Name: トマト毛状根の発生によるDNAの修飾のハイスループットCRISPRベクター構築と特性 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 59 s
Description: 学ぶ CRISPRベクター構築法とトマト毛状根を用いたノックアウト変異体作製。DNAアセンブリーによる単一ステップクローニングで、植物機能ゲノミクス研究の効率を大幅に向上させる。

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この研究は、国立科学財団の助成金IOS-1025642（GBM）によってサポートされていました。我々はARqua1株を提供するためのマリア・ハリソンに感謝します。

1.ガイドRNAの設計とベクター構築<ol><li>目的の遺伝子のための標的配列を同定します。このステップ13,14に適したオンラインCRISPRターゲット発見の様々なプログラムがあります。 注：ここでは、GN 20 GGの標的モチーフを使用していますが、他の設計は、使用するアプリケーションまたはベクターシステムに応じて適切であり得ます。 </li><li> DNAの組み立てに必要とされる5 &#39;および3&#39; 20-ntの配列が隣接標的モチーフのGN 19の部分を含むようにデザイン60-merのgRNAオリゴ。最終的な60マーモチーフはある：5&#39;-TCAAGCGAACCAGTAGGCTT-GN 19 -GTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3」。 注：標準、脱塩したプライマーは正常に動作します。 </li><li>アセンブリのための4つのDNA（ 図1）を準備します。 DNA配列のための補足ファイルを参照してください。 <ol><li> 2時間37℃で1×緩衝液4中の制限酵素のSpeIとCas9 10プラスミド：p201N5μgの- 1ダイジェスト。ダイジェスト列は、浄化します製造元の指示にccording。 〜10 mMトリス - 塩酸15μlのを中に再懸濁し、UV分光光度法により定量化します。 </li><li>第2時間、25℃で1×緩衝液3.1に制限酵素SWA Iで消化を行います。完全な消化を確認するために、0.8％アガロースゲル上でngの200から100を確認してください。 注：正しく消化されたプラスミドは、14313塩基対で単一のバンドを持っています。注：酵素や脱リン酸化の熱不活性化は必要ありません。消化されたプラスミドは、-20℃で保存することができます。 </li><li> PCRは、それぞれ、プライマーSWA I_MtU6F / MtU6RとScaffoldF / Speを I_ScaffoldRを使用してのpUC gRNAシャトル10プラスミドからのMedicago truncatula（MT）U6プロモーターと足場のDNAを増幅します。 PCR条件と高忠実度ポリメラーゼ使用：3分間95℃。 （15秒、30秒、72℃20秒間、98℃、60℃）を31サイクル;そして5分間72℃。 <ol><li> PCR PRの〜3μlのアリコートを可視化増幅を確認するために1％アガロースゲル上でoducts。 MtU6アンプリコンは377 bpであり、足場のアンプリコンは106 bpです。 -20℃でUV分光光度法およびストアによって定量化、製造者の指示に従って、残りのPCR産物をカラム精製します。 </li></ol></li><li>実験室グレードの水中で100μMのgRNAオリゴの管全体を再懸濁します。バッファー（1x）2.1の500μlに100μMオリゴの1μLを加えます。よく混ぜます。複数のオリゴをプールする場合は、バッファー（1x）2.1管に各100μMのオリゴの1μlを添加します。希釈されたオリゴは、-20℃で保存することができます。 </li></ol></li><li>加熱蓋を使用して、50℃で保持するためのサーマルサイクラーをプログラムします。 MtU6プロモーターの線形化ベクター100ng（0.011ピコモル）、50 ngの（0.2ピコモル）、12 ngの足場の（0.2ピコモル）、希gRNAオリゴ（複数可）の1μL（0.2ピコモル）、および水の体積にコンバイン5μlの。 、2倍の高忠実度DNAアセンブリマスターミックスの5μLを加え、よく混ぜるとスピンダウン。 60分間反応をインキュベート50°Cサーマルサイクラー。