Name: CRISPRベースのシャトルクローニング:ハイスループットクローニング法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-13T13:20:00.000+00:00
Duration: 4 min 25 s
Description: 学ぶCRISPRベースのシャトルクローニング法によるハイスループットDNA断片転送技術。PCR不要でベクター間の効率的な遺伝子操作を実現し、遺伝子工学研究の時間とリソースを大幅に削減します。

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<ol><li>Hartley, J. L., Temple, G. F., Brasch, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+cloning+using+in+vitro+site-specific+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">DNA cloning using in vitro site-specific recombination.</a> Genome Res. 10 (11), 1788-1795 (2000).</li>
<li>Brasch, M. A., Hartley, J. L., Vidal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orfeome+cloning+and+systems+biology%3A+Standardized+mass+production+of+the+parts+from+the+parts-list%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Orfeome cloning and systems biology: Standardized mass production of the parts from the parts-list.</a> Genome Res. 14 (10B), 2001-2009 (2004).</li>
<li>Zhu, B., Cai, G., Hall, E. O., Freeman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-fusion+assembly%3A+Seamless+engineering+of+multidomain+fusion+proteins%2C+modular+vectors%2C+and+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">In-fusion assembly: Seamless engineering of multidomain fusion proteins, modular vectors, and mutations.</a> Biotechniques. 43 (3), 354-359 (2007).</li>
<li>Liu, Q., Li, M. Z., Leibham, D., Cortez, D., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+univector+plasmid-fusion+system%2C+a+method+for+rapid+construction+of+recombinant+DNA+without+restriction+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">The univector plasmid-fusion system, a method for rapid construction of recombinant DNA without restriction enzymes.</a> Curr Biol. 8 (24), 1300-1309 (1998).</li>
<li>Marsischky, G., Labaer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Many+paths+to+many+clones%3A+A+comparative+look+at+high-throughput+cloning+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Many paths to many clones: A comparative look at high-throughput cloning methods.</a> Genome Res. 14 (10b), 2020-2028 (2004).</li>
<li>Wei, P., Xue, W., Zhao, Y., Ning, G., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-based+modular+assembly+of+a+UAS-cDNA%2FORF+plasmid+library+for+more+than+5500+Drosophila+genes+conserved+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">CRISPR-based modular assembly of a UAS-cDNA/ORF plasmid library for more than 5500 Drosophila genes conserved in humans.</a> Genome Res. 30 (1), 95-106 (2020).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-based+shuttle+cloning+of+1%2C397+human+genes+into+UAS+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biochim+Biophys+Sin+%28Shanghai%29%22%5BJournal%5D)">CRISPR-based shuttle cloning of 1,397 human genes into UAS vectors.</a> Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). , (2025).</li>
<li>Yang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+public+genome-scale+lentiviral+expression+library+of+human+ORFs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A public genome-scale lentiviral expression library of human ORFs.</a> Nat Methods. 8 (8), 659-661 (2011).</li>
<li>Wang, J. W., Beck, E. S., Mccabe, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modular+toolset+for+recombination+transgenesis+and+neurogenetic+analysis+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A modular toolset for recombination transgenesis and neurogenetic analysis of Drosophila.</a> PLoS One. 7 (7), e42102(2012).</li>
<li>Christie, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+DNA+cleavage+using+CRISPR-SpRYgests%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Precise DNA cleavage using CRISPR-SpRYgests.</a> Nat Biotechnol. 41 (3), 409-416 (2023).</li>
<li>Li, S. Y., Zhao, G. P., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C-brick%3A+A+new+standard+for+assembly+of+biological+parts+using+Cpf1%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">C-brick: A new standard for assembly of biological parts using Cpf1.</a> ACS Synth Biol. 5 (12), 1383-1388 (2016).</li>
<li>Lei, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CCTL+%28Cpf1-assisted+cutting+and+taq+DNA+ligase-assisted+ligation%29+method+for+efficient+editing+of+large+DNA+constructs+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The CCTL (Cpf1-assisted cutting and taq DNA ligase-assisted ligation) method for efficient editing of large DNA constructs in vitro.</a> Nucleic Acids Res. 45 (9), e74(2017).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>寒天粉末</td><td>ケムベース</td><td>KBS-001H</td><td></td></tr><tr><td>アガロース</td><td>サンゴン</td><td>A600014-0100</td><td></td></tr><tr><td>自動デジタルゲル画像解析システム</td><td>タノン</td><td>タノン-2500B</td><td></td></tr><tr><td>クロラムフェニコール</td><td>サンゴン</td><td>A100230-0010</td><td></td></tr><tr><td>E.Z.N.A. ゲル抽出キット</td><td>オメガ</td><td>D2500-02</td><td></td></tr><tr><td>E.Z.N.A. プラスミドDNAミニキットI</td><td>オメガ</td><td>D6942-02</td><td></td></tr><tr><td>エコリ-HF</td><td>NEB</td><td>R3101S</td><td></td></tr><tr><td>ギブソンアセンブリマスターミックス</td><td>NEB</td><td>E2611S型</td><td></td></tr><tr><td>HiScribe T7 クイックハイ収率RNA合成キット</td><td>NEB</td><td>E2050</td><td></td></tr><tr><td>NEBuilder HiFi DNAアセンブリマスターミックス</td><td>NEB</td><td>E2621X型</td><td></td></tr><tr><td>PCRサーマルサイクラー</td><td>ロングジーン</td><td>T20</td><td></td></tr><tr><td>Platinum SuperFi II DNAポリメラーゼ</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td>12361010</td><td></td></tr><tr><td>PVUII-HF型</td><td>NEB</td><td>R3151L</td><td></td></tr><tr><td>Q5 ホットスタート ハイファイ 2x マスターミックス</td><td>NEB</td><td>M0494</td><td></td></tr><tr><td>S. pyogenes Cas9</td><td>ジェンスクリプト</td><td>Z03386</td><td></td></tr><tr><td>シェイキングインキュベーター</td><td>ジチュウ</td><td>ZQLY-180V</td><td></td></tr><tr><td>分光 光度 計</td><td>島津製作所</td><td>バイオスペックナノ</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNAリガーゼ</td><td>プロメガ</td><td>M1801</td><td></td></tr><tr><td>Trans 10 化学的コンピテントセル</td><td>トランスジェネーション</td><td>CD101-02</td><td></td></tr><tr><td>トリプトン</td><td>オキソイド</td><td>LP0042</td><td></td></tr><tr><td>XbaI</td><td>NEB</td><td>R0145S</td><td></td></tr><tr><td>酵母エキス</td><td>オキソイド</td><td>LP0021</td><td></td></tr></tbody></table>

