Name: サブクローニングプラス挿入（SPI） - ジーンターゲティングベクターの迅速な構築のための新しい遺伝子改変方法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 2 s
Description: 学ぶ サブクローニングプラス挿入法による遺伝子ターゲティングベクターの迅速構築。E. coliを用いた単一反応で効率的にカスタムベクターを生成し、トランスジェニックモデル開発を加速する革新的な分子生物学技術です。

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T.R.R.はプロジェクトを考案し、実験を設計し、実施し、原稿を準備しました。E.J.K.とS.E.Mが実験を行いました。すべての著者は、最終的な原稿に知的に貢献しました。この研究は、レスター大学のSEMイノベーションフェローシップと、英国医学研究評議会(MRC)のS.M.C.シニアリサーチフェローシップ(MR/J009202/1)によって資金提供されました。DNAシーケンシングは、レスター大学のコアバイオテクノロジーサービスセンターのタンパク質および核酸研究所(PNACL)によって行われました。RoxおよびDreプラスミドを提供してくださったA.Francis Stewartに感謝いたします。pL451およびpL452プラスミドは、米国フレデリックの国立がん研究所(NCI)から入手しました。

デザインをターゲット1.ジーン<ol style="margin-left: 40px;"><li>興味のあるゲノム領域をカバーする適切なBACクローンを注文。これは、ES細胞などを修正する、RPCI-23およびC57BL / 6 ES細胞を用いて遺伝子ターゲティングのためのRPCI-24 BACクローンのタイプに同質遺伝子であることを確認してください。 </li><li>ターゲティングベクターを設計する際の基準を対象に従来の遺伝子を適用します。主なパラメータは、変更がイントロンカセットの遺伝子ノックアウト戦略との間隔と配置に削除のための重要なエクソン（CE）を定義する、構成的または条件付きであることが要求されているかどうかが含まれる。 注：これらの各々は、他の場所10で詳細に論じられている。 </li><li>ターゲット修飾部位に隣接する5〜6キロバイトの各ゲノム領域を選択してください。 注：上限等をp15A、pBR322のようなプラスミドをサブクローニング低コピーと80キロバイトとBACと、最大200キロバイトの高さであり得るが、サブクローン挿入物の大きさは、通常、そのため10〜12キロバイトですベクトル。 </li></ol> 2.マルチプレックス遺伝子改変オリゴ<ol style="margin-left: 40px;"><li>プラスミド骨格（サブクローニングプラスミド）および選択マーカー（挿入カセット）の設計上のオリゴ。それは180 bpのHA隣接するゲノム標的部位と挿入カセットまたはサブクローニングプラスミド（ 図2）の具体的なプライミング配列の20塩基対を含むように各オリゴを設計します。 注：相同アームは、任意の反復要素を含むべきではない、反復的な要素の存在が間違っターゲティングおよびサブクローニングになります。反復要素 &#39;は、&#39;リピートマスカー」などのウェブベースのツールを使用して検出することができる。 </li><li> （ 図2）を標的ES細胞のための遺伝子ターゲッティングベクターを線形化するベクトルオリゴの1にユニークな制限酵素（RE）サイトもあります。 </li><li>オリゴアナライザプログラムを使用して、オリゴパラメータを確認してください。プライミング領域での二次構造を避けるように注意してくださいS。 </li><li>挿入カセットの短いHA（50 bp）が許容され、組換え体の下側の数を出したが、サブクローニングプラスミドHAが長い（180 bp）を常にであることを保証されている。 </li><li> &#39;&#39; cloneDB &#39;&#39;のようなウェブベースのツールを使用して、特定のBACクローンのゲノムDNAインサートの向きを決定します。 BACライブラリーの構築に使用されるBACプラスミドバックボーンのマップをチェックして、オリスからのレプリケーションの方向を確立します。 注：オリスは、すべての一般的に使用されるBACプラスミドのためのクロラムフェニコール（クロロフィル）マーカーの転写方向とは、通常は反対である。 </li><li> BACクローンのレプリケーションの方向と反対であるオリゴの5 &#39;末端に二つの末端ホスホロチオエート（PTO）結合を追加する。リバースオリゴ（ 図2）に5 &#39;リン酸修飾を追加します。 メモ：Red消化の際に非対称ホスホロチオエートPCRカセットは、その缶プライムラギング鎖のssDNA中間生成複製フォークの。 注：最大多重組換え頻度は、ラギング鎖保護されたカセットを用いて観察される。リーディング鎖は、保護またはデュアル保護されたカセットは、いくつかの遺伝子座で同等の再結合効率を得られないことがあります。 </li><li>ページまたはHPLC精製とオリゴを注文。 </li></ol>はpSC101 BADgbaA遺伝子改変プラスミド3. BACクローン変換。 <ol style="margin-left: 40px;"><li> E.を作成するには熟練したBACのコンビを有する大腸菌株は、赤遺伝子16を含むBADgbaAはpSC101プラスミドとそれを変換する。 注：はpSC101 BADgbaAプラスミドはアラビノース誘導のaraC-P BADプロモーター、テトラサイクリン選択マーカーおよび温度感受性はpSC101レプリコンの制御下に赤とのRecA遺伝子が含まれています。 <ol><li> BAC寒天培養におけるスタブの滅菌ピペットチップおよび12.5を含有するLB培地（LB）pH8.0で5.0mlの接種56; G ml -1のクロロフィル。 200rpmで振盪し、5時間37℃で成長する。 </li><li>氷上で10％（v / v） のグリセロール溶液、マイクロチューブ、エレクトロポレーションキュベットを冷却する。 4℃の冷蔵大型遠心機およびマイクロ遠心クール。 </li><li>分光光度計を使用して培養物の光学密度（OD）を決定し、600nmで吸光度を測定する。 0.3〜0.8のOD 600読み取りに達したとき（後述）エレクトロコンピテント細胞を調製する。 </li><li> 4℃で5分間、1216×gで大きな遠心分離機で50mlの遠心チューブに細胞をスピンダウンする。 </li><li>チルド10％グリセロール1mlで細胞を洗浄し、4℃で20秒間17949×gで細胞をスピンダウン。洗浄工程を3回の合計を実行します。 </li><li> 10％グリセロールの全量50μlで細胞を再懸濁し、はpSC101 BADgbaAのコンビプラスミドの10-200 ngのを追加します。ピペッティングにより単一細胞懸濁液を得数回上下した後、予備冷却1ミリメートルギャップエレクトロポレーションキュベットに細胞を移す。 </li><li> 1.8 KV、25μFと200Ωの設定で細胞をエレクトロポレーション。 注：エレクトロの各ブランドの正しい設定を確認してください。エレクトロポレーションの時定数は、4未満の塩および他の不純物の存在を示している。 </li><li>直ちにLB 1mlの細胞を回収し、50 ml遠心チューブに細胞を移す。 </li><li> 200 rpmで振とう2時間、30℃でBAC gbaA文化を育てる。 注：細胞は、温度感受性REPEの複製因子の不活性化を37℃で増殖させた場合はpSC101 BADgbaAプラスミドが失われた。コンビ機能を維持するために30℃でgbaA細胞を増殖。 </li><li>回収されたBAC gbaA培養液に12.5μgのml -1のクロロフィルを含むLBの9ミリリットルと4μgのmlの-1テトラサイクリン（テト）を追加します。成長する30でのBAC gbaA文化O / N &#160; ℃、200 rpmで振とう。 注：スーパーコイルgbaAプラスミドをエレクトロポレーションの形質転換効率は、液体培地中で飽和成長O / Nを可能にするのに十分に高い。 </li></ol></li></ol>挿入カセットおよびサブクローニングプラスミドの4準備<ol style="margin-left: 40px;"><li>以下に説明するように、挿入カセット（複数可）およびサブクローニングプラスミドにHAを組み込むことが、長い修飾オリゴを用いたポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を行う。 <ol><li>オプション：コンビ反応へのプラスミドのキャリーオーバーを防止するために、挿入カセットを増幅するためにR6K起源または類似の狭い宿主域プラスミドテンプレートを使用します。 </li><li>代替的に、RE消化物（ 表2）を用いてプラスミド鋳型を線形。 PCR増幅領域の外側にカットして、熱不活性化されるREを選択してください。 MANUFにより推奨されるように熱がREを不活性化acturer。 </li><li>忠実度の高いホットスタートDNAポリメラーゼ系を用いたポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を設定する。 （ 表3）に詳述するようにPCRマスターミックスを調製する。 （ 表3）に示すように、熱サイクルを実行します。 </li></ol></li><li>アガロースゲル電気泳動によってPCR産物を分析する。 0.5mgのml -1の臭化エチジウム（EtBrを）を含む1％（w / v）アガロースゲル上に、各PCRの負荷1-5μlの。 NOTE：非特異的増幅産物の存在は、リコンビ反応に干渉しない。しかし、いくつかの場合において、プライマーダイマーはコンビ効率を減少させることができる。 </li><li> PCR精製キットを用いてPCR産物を精製する。 <ol><li>オプション：PCRクリーンアップに続いてDpnIで処理することにより、PCRのからプラスミドテンプレートを削除。 （製造業者によって推奨されるように）滅菌脱イオン水の最小量のDNAを溶出する。 注：のDpnIを添加すると、目の切断の効率の低下にPCR反応の結果を未精製のためメチル化プラスミドDNA鋳型を電子。 </li></ol></li><li> DNA標準、例えば 、λのHindIII消化物の既知のセットに対して、またはナノドロップ分光光度計を用いて、アガロースゲル分析によってPCR増幅されたDNAを定量化する。 </li></ol> 5.サブクローニングプラスの挿入<ol style="margin-left: 40px;"><li> 10mlのLB +クロロフィル+テトに200μlのを追加することによって、O / N BAC gbaA文化50倍に希釈する。 30で成長する&#160; ℃で1時間50分間200rpmで振盪。ネガティブコントロールとして使用されるべきサンプルを含む。 </li><li>ステップ3.1.2で説明したように4℃にすべてのリコンビの資機材を冷やす。 </li><li> LB寒天のpHをサブクローニングベクター（ 表4）を選択するための、ならびに挿入されたDNA断片の選択を可能にする適切な選択的抗生物質（単数または複数）の正確な濃度を含む8のプレートを注ぐ。 注：一部の抗生物質は、pH感受性である。 LBを使用してくださいルールとして寒天のpH 8。 </li><li> L-アラビノースの10％（w / v）の溶液を調製する。 0.2μmのシリンジフィルターに通して滅菌フィルター。 NOTE：アラビノースgbaAプラスミドからコンビタンパク質の発現を誘導する。 </li><li>分光光度計を用いてBAC gbaA文化のODを確認してください。 0.25〜0.3のOD 600に到達すると、次のステップで説明するように、リコンビニアリングタンパク質を誘導する。 </li><li> 0.2％のアラビノースの最終濃度を達成するためにBAC培養液10mlに10％のアラビノース溶液200μlを加える。 （アラビノースを含まない）非誘導培養物が含まれるが、陰性対照として使用する。 </li><li> 37にBAC文化を転送&#160; C振盪インキュベーター°、230 rpmで振とう45分間レッド発現を誘導する。 注：赤のタンパク質の発現は、30℃において非効率的である。 </li><li>細胞をスピンダウンし、ステップ3.1.5で説明したように、10％グリセロールで3回洗浄する。 </li><li> 、600-1追加000コンビ反応にサブクローニングプラスミドおよび挿入カセット（複数）の各々ngの。ベクター及びカセットの再結合能力との整合性をチェックするための唯一のベクトルとベクトルプラス単一のINSERTコントロールを含めます。 </li><li>上下にピペッティングすることによって単一細胞懸濁液を得た。 BACベクターの3時間37℃で、多コピープラスミドまたはLB 10ml中で1時間、37℃で1 mlのLB中にステップ3.1.7およびその後の回復に記載のようにエレクトロポレーションを行う。 </li><li>デュアル選択寒天プレート上で回収した培養プレートの異なる希釈例えば、90％、10％、1％及び37で成長&#160; 16時間のC°。 </li></ol>組換え体の6.分析<ol style="margin-left: 40px;"><li>オプション：6から12個のコロニーを選び、HAフランキングプライマーとインサート特異的プライマーを用いたコロニーPCRを行う。サブクローニングプラスミドと挿入CASを含めるセッテプラスミドだけでなく、ネガティブコントロールとして、親BACクローン。 <ol><li>コロニーPCRのアガロースゲル分析を実行します。予想されたサイズの明るいバンドの存在により陽性クローンを特定します。 注：SPIクローニングプロセスの高効率化は、主に正しい組換え体を生成します。 </li></ol></li><li>選択的な抗生物質を含む5 mlのLBのpHを8にコロニーをピックアップし、37℃でO / Nを育てる。 </li><li>製造業者の指示に従ってカラム精製キットを用いてDNAミニプレップを準備します。 </li><li>標準的なフェノール - クロロホルム離または類似のプロトコルを使用してBACミニプレップDNAを準備します。 </li><li>ミニプレップDNA上REダイジェストを実行します。アガロースゲル電気泳動によって別々のDNA。正確なターゲティングベクターの期待断片サイズを有するクローンを同定するためにREパターンを分析。はっきり挿入欠けているベクトル（S）とインサート（複数可）を含有するベクターを区別するREを選択してください。 </li><li>オプティオナル：E.依然として存在しているBAC、を欠いている細胞を得るためにコンビ後コリ DH5アルファまたはDH10B 大腸菌を形質転換し、ミニプレッププラスミドDNAを使用してcoli細胞 。 </li><li>オリゴ合成のエラーをチェックするために、HAと挿入カセット間でDNA配列決定を行います。 </li></ol>