その後、氷上で反応を置きます。 注：反応容量は低いDNA収量を収容するように増加させることができます。 </li><li>コンピテントE.への反応の2μLを変換します50 mgのLを-1カナマイシン（菅50）を補充したLB上の標準的な技術やプレートを使用して大腸菌細胞。 37℃で一晩平板培養細胞を成長させます。 -20℃で、残りのDNA集合反応を保存します。 </li><li>プライマーStUbi3P218RとISceIRを用いたPCRによるコロニー画面。 5：水1で、残りのDNAアセンブリ反応のアリコートを希釈します。無挿入制御などCas9プラスミド：陽性コロニー画面の制御と円形p201N 1ngのよう1μLを使用してください。 <ol><li> PCR条件で増幅します。 3分間95°C; 31サイクル（30秒95℃、30秒間58℃、30秒間72°C）。そして5分間72℃。 1％アガロースゲル上でPCR産物を可視化します。正しい挿入は725 bpおよびベクトルウィットでバンドを持っていることを確認してくださいハウトインサート（ 例えば 、切断されていないベクトル）310-bpのバンドを持っています。 </li></ol></li><li> 37℃で一晩LB菅50液体培養で陽性コロニーを成長させ、製造元の指示に従ってプラスミドを精製します。サンガーシーケンスはStUbi3P218Rプライマーとプラスミドとエラーがクローニング中に導入されなかった確実にするためにMtU6プロモーター、ターゲット、および足場配列にクロマトグラムを揃えます。 </li><li> エコ RVおよびSTY Iでプラスミドの〜1μgのを消化することによってダイジェスト診断を実行します0.8％アガロースゲル上で可視化します。 （塩基対で）断片は、以下のとおりです。4192、2001、1743、1544、1381、995、831、702、460、423、318、および174。 </li><li>複数gRNAsでベクターを構築するためにDNAのアセンブリを使用してください。 <ol><li> 2 gRNAカセットを有するベクターを構築するために、PCRは、それぞれの各1 ngのからUNS1_MtU6F / Speを I_ScaffoldRプ ​​ライマーを用いてプライマーSWA I_MtU6F / UNS1_ScaffoldRと第2の位置gRNAで最初の位置gRNAを増幅します1.8 - 手順1.1で構築したプラスミド。ステップ1.3.3でPCR条件を使用してください。増幅を確認するために1％アガロースゲル上でPCR産物の〜3μlのアリコートを視覚化します。アンプリコンは〜500bpです。 </li><li>合わせて、200μlの管に未精製のPCR産物のほぼ等量を混合（典型的には3 - 各4μlの）。アセンブリのために、PCR産物を組み合わせた1μlを添加、SWA IおよびSpeの50 ngのは、私がp201N直線化：2.5μlのと2倍の高忠実度DNAアセンブリマスターミックスの2.5μlにCas9、実験室グレードの水を。 15分間50℃でサーマルサイクラーでインキュベートします。 注：DNA組立マニュアル2のための15分間のインキュベーションをお勧めします - 3断片を。 </li><li>コンピテントE.に2μlの- 1を変換しますLBカン50上の大腸菌細胞とプレート。 37℃で一晩播種した細胞を成長させます。 -20℃で残りの反応を保存します。 </li><li>ステップ1.6と同様の条件でプライマーStUbi3P218RとISceIRを用いたPCRによるコロニー画面。正しいClonesは1200 bpのアンプリコンを持つことになります。 LB館で陽性コロニー50の液体培養物を、一晩増殖し、プラスミドを精製します。 </li><li>プライマーStUbi3P218R（最初の位置gRNAをカバー）とp201R（第2位置gRNAをカバー）とサンガーシーケンスプラスミド。 MtU6プロモーター、ターゲット、および足場配列にクロマトグラムを合わせます。 エコ RVおよびSTYと診断ダイジェスト私は（塩基対で）以下の断片になります：4192、2476、1743、1544、1381、995、831、702、460、423、318、174太字の断片は、第二gRNAが含まれています。 </li></ol></li><li>すべての品質管理の期待に応えた後、 アグロバクテリウム・リゾゲネス株ARqua1 15にプラスミドを形質転換します。 