</td><td>invitrogen (Thermo Fisher Scientific)</td><td>R790-07</td><td></td></tr><tr><td>FreeStyle 293 Expression Medium</td><td>invitrogen (Thermo Fisher Scientific)</td><td>12338026</td><td></td></tr><tr><td>ゲルブロッティングペーパー</td><td>Whatman</td><td>GB005</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Carl Roth</td><td>0079</td><td>ブロッティングバッファー</td></tr><tr><td>磁気分離ラック</td><td>New England Biolabs</td><td>S1509S</td><td>for 12 x 1.5 mL or 6 x 1.5 mL tubes メタ</td></tr><tr><td>ノール</td><td>Carl Roth</td><td>4627</td><td>ブロッティングバッファー</td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Tetra Cell 電気泳動システム</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optima XE-90 超遠心分離機</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PageRuler 染色済みタンパク質ラダー</td><td>Thermo Scientific</td><td>26616</td><td></td></tr><tr><td>ポリフッ化ビニリデン (PVDF) シリンジフィルター、0.45 &micro;m</td><td>Carl Roth</td><td>KC89.1</td><td></td></tr><tr><td>粉ミルク</td><td>Carl Roth</td><td>T145</td><td>ブロッキングバッファー</td></tr><tr><td>PVDF transfermembrane, 0.45 & micro;m</td><td>Carl Roth</td><td>T830.1</td><td></td></tr><tr><td>QuickTiter HIV p24 ELISA</td><td>Cell Biolabs</td><td>VPK-108-H</td><td></td></tr><tr><td>ウサギポリクローナル HIV1 p55 + p24 + p17</td><td>abcam</td><td>ab63917</td><td>1:2000 in TBS-T + 2 % (w/v) 粉ミルク</td></tr><tr><td>Rotator</td><td>Heidolph</td><td>REAX2</td><td></td></tr><tr><td>ROTI Load 1 (laemmli buffer)</td><td>Carl Roth</td><td>K929.1</td><td>4x concentrated reducing protein gel loading buffer</td></tr><tr><td>ロチフォア 10x SDS-PAGE</td><td>カール・ロス</td><td>3060</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>カール・ロス</td><td>3957</td><td>TBS-T バッファー</td></tr><tr><td>スーパーシグナル ウェストピコ PLUS 化学発光基板</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td>34579</td><td></td></tr><tr><td>SW28 ローター</td><td>ベックマン・コールター</td><td></td><td></td></tr><tr><td>サーモミキサー</td><td>セルメディア</td><td>ベーシック</td><td></td></tr><tr><td>トランスブロット ターボ</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>トレハロース二水和物</td><td>Carl Roth</td><td>8897.2</td><td></td></tr><tr><td>TRIS</td><td>Carl Roth</td><td>5429</td><td>ブロッティングバッファー</td></tr><tr><td>TRIS 塩酸塩</td><td>Carl Roth</td><td>9090</td><td>TBS-T バッファー</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Carl Roth</td><td>9127</td><td>TBS-T バッファー</td></tr><tr><td>ウルトラクリア遠心チューブ</td><td>ベックマン・コールター</td><td>344058</td><td></td></tr></tbody></table>

捕捉アッセイを用いたウイルス様粒子(vlp)ベースワクチンに対する抗原中中和感受性エピトープの検出

Detection of Neutralization-sensitive Epitopes in Antigens Displayed on Virus-Like Particle (VLP)-Based Vaccines Using a Capture Assay

ウイルス様粒子(VLP)捕捉アッセイは、一般的に抗原表示VLPを精製および単離するために使用される「プルダウンアッセイ」として知られる免疫沈降法であり、表面抗原特異的抗体は結合され、ビーズなどの固体および不溶性マトリックスに固定化される。標的抗原への高い親和性のために、これらの抗体は、VLPsの膜エンベロープに固定された同結合抗原で修飾されたVLPsを捕捉することができる。このプロトコルは、プロテインAまたはG結合磁気ビーズに対する抗原特異的抗体の結合について説明する。我々の研究では、グループ特異的抗原(Gag)ウイルスコア前駆体タンパク質p55GagとHIVのエンベロープ糖タンパク質(Env)を表示することによって形成されたヒト免疫不全ウイルス(HIV)由来のVLPが調べられる。VLPはEnvの中和感受性エピトープに対して広く中和抗体(bNAbs)を利用して捕獲される。ここで概説するVLP捕獲アッセイは、(i)VLPがそれぞれの標的抗原で修飾されていることを実証する敏感で実行しやすい方法を表し、(ii)表面抗原は、アッセイで使用されるbNAbsのエピトープ特異的結合によって示されるように構造的完全性を保持し、(iii)その後のウェスタンロット分析でギャグタンパク質の検出によって明らかにされたVLPの構造的完全性を有する。その結果、免疫沈降に対するbNAbsの利用は、VLPワクチンがワクチン接種されたヒトにおいて中和B細胞応答を引き出すことができるかどうかの予測を促進する。このプロトコルは、VLPベースの潜在的なワクチンを調べるための貴重で簡単な実験的アプローチを他の研究者に提供することを期待しています。

