トマト毛状根の発生によるDNAの修飾のハイスループットCRISPRベクター構築と特性

このクローニングおよび形質転換手順の全体的な目標は、CRISPRベクターを効率的に生成し、機能ゲノム研究に使用できる変異型トマトの根をノックアウトすることです。この方法は、さまざまな根のプロセスで使用できる多数のノックアウト変異体を生成できるため、植物ゲノミクスの分野で有用なツールです。この技術の主な利点は、クローニング手順を1つのステップで完了できるため、グループ材料をわずか数週間で取得できることを定着させることです。

まず、DNAアセンブリに必要な5つのプライムおよび3つのプライム20ヌクレオチド配列に隣接するターゲットモチーフのGN19部分を含むように、RNAまたはgRNAオリゴを設計します。1〜5マイクログラムのP201Nカズニンプラスミドと制限酵素Spe1を摂氏37度で2時間消化します。メーカーの指示に従って消化物をカラム精製した後、10ミリモルTrs HCLの15マイクロリットルに再懸濁します。

UV分光光度法によりDNA量を定量します。制限酵素Swa1を用いて2回目の消化を摂氏25度で2時間行います。ゼロポイントの8パーセントアガロースゲルで100〜200ナノグラムをチェックし、完全な消化を確認します。

正しく消化されたプラスミドは、14, 313塩基対に1つのバンドを持ちます。メディカゴ・トランカチュラをPCR増幅するには、パックgRNAシャトルプラスミドから6つのプロモーターとスカフォールドDNAを使用します。プライマーSwa1とMtu6FとMTU6Rを使用し、Spe1足場Rに足場Fを、高忠実度ポリメラーゼで使用します。

1% アガロースゲル上で 3 マイクロリットルの PCR 産物を可視化し、増幅を確認します。MTU6アンプリコンは377塩基対で、スキャフォールドアンプリコンは106塩基対です。残りのPCR産物をメーカーの指示に従ってカラム精製します。

以前と同様にUV分光光度法で定量し、マイナス20°Cで保存します。次に、gRNAオリゴのチューブ全体をラボグレードの水で100マイクロモルに再懸濁します。オリゴ1マイクロリットルを500マイクロリットルの1xNEBバッファー2点1に加え、よく混合します。

温められた蓋付きのサーマルサイクラーを、摂氏50度で保持するようにプログラムします。100ナノグラムの直鎖状ベクター、50ナノグラムのMtU6プロモーター、12ナノグラムのスキャフォールド、および1マイクロリットルの希釈gRNAオリゴを水に溶かし、最終容量5マイクロリットルにします。5マイクロリットルの2倍ハイフィデリティDNAアセンブリマスターミックスを加えます。

よく混ぜてスピンダウンします。反応液を摂氏50度のサーモサイクラーで60分間インキュベートします。摂氏50度で1時間後、反応を氷の上に置き、次に2マイクロリットルを使用して、標準的な技術を使用してコンピテントE.Coli細胞を形質転換します。

50ミリグラム/ミリグラム/ミリリットルのカナマイシンを添加したLB寒天培地で形質転換をプレート化し、摂氏37度で一晩インキュベートします。プライマーStUb3p 218Rおよび1Sce1Rを用いたPCRを用いてコロニーをスクリーニングします。残りのDNA集合反応のアマイルコートを水で1〜5希釈し、コロニースクリーニングのポジティブコントロールとして1マイクロリットルを使用します。

また、インサートなしのコントロールとして1ナノグラムの円形P201Nカスニンプラスミドも含みます。プロトコールの記述部分に含まれるパラメータを使用してPCR増幅を行った後、1%アガロースゲル上でPCR産物を可視化します。正しい挿入には725塩基対のバンドがあり、挿入のないベクトルには310塩基対のバンドがあります。

LB Can50液体培養物でポジティブコロニーを摂氏37度で一晩成長させます。翌日、メーカーの指示に従ってプラスミド精製キットを使用してプラスミドを精製します。StuB3P218Rプライマーで精製したプラスミドをサンガーシーケンシングした後、クロマトグラムをMtU6プロモーター、ターゲット、およびスキャフォールド配列にアライメントして、クローニング中にエラーが発生していないことを確認します。

1 μg のプラスミドを EcoR5 および Sti1 で消化することにより、診断用消化を行います。ゼロポイント8アガロースゲルで視覚化すると、このバンディングパターンが見えるはずです。最後に、プラスミド調製物の1マイクロリットルを50マイクロリットルのエレクトロコンピテントセルに添加し、1ミリリミッターキュベットでエレクトロポレーションすることにより、プラスミドをAgrobacterium rhizogenes株ARqua1に変換します。