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</ol>

T.R.R.は、マルチプレックス組換え技術に関する英国特許出願の発明者です。

ES細胞株およびマウスモデルの構築は、歴史的に修飾された対立遺伝子4を含むプラスミド構築物を用いて標的化遺伝子を含んでいた。しかし、これらの複雑な遺伝子ターゲティングベクターの構築は、このようなモデルのタイムリーな生産の大幅なボトルネックであることが判明した。コンビ基づくベクター構築戦略の開発は、改良されたベクターの設計と、より効率的なベクターの組み立てを可能にした。それにもかかわらず、現在のコンビニアリングプロトコルはまだ、複数のステップを伴う中間プラスミド精製を必要とし、別の細菌の菌株を使用しています。プラスの挿入をサブクローニングすることは常駐BAC宿主株で1エレクトロポレーションイベントで実行することができるベクターの構築への新しいアプローチを提供しています。遺伝子ターゲティングにおけるSPIの有用性は、ベクター構築のさまざまなアプリケーションで、ここで試験した。ここで調べたすべての場合において、SPIは、効率的であることが証明され、正しい組み換えプラスミドを作製した。多くの場合、複数の異なるカセットを正しくターゲティングベクターに挿入した。大きなDNAカセットおよびベクターを容易SPIプロトコルに収容し、このシステムの柔軟性を実証した。 SPIは、直鎖DNAカセットの長い相同性配列、およびホスホロチオエート（PTO）保護の使用に依存している。 PTO修飾は、線形DNA 20,21にエキソヌクレアーゼに対する保護を与え、長いHAの多重化を可能にするために再結合効率を増加させる。しかし、より長いオリゴ配列の合成は、エラーを特に欠失を蓄積する可能性を増大させる。それらはタンパク質コード領域をカバーしている場合、オリゴ中の変異は、特に有害である。 DNAのHA全体のシーケンシングおよび挿入されたカセットの全長をカバーするには非常にすべての配列変化を有するクローンを排除することをお勧めします。高忠実度DNAポリメラーゼシステムの使用はまた、導入を回避することが提案されているY PCRエラー。サブクローニングプラスミドのHAの長さおよび組成は、挿入カセット（データは示していない）のものと比較してより重要である。エクソン領域内の任意の変異が許容されていないノックインベクターの構築などの特に敏感なアプリケーションでは、挿入カセットのHAは、長いオリゴに伴う問題を回避するために、（50〜120 bp）を短縮することができる。 （複製の方向の知識が利用できない場合）、挿入カセットはまた、ホスホロチオエート修飾されていないまたはデュアル残すことができる。しかし、これらの場合の多重化はまだ長いHAサブクローニングプラスミドが保護された必要があります。この特定の戦略の注意点は、潜在的に異なる遺伝子座でのSPIクローニングに影響を与える可能性が多重化効率の低下である。 挿入カセットおよびサブクローニングプラスミドの長さは、SPIクローニングにおける別の重要なパラメータである。より大きなDNA分子が少なく効率的にエレクトロポレーションおよび効果は、再指定された、累積され同じセル内のすべてのカセットを導入するquirement（データは示さず）。多重化は、より小さな挿入カセットと最も効率的です。 DNAは3キロバイト30までの最も効率的であるのssDNA処理を、仲介3キロバイトより大きく、また赤に制限を置く断片化します。 3キロバイトを超える挿入カセットを切除デュアルであり、ベータ独立した経路20を介して、より少ない効率的に再結合する。したがって、正しいクローンを同定するのに十分なコロニーのスクリーニングは、これらの場合に重要になる。組み換えポストエレクトロポレーションの長い持続時間も難しいのSPI演習で正しいクローンの回復の可能性が高くなります。四つの小カセット（&lt;1.5キロバイト）多重化効率は、各追加のカセットと共に減少するものの、SPI処理と同時に挿入することができるまで（データは示さず）。しかしながら、これは最適なSPIの実験の結果を反映し、多くの大規模なカセットを使用する場合には、多重化の限界を考慮することが望ましい。 </P&gt; クラスタ化された定期的にinterspaced短い回文反復（CRISPR）のようなゲノム編集ツール-cas9エンドヌクレアーゼシステムの開発は、新規ゲノム修飾の作成 ​​を可能にした、より効率的なゲノム工学36につながっている。しかし、これらの新しい技術は、遺伝子ターゲッティングベクターを補完するのではなく、それらに取って代わっている。これは、CRISPR-casのシステムは、抗生物質選択を交換し、さらに多重コンビプロトコルを絞り込むことが想定される。

