CRISPRベースのシャトルクローニング:ハイスループットクローニング法

ハイスループットクローニング法であるCRISPRshuttleのプロトコルについて説明します。これには、DNA断片のPCR増幅を必要とせずに、ベクター間で標的DNA断片を移すことが含まれます。ゲートウェイ注入やユニベクタークローニングPCR増幅などの既存の技術。このアプローチでは、一次デザインや分泌の検証など、フラグメント固有の手順が必要です。これらのタグは、労働集約的で時間がかかります。CRISPRシャトルは、ベクター間で標的DNA断片を連続した試験管反応に移しながら、PCRを排除します。この方法は、フラグメント固有の取り扱いの必要性を上回り、試料の構築を加速します。

[ナレーター]まず、画面に示されている試薬を組み合わせて、特定の数の消化反応用のマスターミックスを調製します。適切にラベル付けされた0.2ミリリットルのチューブを、氷上のアルミニウム冷却ブロックに配置します。適切な量のCAS9、sgRNA、10、CAS9バッファー、およびDEPC処理水を混合することにより、N回の反応用のマスターミックスを調製します。マスターミックスをよく混ぜて回転させます。3.75マイクロリットルのマスターミックスを各反応チューブに分注します。0.75マイクロリットルの0.03マイクロモルPLX 304 ORFプラスミドを各チューブに添加し、完全に混合し、チューブを摂氏37度で1時間インキュベートします。0.14マイクロリットルの3.36マイクロモル線形化pBIDC-UASC-pLXvectと1.8マイクロリットルのギブソンアセンブリマスターミックスを組み合わせてマスターミックスを調製します。マスターミックスをよく混ぜて回転させます。次に、1.94マイクロリットルのマスターミックスを各チューブに分注します。1.66マイクロリットルのCAS9切断プラスミドを各チューブに加えます。よく混ぜて摂氏50度で1時間インキュベートします。細菌コンピテント細胞を氷上で解凍します。解凍した細胞10マイクロリットルを、事前に冷却された各1.5ミリリットルチューブに分注します。10マイクロリットルのコンピテントセルと1マイクロリットルのギブソンアセンブリ製品を穏やかに混合します。チューブを氷の上に30分間置きます。チューブを摂氏42度で1分間熱ショックし、氷上で2分間冷やします。100マイクロリットルの予熱したSOC培地を各チューブに加え、摂氏37度で250 RPMで1時間振とうします。最後に、細胞をクロラムフェニコール1ミリリットルあたり15マイクログラムを含むLB寒天プレートに置き、摂氏37度で一晩インキュベートします。この図は、CRISPRshuttleシステムを使用して生成されたUAS-cDNA/ORFプラスミドの制限解析の代表的な結果を示しています。この分析では、PVU2を含む15のUAS-cDNA/ORFコンストラクトの制限消化により、すべてのサンプルが約1072塩基対と1,820塩基対で予想されるフラグメントパターンを示したことが明らかになりました。