捕捉アッセイを用いたウイルス様粒子(VLP)ベースワクチンに対する抗原中中和感受性エピトープの検出

ここでは、抗原表示ウイルス様粒子(VLPs)上の中和エピトープを検出するプロトコルを提示する。ヒト免疫不全ウイルス(HIV)由来VLPの免疫沈降は、G結合型磁気ビーズのタンパク質に結合したエンベロープ糖タンパク質特異的モノクローナル抗体を用いて行う。捕獲されたVLPは、その後、SDS-PAGEおよびウイルスコアタンパク質Gag特異的抗体を採用したウェスタンブロット分析を行う。

私の研究室では、ウイルスベクターやウイルス様粒子、VLPベースのワクチンの生産システムを開発しています。VLP捕獲の診断はVLPに表示される標的の抗原の非常に敏感な検出を可能にする。本アッセイでは、中和エピトープに対する広く中和抗体を用いて、VLP表面へのこれらのエピトープの曝露を証明する。

中和感受性エピトープを表示するVLPのみがワクチン中中中中和抗体応答を引き出すことができるため、これはワクチン候補にとって重要な品質評価です。まず、上下にピペットを回すか、50 RPMの回転子で少なくとも5分間混合して磁気ビーズを吊り下げます。一方、bNABを含む抗体溶液を調製する。

各bNABの10マイクログラムを、反応ごとに抗体結合および洗浄バッファーの200マイクロリットルで使用してください。各反応に対して、50マイクロリットルの磁気ビーズ溶液を1.5ミリリットルの反応チューブに移し、次にチューブを磁気分離ラックに置きます。ビーズがチューブボールに集まるまで待って、すべてのビーズが収集されていることを確認してから、上清を取り除きます。

磁石を取り外し、あらかじめ用意したbNAB溶液の200マイクロリットルにビーズを一時停止します。室温で50RPMで回転器に混合しながら30分から3時間インキュベートする。インキュベーション後、反応管を磁気分離ラックに入れ、待って、上清を取り除きます。

磁石からチューブを取り出し、200マイクロリットルの抗体結合と洗浄バッファーで再懸濁してビーズを洗浄します。抗体結合および洗浄バッファーで洗浄を繰り返し、終了したらできるだけ多くの洗浄バッファーを除去する。ビーズバインド bNAB にサンプルを追加します。

添加したサンプル量が1ミリリットル以下の場合は、PBSを加え、サンプル量を1ミリリットルに調整し、ビーズを軽くピペット処理して再中断します。室温で回転子にサンプルとビーズを2.5時間インキュベートし、ビーズが懸濁したまま、インキュベーション中に溶液が完全に混合されることを保証します。チューブを磁石の上に置き、上清を取り除き、200マイクロリットルの洗浄バッファーに吊り下げ、磁気ビーズを洗浄します。

100マイクロリットルの洗浄バッファーにビーズを吊り下げ、その懸濁液をクリーンで耐熱性の高い反応管に移します。チューブを磁気分離ラックに置き、上清を完全に取り外します。変性したSTS-PAGEサンプルを調製するには、20〜80マイクロリットルのレムリバッファーにビーズを一時停止し、摂氏95度で5分間インキュベートします。

SDS-PAGE に直接進み、チューブを磁気ラックに置き、ビーズを溶液から分離します。または、サンプルをマイナス20°Cで保存します。BBSを用いて細胞遊離細胞培養上清およびVLPペレットから最初に捕捉されたVLPの代表的な結果を、その後、ウイルスコアタンパク質を検出するためにウェスタンブロット分析を行った結果を、ここに示す。

捕獲アッセイに使用されるビーズは、陰性対照として機能するエンベロープ糖タンパク質およびアイソタイプ抗体の中和エピトープに対して向けられた3つの異なるbNABでコーティングされた。同位体抗体被覆ビーズを使用して、ハゲVLP、すなわちEnv陰性VLP、またはEnvディスプレイVLPを含むVLPサンプルではGagタンパク質が検出されず、ヒト抗体でコーティングされたビーズへのVLPの非特異的結合がVLP捕捉を媒介していないことを実証した。ハゲVLPもbNABコーティングビーズに結合しておらず、その結果、西洋ブロット分析ではGagタンパク質は検出できませんでした。

対照的に、Env-タンパク質を示す3つのbNASはすべてVLPを捕捉し、Gagタンパク質を容易に検出し、VLPに表示されるEnv-糖タンパク質中の中和エピトープの存在を実証した。これは、回転下で500マイクロリットルを超えるボリュームを使用して最適です。

あるいは、キャプチャされたVLPは、非還元条件下で溶出することができます。これにより、免疫電子顕微鏡を用いたVLPの解析、またはネイティブPAGEを用いた表示抗原の調査が可能になります。