crisprベースのシャトルクローニング:ハイスループットクローニング法

CRISPR-based Shuttle Cloning: A High-throughput Cloning Method

私たちは、CRISPRshuttleを利用して、 ショウジョウバエ7に保存されている1,397のヒト遺伝子を網羅するUAS-cDNA/ORFプラスミドコレクションを構築しました。制限分析の結果、CRISPRshuttleは、2つの反復配列を含むCRISPRshuttle適合デスティネーションベクターの使用で94.5%、反復配列のないデスティネーションベクターの使用で96.1%の効率に達することが明らかになった7。私たちのデータは、通常、2人の研究者が7日以内にCRISPRshuttleを介して~300プラスミドを作成できることを示しました7。CRISPRshuttleを介したcDNA/ORFフラグメント導入の成功は、診断用制限酵素処理によって確認されました。CRISPRshuttle適合ターゲットベクター(pBIDC-UASC-pLXvect)骨格特異的フラグメント(PvuIIによる消化の場合は1,072 bpおよび1,820 bp)を生じる反応は、陽性と見なされました(<st...

CRISPRベースのシャトルクローニング:ハイスループットクローニング法

The development of genome-wide plasmid libraries using existing genomic repositories serves as a pivotal prerequisite for systematic functional ...

ハイスループットクローニング法であるCRISPRshuttleのプロトコルについて説明します。これには、DNA断片のPCR増幅を必要とせずに、ベクター間で標的DNA断片を移すことが含まれます。ゲートウェイ注入やユニベクタークローニングPCR増幅などの既存の技術。このアプローチでは、一次デザインや分泌の検証など、フラグメント固有の手順が必要です。これらのタグは、労働集約的で時間がかかります。CRISPRシャトルは、ベクター間で標的DNA断片を連続した試験管反応に移しながら、PCRを排除します。この方法は、フラグメント固有の取り扱いの必要性を上回り、試料の構築を加速します。[ナレーター]まず、画面に示されている試薬を組み合わせて、特定の数の消化反応用のマスターミックスを調製します。適切にラベル付けされた0.2ミリリットルのチューブを、氷上のアルミニウム冷却ブロックに配置します。適切な量のCAS9、sgRNA、10、CAS9バッファー、およびDEPC処理水を混合することにより、N回の反応用のマスターミックスを調製します。マスターミックスをよく混ぜて回転させます。3.75マイクロリットルのマスターミックスを各反応チューブに分注します。0.75マイクロリットルの0.03マイクロモルPLX 304 ORFプラスミドを各チューブに添加し、完全に混合し、チューブを摂氏37度で1時間インキュベートします。0.14マイクロリットルの3.36マイクロモル線形化pBIDC-UASC-pLXvectと1.8マイクロリットルのギブソンアセンブリマスターミックスを組み合わせてマスターミックスを調製します。マスターミックスをよく混ぜて回転させます。次に、1.94マイクロリットルのマスターミックスを各チューブに分注します。1.66マイクロリットルのCAS9切断プラスミドを各チューブに加えます。よく混ぜて摂氏50度で1時間インキュベートします。細菌コンピテント細胞を氷上で解凍します。解凍した細胞10マイクロリットルを、事前に冷却された各1.5ミリリットルチューブに分注します。10マイクロリットルのコンピテントセルと1マイクロリットルのギブソンアセンブリ製品を穏やかに混合します。チューブを氷の上に30分間置きます。チューブを摂氏42度で1分間熱ショックし、氷上で2分間冷やします。100マイクロリットルの予熱したSOC培地を各チューブに加え、摂氏37度で250 RPMで1時間振とうします。最後に、細胞をクロラムフェニコール1ミリリットルあたり15マイクログラムを含むLB寒天プレートに置き、摂氏37度で一晩インキュベートします。この図は、CRISPRshuttleシステムを使用して生成されたUAS-cDNA/ORFプラスミドの制限解析の代表的な結果を示しています。この分析では、PVU2を含む15のUAS-cDNA/ORFコンストラクトの制限消化により、すべてのサンプルが約1072塩基対と1,820塩基対で予想されるフラグメントパターンを示したことが明らかになりました。