約500マイクロリットルのSOCメディアを追加し、摂氏28度で2時間振とうします。次に、LB Can50プレートにプレートを付け、摂氏28度で2日間成長させます。手順のこのセクションは、トマトの種子を20%の家庭用漂白剤で15分間、絶えず混合して滅菌することから始めます。

次に、種子を層流フードに移します。漂白剤を取り除き、滅菌実験室グレードの水で3回洗浄します。MS培地を半分ずつ入れたGA7ボックスに30シードをプレートします。

暗闇で約2日間発芽させます。種子が発芽したら、GA7ボックスを光の中に移動します 形質転換の前日、Can50を含む固体LBでA.rhizogenes培養物をストリークアウトし、摂氏28度で一晩成長します。形質転換の日には、層流フードで作業し、25マイクロリットルのアセトシリンゴンを50ミリリットルの半分のMSに添加し、各培養チューブに6ミリリットルを注ぎます。

曲げた 200 マイクロリットルの先端を使用して、プレートから A.rhizogenes 細胞を掻き取り、6 ミリリットルの 1/half MS 液体に再懸濁します。チューブをボルテックスして、細胞を完全に再懸濁します。各ベクターから細胞を再懸濁した後、1ミリリットルの細胞を取り出し、600ナノメートルの固定波長で光学密度を測定します。

滅菌フィルターペーパーでペトリ皿に2ミリリットルの半分のMS液体を加えます。苗から子葉を摘出し、湿らせた濾紙の上に置きます。すべての子葉を集めたら、子葉の最も遠位の1センチメートルを切り取り、両端が切り取られた子葉のピースになります。

ex植物をA.rhizogenes溶液に加えて混合します。20分間インキュベートし、時々反転させます。A.rhizogenesのインキュベーション中に、各コンストラクトトランスフォームの濾紙をペトリ皿に加えます。

また、抗生物質を含まないMS固体培地を半分ずつ層流フードにセットして乾燥させます。滅菌鉗子を使用して、A.rhizogenes溶液から子葉をすくい取り、乾いた濾紙の上に置きます。次の形質転換に進む際に組織が乾かないように、ペトリ皿の蓋で覆います。

次に、子葉を濾紙にブロットし、アバキシマル側をMS培地の半分まで移します。プレートをサージカルテープで包み、室温で2日間暗所で共培養します。共培養後、子葉の軸面を上にして、補充した半分のMS培地に移します。

サージカルテープで包みます。室温の蛍光灯の下で培養を維持し、16時間の撮影期間を設けます。5〜2週間後、滅菌鉗子とメスを使用して、子葉から少なくとも2センチメートルの長さの根を切り取り、チカルシロン/クラブラン酸とカナマイシンに半分のMS培地を補充します。

10〜15本の根を1枚のプレートに移します。ルートの先端の位置をマーカーでマークします。サージカルテープで包み、培養室で保管します。

1週間後、選択培地上で形質転換根が成長しているのが見られます。好ましいDNA抽出法を使用してDNA抽出のために、形質転換された根のサブサンプルを回収します。毛深い根は、形質転換の11日後に子葉から出現するのを見ることができます。

根はチカルシロン/クラブラン酸で選択され、カナマイシンは半分のMS培地を約1週間補充しました。灰色のバーは、めっき時の根元の先端の位置を示しています。これは、4つの異なる毛根イベントで2つの異なる遺伝子ターゲットを持つDNA変異を決定するためのPCR産物のクローニングとシーケンシングの例です。

灰色のボックスはGN20 GGターゲット配列を示し、デルタは突然変異の種類を示します。示された突然変異を持つクローンの数を右側に示します。これは、DNAの突然変異を決定するためのポリアクリルアミドゲルの一例です。

大きな欠失とヘターデュプレックスバンドは、標的配列にDNA変異が存在することを示しています。12の独立したイベントのうち6つは、デルタ記号で示されているように突然変異体としてスコアリングされました。WT は野生型コントロールを示し、NT はテンプレートなしコントロールを示します。

習得すれば、1週間で数十から数百のCRISPRベクターを作製でき、トレンデュレート基の材料は数週間で得ることができます。この手順を試みる際には、残留するアグロバクテリウムの増殖を除去して抑制することが重要です。アグロバクテリウムの異常増殖は、あらゆる根の材料を阻害し、死滅させます。

このビデオを見れば、DNAアセンブリを使用してCRISPRベクターを生成する方法と、毛深い根モデルシステムとトマトを使用してそれらのベクターをテストする方法について十分に理解できるはずです。