図3 は、それぞれCFSNおよびVLPペレットから最初に捕捉されたVLPの代表的な結果を示し、bNAbsを用いて、その後、ウイルスコアタンパク質を検出するためにウェスタンブロット分析を行った。捕獲アッセイに使用されるビーズは、それぞれ陰性対照として機能するEnv糖タンパク質の中和感受性エピトープおよび同等タイプ抗体の中和感受性エピトープに対して向けられた3つの異なるbNAbsでコーティングされた。アイソタイプ抗体コーティングビーズを使用して、ウェスタンブロット分析を採用したEnv陰性(ハゲVLP)またはEnvディスプレイVLPを含むサンプル中にGagタンパク質を検出できませんでした。これは、ヒト抗体でコーティングされたビーズに対するVLPの非特異的結合がVLP捕捉を媒介していないことを示した。ハゲVLPもbNAbsコーティングビーズに縛られておらず、その結果、ギャグタンパク質は検出できませんでした。対照的に、3つのbNAbsはすべてEnvタンパク質(Env VLPs)を示すVLPを捕捉し、したがって、Gagタンパク質を容易に検出した。 図3に示すように、キャプチャアッセイは、CFSNおよびペレットVLPサンプルにおける標的抗原表示VLPをそれぞれ分析するために利用することができる。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63137/63137fig03.jpg"> 図3:広く中和抗体を用いたp55 Gag形成VLPに表示されるHIV-1エンベロープ糖タンパク質中の中和感受性エピトープの検出。 HIV-1エンベロープ糖タンパク質(Env)内のエピトープを標的とする3つの異なる広く中和抗体(bNAb1、bNAb2、およびbnAb3)を採用したVLP捕捉アッセイを実施した後、ウイルスGagコアタンパク特異的抗体を用いたウエスタンブロット分析の代表的な結果。ヒト血清からプールされたアイソタイプヒト抗体は、陰性対照として機能した。細胞培養上清は、Envタンパク質(Env VLPs)およびハゲVLP(Env-陰性)を有するVLPを産生する懸濁細胞培養物からそれぞれ、ならびにウイルスタンパク質を発現しないナイーブ細胞(mock)から採取した。ハゲVLPプロデューサー細胞培養の上清とmock細胞培養の両方が陰性対照として役立った。上清は、低速遠心分離とその後の濾過を用いて汚染細胞から解放され、分析のために無細胞上清(CFSN)を得た。免疫沈降の際、Gagおよび二次抗ウサギIgG-HRPコンジュゲートに対するポリクローナルウサギ抗体を用いてウェスタンブロット分析を行った。分子量マーカー(MW)から見えるキロダルトン(kDa)の見かけの分子量を左に描いています。矢印は、検出された前駆体タンパク質p55 Gagを示す。(A)各試料について、100ngのGagタンパク質を含むCFSNを捕捉アッセイに適用し、VLPの入力量を標準化した。(B)VLPペレットは、CFSNの超遠心分離により得られた。100 ngのGagタンパク質を含むペレットを、アイソタイプ抗体およびbNAb3を用いて捕捉アッセイに適用した。bNAb 1およびbNAb 2のサンプルには、ギャグの25 ngしか含まれなかった。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63137/63137fig03large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>

ここでは、抗原表示ウイルス様粒子(VLPs)上の中和エピトープを検出するプロトコルを提示する。ヒト免疫不全ウイルス(HIV)由来VLPの免疫沈降は、G結合型磁気ビーズのタンパク質に結合したエンベロープ糖タンパク質特異的モノクローナル抗体を用いて行う。捕獲されたVLPは、その後、SDS-PAGEおよびウイルスコアタンパク質Gag特異的抗体を採用したウェスタンブロット分析を行う。

捕捉アッセイを用いたウイルス様粒子(VLP)ベースワクチンに対する抗原中中和感受性エピトープの検出

The virus-like particle (VLP) capture assay is an immunoprecipitation method, commonly known as a &#39;pull-down assay&#39; used to purify and isolate ...

