サブクローニングプラス挿入（SPI） - ジーンターゲティングベクターの迅速な構築のための新しい遺伝子改変方法

次の実験の全体的な目標は、サブクローニングと挿入を使用して遺伝子標的ベクターを構築することです。これは、大腸菌を含む背部を再結合プラスミドで形質転換することによって達成されます。第2ステップでは、不斉ホスホロール化挿入カセットを作製し、ポリメラーゼ連鎖反応によりプラスミドをサブクローニングします。

アラビノースの添加後、GBAA組換えタンパク質が発現し、末端修飾挿入カセットとサブクローニングプラスミドがエレクトロポレーションされます。目的のDNA配列をバックから同時にキャプティブし、挿入カセットでサブクローニングプラスミドに修飾します。標準的な組換えのような既存の方法のこの技術の主な利点は、遺伝子ターゲティングベクターの構築を単一の反応で実行できることです。

まず、挿入カセットおよびサブクローニングプラスミドのオリゴを設計し、各オリゴがゲノム標的部位に隣接する180塩基対の相同性アームと、挿入カセットまたはサブクローニングプラスミドの特異的プライミング配列である20塩基対を含むように設計します。次に、clone dbのようなウェブベースのツールを使用して、バッククローンのゲノムDNAインサートの向きを決定します。バックからまたはESのレプリケーションの方向を確立するには、バックで使用されたバックプラスミドバックボーンのマップを確認します。

ライブラリー構築は、末端のリン酸化8結合を2つ追加し、クローンの裏側に複製の方向と反対のオリゴの5つのプライムエンドを追加します。次に、リバースオリゴに5プライムリン酸修飾を添加します。まず、滅菌ピペットチップを背面の寒天培地に刺し、5.0ミリリットルのオディンブロスを接種します。

200RPMで振とうしながら、摂氏37度で5時間培養します。次に、冷却、10%グリセロール溶液、マイクロ遠心分離機、チューブとエレクトロポレーション、氷の上のキュベット、冷蔵大型遠心分離機、マイクロ遠心分離機を摂氏4度に冷却します。インキュベーション後、分光光度計を使用して培養物の光学密度を決定します。

吸光度の測定。600ナノメートルで。OD 600の読み取り値が0.3〜0.8に達したら、エレクトロコンピテントセルを準備します。

培養の準備ができたら、50ミリリットルの遠心分離チューブで細胞をスピンダウンします。冷やした10%グリセロール1ミリリットルで細胞を洗浄し、再度紡糸します。これらの洗浄手順を合計3回実行します。

細胞を総容量50マイクロリットルに再懸濁し、10〜200ナノグラムの再結合プラスミドを添加します。ピペッティングを数回上下させて単一細胞懸濁液を取得し、細胞をプレチルエレクトロポレーションに移します。獣医。次に、veteをエレクトロポレーション装置に入れ、細胞を電気操作し、すぐに1ミリリットルのLBで細胞を回収し、細胞を50ミリリットルの遠心分離管に移します。

バックカルチャーを摂氏30度で2時間、200RPMで振とうしながら育てます。この時間の後、回収した培養物に9ミリリットルのLBを追加します。200 RPMで振とうしながら摂氏30度で一晩増殖し、ホモロジーアームを挿入カセットとsubcクローニングプラスミドに組み込みます。

先に調製した長鎖修飾オリゴを用いてPCRを行います。あるいは、制限酵素を使用してプラスミドテンプレートを直鎖化し、PCR増幅領域の外側に切断され、熱で活性化されるものを選択します。ハイフィデリティホットスタートのDNAポリメラーゼシステムを使用してPCRをセットアップします。

PCRマスターミックスを調製し、ベストプラクティスに従ってサーマルサイクリングを行います。反応後、AROSゲル電気泳動によりPCR産物を解析します。各PCRの1〜5マイクロリットルを1%arosゲルにロードします。

次に、PCR精製キットを使用してPCR産物を精製します。PCR増幅されたDNAを既知のDNA標準セットに対して、またはNanoDrop分光光度計を使用して定量します。一晩インキュベーションした後、バックGBAA培養物を50倍に希釈し、ネガティブコントロール用に別の培養物を調製します。

希釈した培養物を摂氏30度で200RPMで振とうしながら1時間50分成長させます。次に、前に示したように、すべての再結合材料と機器を摂氏4度に冷却します。OSEの10%重量/体積溶液を調製し、0.2ミクロンのシリンジフィルターで滅菌をろ過します。

バックカルチャーのODが所望のレベルに達したら、組換えタンパク質の誘導を進めます。10%アラブ溶液の200マイクロリットルをバックカルチャーの10ミリリットルに加えて、0.2%の最終的なaose濃度を達成するネガティブコントロールとして使用するために、非誘導培養物を含める。培養物を摂氏37度の振盪インキュベーターに移し、230 RPMで振とうしながら45分間赤の発現を誘導します。

細胞をスピンダウンし、10%グリセロールで前述したように600〜1000ナノグラムで3回洗浄します。リコンフィデンシング反応への挿入カセットとサブクローニングプラスミドのそれぞれには、ベクターのみとベクターとシングルインサートコントロールが含まれており、ベクターのリコンビネーションの習熟度と完全性をチェックします。次に、単一セル懸濁液を取得し、前に示したようにセルを電気操作します。

LB培地を37°Cでマルチコピープラスミドの場合は1時間、バックベクターの場合は10 lbで37°Cで3時間回収します。回収した培養物で異なる希釈を二重選択で完了します。寒天をして、摂氏37度で16時間育ててください。

準備ができたら、選択的抗生物質を含む5ミリリットルのLBにコロニーを選び、摂氏37度で一晩成長させます。次に、カラム精製キットを使用してミニプレップDNAを調製し、適切な制限酵素を導入してから、ゲル電気泳動により予想されるフラグメントサイズを含むクローンを同定します。最後に、相同性アームと挿入カセット全体でDNAシーケンシングを行い、光合成エラーを確認します。

この例では、クローンを含む P two RX one EYFP インサートの制限酵素処理解析により、正しくアセンブルされたノックインベクターが含まれていることを示す期待されるパターンが示されました。この回路図は、バクトトリミングの概念を示しています。サブクローニングとPCR産物の挿入分析を行ったところ、カセットが正しく取り込まれていることが確認されました。

また、適切な制限酵素を添加してポジティブバッククローンを解析したところ、期待通りのパターンが得られました。12の制限酵素消化解析では、R SRの2つのSBIクローンは、大部分の組換え体で正しいベクターアセンブリを示しました。このビデオを見れば、サブクローニングと挿入を使用して遺伝子ターゲティングベクターを迅速に構築する方法を十分に理解できるはずです。