2.4 kVの、25μF、および200Ω：設定で1ミリメートルのキュベット内のエレクトロ細胞とエレクトロポレーションの50μlに、プラスミドプレップの1μlを添加します。 SOCの〜500μlの中で細胞を回収し、2時間28℃で振とうします。 LB菅50とグラム上のプレート2日間28℃で行。 1.3.3と同じプライマー及びPCR条件を用いたコロニー画面を実行します。陽性クローンからグリセロールストックを作ります。 </li></ol> 2.毛状根形質転換<ol><li>一定に混合しながら、15分間、20％の家庭用漂白剤でのトマトの種子を滅菌します。層流フード中で、漂白剤を除去し、無菌実験室グレードの水で3回洗浄します。 </li><li> ½MS培地（2.22グラムのL -1 MS塩+ガンボーグビタミン、10グラムのL -1スクロース、3グラムL -1ジェランガム、pHは5.8）を含むGA-7ボックス内のプレート30の種子。光にGA-7ボックスを移動した後、暗所で〜2日間発芽。光の中で〜4日分以上の苗を育てます。 </li><li>変換前の日、ストリークアウトA.固体LBカン50の文化をリゾゲネス 、一晩28℃で成長します。 </li><li>変態の日、層流フード内で無菌の材料組み立てる：12ミリリットル培養管を、50mlコニカルチューブ1/2 MS液体（無ゲラングラムUM）、200μMのアセトシリンゴン、濾紙、ペトリ皿、ピンセットやメス、ピペット及びピペットチップ。 1/2 MS 50mlにアセトシリンゴンの25μlを添加して、各培養チューブに〜6ミリリットルを注ぎます。 </li><li> A.をこすりするために曲がった200μlのチップを使用します½MS液体の6ミリリットル中にプレートを再懸濁からリゾゲネス細胞 。ボルテックスチューブは完全に細胞を再懸濁します。各ベクターからの細胞を再懸濁した後、600 nMでの固定波長で細胞を1mlの光学密度（OD）を測定します。 ODが0.2と0.4の間であることを確認します。希釈又は、必要に応じて複数のセルを追加します。各構築物について、この手順を繰り返します。 </li><li>滅菌ろ紙でペトリ皿にの1/2 MS液体〜2ミリリットルを追加します。湿らせたろ紙上の苗木と場所から消費税子葉。一旦全ての子葉は、2つの切断端部を有する子葉片で、その結果、子葉のオフ遠位〜1cmにカットし、収集されました。 A.に外植片を追加します。 リゾゲネス溶液は、混合し、20分間インキュベート時折反転しています。 注意：構造物あたり約12の外植片が日常的に使用され、多くの80として外植片をA. 6mlに接種されているもののリゾゲネスソリューション 。 </li><li> A.間、 リゾゲネスのインキュベーション、1あたりの構築物は、形質転換、ペトリ皿にろ紙を追加します。また、乾燥する層流フードで、½MS固形培地、抗生物質なしを設定します。 </li><li> A.から子葉をスクープ乾燥ろ紙上の滅菌ピンセットと場所とリゾゲネスソリューション 。次の変換処理中に、組織が乾燥しないようにペトリ蓋でカバーしています。 MS培地を1/2にろ紙と転送、背軸側を上にブロット子葉、。外科手術用テープでプレートをラップし、2日間室温で暗所での共同開拓。 </li><li>共培養した後、子葉を転送し、背軸側を上に、残油の成長を防止するために、300 mgのLを添加したMS培地-1チカルシリン/クラブラン酸（ティム300を 、1/2にUALのA.リゾゲネス ）とカン50（植物選択用）および外科テープで包みます。 16時間の光周期で、室温で蛍光灯の下での培養を維持します。 </li><li>長さは2週間の根2cm以上滅菌ピンセットやメスを使用して、子葉から切り出し、MSカン50ティム300メディアを1/2に転送されます- 〜1.5後。単一のプレートに10〜15の根を転送します。マーク・マーカーと根の先端の位置、外科手術用テープでラップし、培養室で維持します。 </li><li>一週間後、形質転換された根は、選択培地上で成長が見られます。好適なDNA抽出法を用いて、DNA抽出のための形質転換根のサブサンプルを収穫。注：子葉を持つプレートは2のために保つことができる - もつれた混乱に成長し、単離することが困難である根を指した後3週ごとの収穫、。非収穫根組織を無期限に維持することができます。種々のアッセイは、単離されたDNA試料に対して実施することができますDNA変異の頻度及び種類を決定することです。いくつかのこのようなアッセイの結果を以下に記載します。 </li></ol>