私の研究室では、ウイルスベクターやウイルス様粒子、VLPベースのワクチンの生産システムを開発しています。VLP捕獲の診断はVLPに表示される標的の抗原の非常に敏感な検出を可能にする。本アッセイでは、中和エピトープに対する広く中和抗体を用いて、VLP表面へのこれらのエピトープの曝露を証明する。中和感受性エピトープを表示するVLPのみがワクチン中中中中和抗体応答を引き出すことができるため、これはワクチン候補にとって重要な品質評価です。まず、上下にピペットを回すか、50 RPMの回転子で少なくとも5分間混合して磁気ビーズを吊り下げます。一方、bNABを含む抗体溶液を調製する。各bNABの10マイクログラムを、反応ごとに抗体結合および洗浄バッファーの200マイクロリットルで使用してください。各反応に対して、50マイクロリットルの磁気ビーズ溶液を1.5ミリリットルの反応チューブに移し、次にチューブを磁気分離ラックに置きます。ビーズがチューブボールに集まるまで待って、すべてのビーズが収集されていることを確認してから、上清を取り除きます。磁石を取り外し、あらかじめ用意したbNAB溶液の200マイクロリットルにビーズを一時停止します。室温で50RPMで回転器に混合しながら30分から3時間インキュベートする。インキュベーション後、反応管を磁気分離ラックに入れ、待って、上清を取り除きます。磁石からチューブを取り出し、200マイクロリットルの抗体結合と洗浄バッファーで再懸濁してビーズを洗浄します。抗体結合および洗浄バッファーで洗浄を繰り返し、終了したらできるだけ多くの洗浄バッファーを除去する。ビーズバインド bNAB にサンプルを追加します。添加したサンプル量が1ミリリットル以下の場合は、PBSを加え、サンプル量を1ミリリットルに調整し、ビーズを軽くピペット処理して再中断します。室温で回転子にサンプルとビーズを2.5時間インキュベートし、ビーズが懸濁したまま、インキュベーション中に溶液が完全に混合されることを保証します。チューブを磁石の上に置き、上清を取り除き、200マイクロリットルの洗浄バッファーに吊り下げ、磁気ビーズを洗浄します。100マイクロリットルの洗浄バッファーにビーズを吊り下げ、その懸濁液をクリーンで耐熱性の高い反応管に移します。チューブを磁気分離ラックに置き、上清を完全に取り外します。変性したSTS-PAGEサンプルを調製するには、20〜80マイクロリットルのレムリバッファーにビーズを一時停止し、摂氏95度で5分間インキュベートします。SDS-PAGE に直接進み、チューブを磁気ラックに置き、ビーズを溶液から分離します。または、サンプルをマイナス20°Cで保存します。BBSを用いて細胞遊離細胞培養上清およびVLPペレットから最初に捕捉されたVLPの代表的な結果を、その後、ウイルスコアタンパク質を検出するためにウェスタンブロット分析を行った結果を、ここに示す。捕獲アッセイに使用されるビーズは、陰性対照として機能するエンベロープ糖タンパク質およびアイソタイプ抗体の中和エピトープに対して向けられた3つの異なるbNABでコーティングされた。同位体抗体被覆ビーズを使用して、ハゲVLP、すなわちEnv陰性VLP、またはEnvディスプレイVLPを含むVLPサンプルではGagタンパク質が検出されず、ヒト抗体でコーティングされたビーズへのVLPの非特異的結合がVLP捕捉を媒介していないことを実証した。ハゲVLPもbNABコーティングビーズに結合しておらず、その結果、西洋ブロット分析ではGagタンパク質は検出できませんでした。対照的に、Env-タンパク質を示す3つのbNASはすべてVLPを捕捉し、Gagタンパク質を容易に検出し、VLPに表示されるEnv-糖タンパク質中の中和エピトープの存在を実証した。これは、回転下で500マイクロリットルを超えるボリュームを使用して最適です。あるいは、キャプチャされたVLPは、非還元条件下で溶出することができます。これにより、免疫電子顕微鏡を用いたVLPの解析、またはネイティブPAGEを用いた表示抗原の調査が可能になります。

detection-neutralization-sensitive-epitopes-antigens-displayed-on

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

ヒトパピローマウイルスなどの局所感染を引き起こす病原体のT細胞エピトープを特性解析することは、血中に存在するT細胞数が限られているため困難です。本手法では、ごく少数の細胞から希少なT細胞を単離し、その特性を解析する方法について説明します。...