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

遺伝子ターゲティング方法論は、ノックアウト、ノックイン、タグ付き対立遺伝子を持つトランスジェニックマウスを生成するために使用することができます。...

サブクローニングプラス挿入（SPI） - ジーンターゲティングベクターの迅速な構築のための新しい遺伝子改変方法

DNAアセンブリを使用して、複数のCRISPRベクトルが単一クローニング反応に並列に構築することができ、CRISPR多数の構造を作ることは簡単な作業ベクトル。トマト毛状根は、CRISPRベクトルを検証し、突然変異体材料を生成するための優れたモデルシステムです。...

トマト毛状根の発生によるDNAの修飾のハイスループットCRISPRベクター構築と特性

ここで説明したジェノタイピング技術、キャピラリーゲル電気泳動に結合する蛍光ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）は、ヌクレアーゼ媒介ノックアウトクローンのハイスループット遺伝子型決定を可能にします。これは、他の遺伝子型判定技術が直面している制限を回避し、配列決定法よりも費用対効果の高いです。...

ハイスループットフォーマットでの遺伝子型CRISPR / Cas9媒介ノックアウト変異体に蛍光PCR-キャピラリーゲル電気泳動法を用いました

このプロトコルは、CRISPR / Cas9技術を用いたマルチ遺伝子ノックアウトの作成に特に有用な、1つのガイドRNAコンカテマーベクターに複数の単一ガイドRNAをクローニングするための工程を記載する。腸オルガノイドにおける二重ノックアウトの生成は、この方法の適用可能性として示されている。...

CRISPRコンカテマーを用いたマウス小腸オルガノイドにおける複数の遺伝子ノックアウトのためのプロトコル

ここでは、シンプルで効率的と sgRNA...

哺乳類システムのクローン作成 CRISPR ガイド RNA

本稿では急性骨髄性白血病 (AML) 細胞増殖で複数の候補者の遺伝子の役割を簡単かつ迅速な捜査のためクラスター化定期的に空間短い回文を繰り返す (CRISPR) CRISPR ベース Cas9...

CRISPR ベース Cas9 の競争の試金を使用して遺伝的依存関係の調査

このプロトコルは、音響液滴排出技術を用いて384ウェルプレートにおける哺乳動物細胞のハイスループットプラスミドトランスフェクションについて説明する。時間がかかり、エラーが起こりやすいDNA分配と多重化だけでなく、トランスフェクション試薬の分配は、ソフトウェア駆動型であり、ナノディスペンサーデバイスによって実行されます。細胞は、次いで、これらの予め充填された井戸に播種されます。...

音響ナノディスペンス技術を用いたハイスループットDNAプラスミド多重化とトランスフェクション

このプロトコルは、ヒト多能性幹細胞におけるCRISPR-CAS9を用いて定義されたヘテロ接合性またはホモ接合ヌクレオチド変化の生成を容易にする方法を提供する。...

ヒト多能性幹細胞におけるCRISPR-CAS9を用いて定義されたゲノム修飾の生成

CRISPR-Cas系および抗CRISPRタンパク質は、 出芽酵母のブールゲートのスキームに統合されました。新しい小型論理回路は良好な性能を示し、dCas9/dCas12aベースの転写因子と抗CRISPRタンパク質の特性の両方の理解を深めました。...

CRISPR-Casシステムと抗CRISPRタンパク質に基づく遺伝子デジタル回路

本稿では、一般に公開されているcDNA/ORFリソースを用いて ショウジョウバエ...

UAS-cDNA/ORFプラスミドライブラリーのハイスループット構築のためのCRISPRベースのモジュラーアセンブリ

THP-1細胞株は、さまざまな生物学関連研究領域において、ヒト単球/マクロファージの機能を調べるためのモデルとして広く使用されています。この記事では、効率的なCRISPR-Cas9ベースのエンジニアリングとシングルセルクローン単離のためのプロトコルについて説明し、堅牢で再現性のある表現型データの生成を可能にします。...

エレクトロポレーションに基づくTHP-1細胞におけるCRISPR-Cas9媒介遺伝子ノックアウトとシングルセルクローン単離

学ぶCRISPRベースのシャトルクローニング法によるハイスループットDNA断片転送技術。PCR不要でベクター間の効率的な遺伝子操作を実現し、遺伝子工学研究の時間とリソースを大幅に削減します。

CRISPRベースのシャトルクローニング:ハイスループットクローニング法

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