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</ol>

著者らは、開示することは何もありません。

DNAアセンブリは重複するDNA配列を再結合するために使用されるため、このクローニング法はあらゆるCRISPRベクター構築に適用できます。ほとんどのCRISPRクローニングスキームは、gRNAの遺伝子合成、IIS型制限酵素17,18、またはオーバーラップ伸長PCRのいずれかを使用します19。これらの技術にはそれぞれ固有の長所と短所がありますが、通常は複数の実践的なクローン作成ステップが必要です。ここで紹介するクローニング法の主な利点は、プロセス全体が1時間の1回の反応で行われ、gRNAオリゴをプールしてクローニング手順をさらに合理化できることです。さらに、DNA集合メカニズムは制限酵素とは無関係であるため、この方法は事実上すべてのDNA配列と互換性があります。便利なことに、不変のDNA成分(線形化ベクター、MtU6プロモーター、および足場)のマスターミックスを作成し、後で組み立てるために-20°Cで保存することができます。 
GN20GG gRNAターゲットモチーフを使用していますが、使用できる代替gRNAターゲット...

CRISPR / Cas9で標的DNAの変更を生成する能力は、機能的ゲノム研究のための大きな可能性を秘めています。 CRISPR / Cas9システムの2つのコンポーネントがあります。 ブドウ球菌化膿連鎖球菌と、標的DNA部位（複数可）1にCas9を指示およそ100-ntのガイドRNA（gRNA）分子に由来Cas9ヌクレアーゼ、。標的認識は、最初にによって与えられる〜ターゲティングベクター2,3の高スループット生産を可能にするgRNA、20-NT。操作することができるほとんどの生物は、既にCRISPR / Cas9技術4,5とされています。 植物では、例えば、CaMV35Sプロモーターなどの構成的プロモーターは、一般にCas9ヌクレアーゼ6の発現を駆動するために使用されます。 gRNAsはgRNAの最初の塩基を制限するRNAポリメラーゼIII U6またはU3プロモーターを用いて表現しているのいずれかG、効率的な転写のためのU3のためのU6、またはA、のために。しかし、RNAポリメラーゼIIのプロムこれらの制限のないotersも、7,8を使用されています。 異なるgRNAsは異なる効率を有するDNAの突然変異を誘発し、最初に全植物の形質転換に投資するか、大規模な表現型の画面を設定する前に、CRISPRベクトルを検証するために重要であり得ます。植物におけるCRISPRコンストラクトの一過性発現は、例えば、アグロインフィルトレーションを使用して、一般的なアプローチでは非実用的変異の検出が困難と表現型のアッセイを行うこと、安定した植物体6と比較して、DNA修飾の低い周波数になります。いわゆる毛状根は、安定した植物についてヶ月とは対照的に独立した、安定に形質転換された材料の多くは、数週間以内に発生させることができるので便利で、代替システムです。 CRISPRベクターは、毛状根9,10においてDNA突然変異を誘発するのに非常に効果的です。 DNAアセンブリ方法は、効率的overlを含むDNA断片を連結しますappingは11を終了します。いくつかのDNAの組み立て方法の主な利点は、組み立てられた製品へのssDNA（ すなわち 、オリゴ）を組み込む能力です。 gRNAsのみ〜20ヌクレオチド長であり、新たなターゲットが合成オリゴを用いて作製することができるので、これらのDNAアセンブリ方法は、CRISPRクローニングに適しています。ここに記載されたプロトコルが正常に大豆10、ポプラ12で使用され、現在はトマトされたCRISPRベクトルのP201シリーズに基づいています。提示クローニング手順は、現在のクローニング法10の上にいくつかの利点を提供しています。すなわち、完全に機能的なベクターは、1日に単一クローニング反応で生成することができます。ベクター構築はさらに手をオン還元時間と材料費、並行して複数のCRISPRベクトルを生成するためにプールすることができます。我々はまた、標的遺伝子の欠失を有するトランスジェニック材料を製造するための効率的な方法として、トマト毛状根を生成するためのプロトコルを提示します。毛状根を有効に使用されていますCRISPRベクトルを食べ、その後の実験のための材料を提供します。