ヒトパピローマウイルスの新規T細胞エピトープを特徴付けるために、インターフェロン-γ酵素結合Immunospotアッセイの使用

このビデオでは、サンプルから抗原を表示するウイルス様粒子(VLP)を単離する、VLPキャプチャーアッセイと呼ばれる免疫沈降アッセイのデモを行います。この抗原は、磁気ビーズに結合した特異的抗体と結合し、固定化された抗原-抗体複合体を形成し、後で分離してさらなる分析のために保存します。...

ウイルス様粒子捕捉アッセイ:中和抗体標識磁気ビーズを用いて試料から抗原表示VLPを単離する方法

このビデオでは、インフルエンザA型ウイルスとB型ウイルスの抗原関係を解析するためのイメージングベースのマイクロ中和アッセイを実演しています。これは、ウイルス感染の予防における抗体やその他の治療法の有効性を評価するための定量的かつ視覚的な方法を提供します。...

画像ベースのマイクロニュートラル化アッセイを用いたウイルス間の抗原関係の解析

ここでは、バキュロウイルスまたは哺乳動物発現系、および超遠心分離精製のいずれかを使用してウイルス様粒子を合成するためのプロトコルを提示します。この高度にカスタマイズ可能なアプローチは、安全かつ柔軟な方法で、ワクチン標的としてウイルス抗原を同定するために使用されます。...

ワクチン接種のための発現およびウイルス様粒子の精製

この研究は説明します ウイルス間の抗原性の関係を分析するための画像化ベースのマイクロ中和アッセイ。プロトコルは、フラットベッドスキャナを使用し、滴定、滴定の定量、中和、及び中和定量を含む4つのステップがあります。アッセイは、現在の循環インフルエンザA（H1N1）pdm09、A（H3N2）、およびB型ウイルスでうまく動作します。...

定量的マイクロ中和アッセイの最適化

ここでは、著者らは、精製されたモノクローナル抗体とドットブロットハイブリダイゼーションによるペプチドスキャンを使用して、線状抗原エピトープを定義するためのシンプルで効率的なプロトコルを提示します。同定されたエピトープは、その後、治療および診断アプリケーションに使用できます。...

モノクローナル抗体認識リニアB細胞エピトープのペプチドスキャンアシスト識別

ここで説明するプロトコルは、スパイク糖タンパク質に擬似的に結合した強化された緑色蛍光タンパク質標識付き小胞性口内炎ウイルスによる感染を阻害する回復血清サンプルの能力を評価することによって、SARS-CoV-2スパイクタンパク質に対する中和抗体を測定するための迅速かつ効果的な方法を概説する。...

疑似ウイルス感染のハイスループット蛍光イメージングを用いたSARS-CoV-2中和抗体の検出

AAV6に対する中和元素を検出するための、迅速で費用対効果が高く、簡単な比色細胞ベースのアッセイについて、包括的なラボプロトコルと分析ワークフローが説明されています。...

比色細胞ベースのアッセイを用いてAAVに対する中和抗体を検出するためのステップバイステップ法

偽型ウイルス(PV)は、複製欠損のあるウイルス粒子であり、本物のウイルスを扱うよりも安全な条件下で宿主とウイルスの相互作用を研究するために使用されます。ここでは、SARS-CoV-2...

中和アッセイを介してSARS-CoV-2に対する体液性免疫応答を監視するための分子ツールとしての偽型ウイルス

ここでは、デュアルレポーターフローサイトメトリーシステムを使用して、アンジオテンシン変換酵素-2結合磁気マイクロスフェアによって捕捉された無傷の重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2(SARS-CoV-2)ウイルス粒子上の2つのユニークなスパイクタンパク質エピトープを同時に検出する、新たに開発されたマルチプレックス蛍光免疫測定法について説明します。...

マルチプレックスデュアルレポーター法によるウイルス粒子上の表面タンパク質エピトープのプロファイリング

非細胞病理性陽性鎖RNAウイルスであるHepatitis...

中和抗体価測定のための肝炎Eウイルス蛍光減少中和検査

学ぶ ウイルス様粒子(VLP)ベースワクチンの抗原中中和感受性エピトープを検出する捕捉アッセイ。広域中和抗体を用いてVLP品質を評価し、効果的なワクチン開発に貢献する手法です。

捕捉アッセイを用いたウイルス様粒子(VLP)ベースワクチンに対する抗原中中和感受性エピトープの検出

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