遺伝子ターゲティング技術の開発は、異なる生物学的システム1-3を調査するために、細胞株およびマウスモデルの構築を可能にした。ゲノム配列の修飾において重要第一段階は、ベクトル4遺伝子ターゲティングの設計および構築である。ターゲティングベクターは、選択マーカー（ 例えば、ネオマイシン ）、および哺乳動物細胞5における効率的な相同組換えのために必要な長いゲノム領域に隣接し、所望の修飾（複数可）を含む関心のある対立遺伝子を担持するプラスミド構築物である。正確な遺伝子改変は、胚性幹（ES）細胞を6または体細胞7、意図された変更の転送におけるターゲティングベクター上のDNA配列の同一ストレッチおよびゲノム遺伝子座の結果とすることにより、相同組換えにターゲティングベクターを導入することにより達成される遺伝子変換8によるゲノムへ。このようなMODIFIES細胞は、その後の生殖細胞9を介してこれらの修飾された対立遺伝子を伝達することができる子孫（キメラ）を生成するために、マウスの胚盤胞に注入することができる編。トランスジェニックマウスを作製するための代替経路は、マウスゲノム10中のベクターのランダムな組込みをもたらす単細胞マウス接合体への遺伝子発現ベクターのマイクロインジェクションを含む。ベクター構築の従来の方法は、ベクターバックボーンに異なる選択マーカーとゲノム断片をクローニングするために制限酵素およびDNAリガーゼを使用してクローニング「カット＆ペースト」従来に頼ってきた。しかし、伝統的なクローニングの固有の制限要因は、特に、より長いDNA配列と、制限部位の位置および選択である。これは多くの場合、複数のサブクローニングステップを必要とし、また、多くの場合、遺伝子ターゲティングの低い効率につながるベクターに、外来DNA配列が導入されています。 コンビ（組換えENGineering）E.ファージの組換えタンパク質によって媒介される相同組換え（HR）を使用してこれらの制限を克服するDNA工学技術である大腸菌細胞 11,12。相同配列の任意の領域をリコンビニアリングの基質として働くことができるので、制限部位の利用可能性の制約が取り除かれる。大型DNA配列は、シームレス従って、それらの構造的完全性を維持13、インビボで直接改変することができる。遺伝子改変は、短い相同性（50塩基対）14、したがって相同性ア ​​ーム（HA）との非常に効率的で便利な合成オリゴ配列に組み込むことができる。典型的なコンビ実験、オリゴまたはHAを含む二本鎖DNA（dsDNAの）断片でコンビテントE.にエレクトロポレーションされている染色体上またはプラスミド15のいずれかに位置して標的を含有する大腸菌細胞 。再結合の可能性は、Red RECの誘導発現によって付与されるombinationファージ16,17のタンパク質またはRACプロファージ18のRecETタンパク質。赤/のRecEエキソヌクレアーゼは、そのパートナー、赤/ RECT、一本鎖アニーリングタンパク質（SSAP）19によって結合される一本鎖DNA（ssDNA）の中間に線形のdsDNAに変換する。長い一本鎖DNAまたはその相補的標的配列への短いオリゴのアニーリングは複製フォークのラギング鎖上に発生し、標的部位での配列の組み込みをもたらす。鎖のssDNA換えを遅れはコンビの高効率の基礎であり、「ベータ」再結合モデル20,21によって記述することができる。 遺伝子ターゲッティングベクターを構築するための典型的なコンビニアリングワークフローでは、次の二つの経路のいずれかを伴う。一つの経路は、loxP組換え部位の順次挿入したプラスミドへのマウスBACクローンから目的のゲノム領域、選択マーカーをサブクローニング含ま<s&gt; 22等まで、または代替ルートが10,23のコンビ、その後24,25のクローンを作成するギャップ修復によってプラスミドに変更された軌跡をサブクローニング複数回によって異なるターゲティングベクター要素とBACゲノム遺伝子座を標的にすることを含む。このテーマの変形が大きいマウスの生産プログラム26,27の一部として別の高スループットコンビパイプラインで使用されてきた。しかしながら、これらの手順は、複雑で長い段階を含む特殊なベクターおよびE.を使用する必要が大腸菌株（ 例えば、Creを発現する細胞）およびベクターDNAの精製と再変換した（ 表1）の一つ以上の中間ステップを利用する。サブクローニングプラス挿入（SPI）は、ベータ再結合し、単一のプロセス（ 図1）へのクローニングのギャップ修復を組み合わせた新しいコンビ技術です。 SPIベクトルアセンブリは、簡単、迅速かつ柔軟であり、標準recombiに有意な改善を提供するエンジニアリング（ 表1）に近づく。ここでは、使いやすさと非標準と挑戦的なベクトルのデザインの構築に特に重点を置いて異なるベクター構築アプリケーションのためのSPIを使用することの有用性を実証する。テストケースは、蛍光レポーターノックインベクターの構築は、二重タグ付きタンパク質の発現ノックインベクター、BAC蛍光レポーターベクターおよび条件付きノックアウトベクターを含んでいた。これらの要件は、細胞表面受容体を局在化する核タンパク質複合体を精製または条件付きの遺伝子の発現を焼灼するために種々検討した。