<table><tbody><tr><td>NEBuilder&reg;(HiFi DNAアセンブリミックス)</td><td>New England Biolabs</td><td>E5520</td><td></td></tr><tr><td>p201N:Cas9</td><td>Addgene</td><td>59175</td><td>p201H:Cas9 プラスミド (59176) も、報告されたオーバーラップおよび酵素に適合します。</td></tr><tr><td>pUC gRNA シャトル</td><td>Addgene</td><td>47024</td><td></td></tr><tr><td>SwaI</td><td>ニューイングランド バイオラボ</td><td>R0604S</td><td></td></tr><tr><td>SpeI</td><td>ニューイングランド バイオラボ</td><td>R0133S</td><td></td></tr><tr><td>ザイモ クリーン コンセントレータ-5 カラム精製</td><td>ザイモ リサーチ</td><td>D4003</td><td></td></tr><tr><td>NEB バッファー 2.1</td><td>ニュー イングランド バイオラボ</td><td>B7202S</td><td></td></tr><tr><td>NEB CutSmart (Buffer 4)</td><td>New England Biolabs</td><td>B7204S</td><td></td></tr><tr><td>NEB Buffer 3.1</td><td>New England Biolabs</td><td>B7203S</td><td></td></tr><tr><td>EconoSpin Mini Spin Column (plasmid prep)</td><td>Epoch Life Sciences</td><td>1910-050/250</td><td></td></tr><tr><td>EcoRV-HF&reg;</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>R3195S</td><td></td></tr><tr><td>StyI-HF&reg;</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>R3500S</td><td></td></tr><tr><td>MS塩+ Gamborgビタミン</td><td>植物技術研究所</td><td>M404</td><td></td></tr><tr><td>フィタゲル&貿易;(ジェランガム)</td><td>シグマAldrich</td><td>P8169</td><td></td></tr><tr><td>GA-7ボックス</td><td>シグマAldrich</td><td>V8505</td><td></td></tr><tr><td>マイクロポア&trade;外科用テープ</td><td>3M</td><td>1535-0</td><td></td></tr><tr><td>Timentin&reg;(チカルシリン/クラブラン酸)</td><td>各種</td><td>0029-6571-26</td><td></td></tr><tr><td>プライマー 5' &#8594; 3'SwaI_MtU6F</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>GATATTAATCTCTTCGATGA AATTTATGCCTATCTTATTAT GATCAATGAGG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MtU6R&nbsp;&nbsp;</td><td>AAGCCTACTGGTTCGCTTG AAG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>足場F&nbsp;</td><td>GTTTTAGAGCTAGAAATAGC AAGTT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SpeI_Scaffold R</td><td>GTCATGAATTGTAATACGACTC AAAAAAAAGCACCGACTCGGTG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>StUbi3P218R&nbsp;</td><td>ACATGCACCTAATTTCACTA GATGT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ISceIR</td><td>GTGATCGATTACCCTGTTAT CCCTAG</td> プラスミド<td></td>UNS1_Scaffold R&nbsp<td>に第2の結合部位があるため、サンガーシーケンシングには使用できません</td></tr><tr><td>。</td><td>GAGAATGGATGCGAGTAATGAA AAAAAGCACCGACTCGGTG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UNS1_MtU6 F&nbsp;&nbsp;</td><td>CATTACTCGCATCCATTCTCAT GCCTATCTTATATGATCAATGAGG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>p201R&nbsp;</td><td>CGCGCCGAATTCTAGTGATCG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>太字のシーケンスは、線形化されたp201N:Cas9との20-ntのオーバーラップを示しています。</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