<table><tbody><tr><td>ゼオシン</td><td>シグマを除く抗生物質:http://www.sigmaaldrich.com</td><td>アンピシリン、A9518-5G; クロラムフェニコール、C1919-5G;ブラストシジン、15205-25MG;ゲンタマイシン、G1264-50MG;ハイグロマイシン、H3274-50MG;カナマイシン、:K1876-1G; テトラサイクリン塩酸塩、T7660-5G;トリメトプリム、92131-1G</td><td></td></tr><tr><td>ゼオシン</td><td>インビボゲン:&nbsp;</td><td>ant-zn-1</td><td>Zeocinは、Life technologies/Fisher</td></tr><tr><td>C57BL/6 BACクローンCHORI</td><td>:https://bacpac.chori.org/&nbsp から</td>も入手可能です。<td>RPCI-23またはRPCI-24 BACライブラリ</td><td>129/Sv BACクローンは、InvivogenまたはLife technologies/Fisher</td></tr><tr><td>KOD hotstart DNAポリメラーゼシステムから</td>取得できます <td>ミリポア:https://www.merckmillipore.com</td><td>71086-3</td><td></td></tr><tr><td>L-アラビノース</td><td>シグマ:http://www.sigmaaldrich.com</td><td>A3256-25G</td><td></td></tr><tr><td>長オリゴ</td><td>IDT:https://www.idtdna.com;Gene link:https://www.genelink.com</td><td>IDT UltramersまたはGene Linkの長鎖オリゴPTO</td><td>およびリン酸塩は、カスタム修飾として利用可能です。PAGE精製は、長鎖オリゴに強く推奨されます。</td></tr><tr><td>MinElute PCR精製キット</td><td>Qiagen: http://www.qiagen.com&nbsp;</td><td>28004</td><td>最小溶出PCR精製キットが推奨されます。</td></tr><tr><td>QIAPrep Spin Mini Prep kit</td><td>Qiagen: http://www.qiagen.com&nbsp;</td><td>27104</td><td>シリカカラムまたは同様のマトリックスキットが好ましい。</td></tr><tr><td>制限酵素</td><td>NEB: https://www.neb.com</td><td>DpnI: R0176L</td><td>REのリストはNEBのウェブサイトをご覧ください。</td></tr></tbody></table>

サブクローニングプラス挿入（spi） - ジーンターゲティングベクターの迅速な構築のための新しい遺伝子改変方法

Subcloning Plus Insertion (SPI) - A Novel Recombineering Method for the Rapid Construction of Gene Targeting Vectors

遺伝子ターゲティングとは、相同組換えを使用して遺伝子座を正確に改変することです。この方法を使用して新規の細胞株やトランスジェニックマウスモデルを作製するには、標的遺伝子と相同なDNA配列を含む「ターゲティング」ベクターの構築が必要であり、長年にわたってこのプロセスの制限的なステップでした。ベクター構築は、リコンビニアと呼ばれる技術を用いてファージリコンビナーゼによって媒介される相同組換えを用いて、大腸菌細胞においてin vivoで行うことができます。リコンビニアリングは、長い相同性配列(>4kb)と、ターゲティングベクターとその同族ゲノム遺伝子座との間の効率的な対立遺伝子交換を媒介するために必要な選択マーカーを含むさまざまなターゲティング要素をサブクローニングするための好ましい手法です。一般的なリコンビニアリングプロトコルは、ターゲティングエレメントを段階的に統合する反復スキームに従っており、中間の精製および形質転換ステップが必要です。ここでは、マルチプレックスアプローチを用いたベクトルアセンブリの新しいリコンビニアリング手法を紹介します。プラスミドギャップの修復は、マウス細菌人工染色体ライブラリーからのゲノム配列の同時捕捉と、細菌と哺乳類の二重選択マーカーの挿入によって行われます。このサブクローニングと挿入の併用法は非常に効率的で、正しい組換え体の大部分が得られます。この方法を使用して構築されたさまざまなタイプの条件付き遺伝子ノックアウト(ノックイン)ベクターおよびBACレポーターベクターの構築に関するデータを示します。SPIベクター構築は、リコンビニアリングツールボックスのレパートリーを大幅に拡張し、これらの非常に複雑なベクターを構築するためのシンプルで迅速、かつ費用対効果の高い方法を提供します。

遺伝子ターゲティング方法論は、ノックアウト、ノックイン、タグ付き対立遺伝子を持つトランスジェニックマウスを生成するために使用することができます。 ここでは、大腸菌のリコンビニアリングの改良された方法、これを「サブクローニングと挿入」と呼んでおり、これを使用してカスタム遺伝子ターゲティングベクターを迅速に生成することができます。

サブクローニングプラス挿入（SPI） - ジーンターゲティングベクターの迅速な構築のための新しい遺伝子改変方法

Gene targeting refers to the precise modification of a genetic locus using homologous recombination. The generation of novel cell lines and transgenic ...