トマト毛状根の発生によるdnaの修飾のハイスループットcrisprベクター構築と特性

High-throughput CRISPR Vector Construction and Characterization of DNA Modifications by Generation of Tomato Hairy Roots

クラスター化された規則的な間隔を空けた短い回文反復配列(CRISPR)/Cas9技術を持つベクターによって生成された標的DNA変異は、機能ゲノミクス研究に有用であることが証明されています。ほとんどのクローニング戦略は簡単に実行できますが、一般的には複数のステップを使用し、最終的なコンストラクトを生成するのに数日かかる場合があります。ここで紹介する方法は、DNAアセンブリに基づいており、1回のクローニング反応で完全に機能するCRISPRベクターを作製できます。ベクトル構築もプールできるため、プロセスの効率と有用性がさらに向上します。この方法の改良版は、複数の遺伝子標的を持つCRISPRベクターを作成するために使用されます。その後、CRISPRベクターをトマトの毛根に変換して、標的DNA修飾を持つトランスジェニック材料を生成します。毛深い根は、技術的に生成が簡単で、大規模な生産に適しているため、ベクターの機能をテストするのに便利なシステムです。ここで紹介する方法は、さまざまなCRISPRベクターの生成に使用でき、幅広い植物種に使用できるため、幅広い用途があります。

DNAアセンブリとCRISPRベクター構築は、一般的に独立したクローンの数十〜数百を生成します。 PCRによるコロニーのスクリーニングは簡単なトラブルシューティングのために有用である（ 図2A）の正確なクローンを識別し、インサートを有するとせずに、プラスミドを区別することができます。一般的に、クローンのすべては、インサートを含み、ユーザが完全にコロニースクリーニングのステップをスキップすることを選ぶことができます。診断消化物（ 図2B）およびサンガー配列決定は、品質管理のために使用されます。エラーが発生した場合、それらは通常、重複するDNA領域において観測される、すなわち 、5 &#39;MtU6プロモーターの端、gRNA、または3&#39;骨格配列の終わり。複数gRNAオリゴは、単一の反応にプールされている場合は、gRNAsは、サンガー配列決定によって決定されます。個々 gRNAsの取り込みを均一に分布され、gRNAsのほとんどは、単一の変換（ 図2C</strong...

DNAアセンブリを使用して、複数のCRISPRベクトルが単一クローニング反応に並列に構築することができ、CRISPR多数の構造を作ることは簡単な作業ベクトル。トマト毛状根は、CRISPRベクトルを検証し、突然変異体材料を生成するための優れたモデルシステムです。

トマト毛状根の発生によるDNAの修飾のハイスループットCRISPRベクター構築と特性

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for ...

このクローニングおよび形質転換手順の全体的な目的は、機能ゲノミクス研究に使用可能なCRISPRベクターおよびノックアウト変異トマト根を効率的に作製することです。この手法は、さまざまな根のプロセスに利用できる大量のノックアウト変異体を生成できるため、植物ゲノミクスの分野において有用なツールとなります。本技術の主な利点は、クローニング手順を単一のステップで完了でき、わずか数週間で目的の材料を入手できる点にあります。まず、DNAアセンブリに必要な5'側および3'側の20ヌクレオチド配列で挟まれた標的モチーフのGN19部分を含む、ガイドRNA（gRNA）オリゴを設計します。1～5 µgのP201N caznineプラスミドを、制限酵素Spe1を用いて37 °Cで2時間消化します。製造元の指示に従って消化物をカラム精製した後、10 mM Tris-HCl 15 µLに再懸濁します。UV分光光度計を用いてDNA量を定量します。制限酵素Swa1を用いて、25 °Cで2時間、2回目の消化を行います。0.8%アガロースゲルに100〜200 ngを泳動させ、完全に消化されていることを確認します。正しく消化されたプラスミドは、14,313 base pairsに単一のバンドを示します。Medicago truncatulaをPCR増幅させるには、puck gRNAシャトルプラスミドから6つのプロモーターおよびスキャフォールドDNAを使用します。高正確性ポリメラーゼを用い、プライマーとしてSwa1、Mtu6FおよびMTU6R、ならびにscaffold FおよびSpe1 scaffold Rを使用してください。増幅を確認するため、3 µLずつのPCR産物を1%アガロースゲルで電気泳動し、可視化します。MTU6アンプリコンは377 bp、スキャフォールドアンプリコンは106 bpです。残りのPCR産物は、製造元の指示に従ってカラム精製します。前述と同様にUV分光光度計を用いて定量し、-20 °Cで保存する。次に、gRNAオリゴヌクレオチドの全量を、ラボグレードの水を用いて100 µMに再懸濁する。このオリゴヌクレオチド1 µLを1x NEB buffer 2.1 500 µLに加え、十分に混合する。加熱リッド付きのサーマルサイクラーを50 °Cに保持するように設定します。直線化されたベクター 100 ng、MtU6プロモーター 50 ng、Scaffold 12 ng、および水で希釈したgRNAオリゴ 1 µLを混合し、最終容量を 5 µLにします。そこに2X high fidelity DNA Assembly Mastermixを 5 µL加えます。よく混ぜて遠心分離します。50 °Cに設定したサーモサイクラーで、反応液を60分間インキュベートします。50 °Cで1時間インキュベートした後、反応液を氷上に置き、標準的な手法を用いて2 µLをコンピテントE.coli細胞に形質転換させます。50 mg/mLのカナマイシンを添加したLB Agar培地に形質転換物をプレートし、37 °Cで一晩インキュベートする。プライマーStUb3p 218Rおよび1Sce1Rを用いたPCRによりコロニースクリーニングを行う。残ったDNAアセンブリ反応液の一部を水で1:5に希釈し、コロニースクリーニングのポジティブコントロールとして1 µLを使用する。また、インサートなしのコントロールとして、1 ngの環状P201N casnineプラスミドを加えてください。プロトコルの文書部分に記載されているパラメータを用いてPCR増幅を行った後、1%アガロースゲルでPCR産物を可視化します。正しくインサートが挿入されている場合は725 bpのバンドが現れ、インサートのないベクターの場合は310 bpのバンドが現れます。LB Can50液体培地を用いて、ポジティブコロニーを37°Cで一晩培養します。翌日、プラスミド精製キットを用い、製造元の指示に従ってプラスミドを精製します。精製したプラスミドをStuB3P218Rプライマーでサンガーシーケンシングし、得られたクロマトグラムをMtU6プロモーター、Target、およびスキャフォールド配列とアラインメントさせ、クローニング中にエラーが導入されていないことを確認します。1 µgのプラスミドをEcoR5およびSti1で消化し、診断的制限酵素消化を行います。0.8%アガロースゲルで電気泳動した際、このバンドパターンが観察されるはずです。