次の実験の全体的な目標は、サブクローニングと挿入を使用して遺伝子標的ベクターを構築することです。これは、大腸菌を含む背部を再結合プラスミドで形質転換することによって達成されます。第2ステップでは、不斉ホスホロール化挿入カセットを作製し、ポリメラーゼ連鎖反応によりプラスミドをサブクローニングします。アラビノースの添加後、GBAA組換えタンパク質が発現し、末端修飾挿入カセットとサブクローニングプラスミドがエレクトロポレーションされます。目的のDNA配列をバックから同時にキャプティブし、挿入カセットでサブクローニングプラスミドに修飾します。標準的な組換えのような既存の方法のこの技術の主な利点は、遺伝子ターゲティングベクターの構築を単一の反応で実行できることです。まず、挿入カセットおよびサブクローニングプラスミドのオリゴを設計し、各オリゴがゲノム標的部位に隣接する180塩基対の相同性アームと、挿入カセットまたはサブクローニングプラスミドの特異的プライミング配列である20塩基対を含むように設計します。次に、clone dbのようなウェブベースのツールを使用して、バッククローンのゲノムDNAインサートの向きを決定します。バックからまたはESのレプリケーションの方向を確立するには、バックで使用されたバックプラスミドバックボーンのマップを確認します。ライブラリー構築は、末端のリン酸化8結合を2つ追加し、クローンの裏側に複製の方向と反対のオリゴの5つのプライムエンドを追加します。次に、リバースオリゴに5プライムリン酸修飾を添加します。まず、滅菌ピペットチップを背面の寒天培地に刺し、5.0ミリリットルのオディンブロスを接種します。200RPMで振とうしながら、摂氏37度で5時間培養します。次に、冷却、10%グリセロール溶液、マイクロ遠心分離機、チューブとエレクトロポレーション、氷の上のキュベット、冷蔵大型遠心分離機、マイクロ遠心分離機を摂氏4度に冷却します。インキュベーション後、分光光度計を使用して培養物の光学密度を決定します。吸光度の測定。600ナノメートルで。OD 600の読み取り値が0.3〜0.8に達したら、エレクトロコンピテントセルを準備します。培養の準備ができたら、50ミリリットルの遠心分離チューブで細胞をスピンダウンします。冷やした10%グリセロール1ミリリットルで細胞を洗浄し、再度紡糸します。これらの洗浄手順を合計3回実行します。細胞を総容量50マイクロリットルに再懸濁し、10〜200ナノグラムの再結合プラスミドを添加します。ピペッティングを数回上下させて単一細胞懸濁液を取得し、細胞をプレチルエレクトロポレーションに移します。獣医。次に、veteをエレクトロポレーション装置に入れ、細胞を電気操作し、すぐに1ミリリットルのLBで細胞を回収し、細胞を50ミリリットルの遠心分離管に移します。バックカルチャーを摂氏30度で2時間、200RPMで振とうしながら育てます。この時間の後、回収した培養物に9ミリリットルのLBを追加します。200 RPMで振とうしながら摂氏30度で一晩増殖し、ホモロジーアームを挿入カセットとsubcクローニングプラスミドに組み込みます。先に調製した長鎖修飾オリゴを用いてPCRを行います。あるいは、制限酵素を使用してプラスミドテンプレートを直鎖化し、PCR増幅領域の外側に切断され、熱で活性化されるものを選択します。ハイフィデリティホットスタートのDNAポリメラーゼシステムを使用してPCRをセットアップします。PCRマスターミックスを調製し、ベストプラクティスに従ってサーマルサイクリングを行います。反応後、AROSゲル電気泳動によりPCR産物を解析します。各PCRの1〜5マイクロリットルを1%arosゲルにロードします。次に、PCR精製キットを使用してPCR産物を精製します。PCR増幅されたDNAを既知のDNA標準セットに対して、またはNanoDrop分光光度計を使用して定量します。一晩インキュベーションした後、バックGBAA培養物を50倍に希釈し、ネガティブコントロール用に別の培養物を調製します。希釈した培養物を摂氏30度で200RPMで振とうしながら1時間50分成長させます。次に、前に示したように、すべての再結合材料と機器を摂氏4度に冷却します。OSEの10%重量/体積溶液を調製し、0.2ミクロンのシリンジフィルターで滅菌をろ過します。バックカルチャーのODが所望のレベルに達したら、組換えタンパク質の誘導を進めます。10%アラブ溶液の200マイクロリットルをバックカルチャーの10ミリリットルに加えて、0.2%の最終的なaose濃度を達成するネガティブコントロールとして使用するために、非誘導培養物を含める。培養物を摂氏37度の振盪インキュベーターに移し、230 RPMで振とうしながら45分間赤の発現を誘導します。細胞をスピンダウンし、10%グリセロールで前述したように600〜1000ナノグラムで3回洗浄します。リコンフィデンシング反応への挿入カセットとサブクローニングプラスミドのそれぞれには、ベクターのみとベクターとシングルインサートコントロールが含まれており、ベクターのリコンビネーションの習熟度と完全性をチェックします。次に、単一セル懸濁液を取得し、前に示したようにセルを電気操作します。LB培地を37°Cでマルチコピープラスミドの場合は1時間、バックベクターの場合は10 lbで37°Cで3時間回収します。回収した培養物で異なる希釈を二重選択で完了します。寒天をして、摂氏37度で16時間育ててください。準備ができたら、選択的抗生物質を含む5ミリリットルのLBにコロニーを選び、摂氏37度で一晩成長させます。次に、カラム精製キットを使用してミニプレップDNAを調製し、適切な制限酵素を導入してから、ゲル電気泳動により予想されるフラグメントサイズを含むクローンを同定します。最後に、相同性アームと挿入カセット全体でDNAシーケンシングを行い、光合成エラーを確認します。この例では、クローンを含む P two RX one EYFP インサートの制限酵素処理解析により、正しくアセンブルされたノックインベクターが含まれていることを示す期待されるパターンが示されました。この回路図は、バクトトリミングの概念を示しています。サブクローニングとPCR産物の挿入分析を行ったところ、カセットが正しく取り込まれていることが確認されました。また、適切な制限酵素を添加してポジティブバッククローンを解析したところ、期待通りのパターンが得られました。12の制限酵素消化解析では、R SRの2つのSBIクローンは、大部分の組換え体で正しいベクターアセンブリを示しました。このビデオを見れば、サブクローニングと挿入を使用して遺伝子ターゲティングベクターを迅速に構築する方法を十分に理解できるはずです。

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JoVE Journal

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生物学

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サブクローニングプラス挿入（SPI） - ジーンターゲティングベクターの迅速な構築のための新しい遺伝子改変方法

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