最後に、プラスミド調製液1 µLを電気穿孔可能細胞50 µLに加え、1 mmキュベットを用いてエレクトロポレーションを行い、プラスミドをAgrobacterium rhizogenes株ARqua1に形質転換します。SOC培地を約500 µL加え、28 °Cで2時間振盪します。その後、LB Can50プレートに播種し、28 °Cで2日間培養します。手順のこのセクションを開始する前に、トマトの種子を20 %の家庭用漂白剤で15分間、絶えず混合しながら滅菌します。その後、種子をラミナーフローフードに移動させます。漂白剤を除去し、滅菌済みの実験用精製水で3回洗浄します。1/2 MS培地を含むGA7ボックスに、種子を30粒播種します。暗所で約2日間発芽させます。種子が発芽したら、GA7ボックスを明所に移動させます。形質転換の前日に、Can50を含むLB固体培地にA.rhizogenes培養物をストリークし、28°Cで一晩培養します。形質転換当日、ラミナーフローフード内で、50 mLの1/2 MS培地に25 µLのアセトシリンゴンを添加し、各培養チューブに6 mLずつ分注します。曲げた200 µLチップを使用して、プレートからA.rhizogenes細胞を掻き取り、6 mLの1/2 MS液体培地で再懸濁します。チューブをボルテックスし、細胞を完全に再懸濁させます。各ベクターの細胞を再懸濁した後、細胞懸濁液を1 mL分取り、600 nmの固定波長で吸光度を測定します。滅菌済みのろ紙を入れたペトリ皿に、0.5倍MS液を2 mL加えます。苗から子葉を切り出し、湿らせたろ紙の上に置きます。すべての子葉を回収した後、子葉の先端側1 cmを切り取り、両端が切断された子葉片を作成します。外植え組織をA.rhizogenes溶液に加え、混合する。時折転倒混和しながら20分間インキュベートする。A.rhizogenesのインキュベーション中に、各コンストラクト形質転換用のシャーレにフィルターペーパーを1枚ずつ入れる。また、抗生物質を含まない1/2 MS 固形培地をラミナーフローフード内に設置し、乾燥させておく。滅菌したピンセットを使用して、子葉を A.rhizogenes 溶液から取り出し、乾燥したろ紙の上に置く。次の形質転換に進む間、組織が乾燥しないようにシャーレの蓋で覆う。次に、子葉をろ紙で吸い取り、腹側を上にして1/2 MS培地に移します。プレートをサージカルテープで密閉し、室温・暗所で2日間共培養します。共培養後、子葉を腹側を上にした状態で、添加剤入りの1/2 MS培地に移します。サージカルテープで巻く。室温にて、16時間の光周期の蛍光灯下で培養を維持する。1.5〜2週間後、滅菌済みのピンセットとメスを用いて、子葉から長さ2 cm以上の根を切り出し、Ticarcillon/Clavulanate AcidおよびKanamycinを添加した1/2 MS培地に移植する。10～15本の根を1枚のプレートに移します。マーカーで根端の位置を印付けします。サージカルテープで巻き、培養室で維持します。1週間後、選択培地上で形質転換根の成長が確認されます。好みのDNA抽出法を用いてDNA抽出を行うため、形質転換根の一部を採取します。形質転換から11日後には、子葉からヘアリールートが出現しているのが確認できます。根は、Ticarcillon/Clavulanate AcidおよびKanamycinを添加した1/2 MS培地で約1週間選択されます。灰色のバーは、播種時の根端の位置を示しています。これは、4つの異なるヘアリールートイベントにおいて、2つの異なる標的遺伝子を用いてDNA変異を決定するためのPCR産物のクローニングおよびシーケンシングの例です。灰色のボックスはGN20 GGターゲット配列を示し、deltaは変異のタイプを示しています。指定された変異を持つクローンの数は右側に示されています。これは、DNA変異を判定するためのポリアクリルアミドゲルの例です。大きな欠失およびヘテロ二本鎖バンドは、標的配列におけるDNA変異の存在を示しています。12件の独立したイベントのうち6件が、デルタ記号で示されるように変異体として判定されました。WTは野生型コントロールを、NTはテンプレートなしコントロールを示しています。この手法を習得すれば、1週間で数十から数百種類のCRISPRベクターを作製でき、数週間でトレンドレット群の材料を得ることが可能です。この手順を行う際は、残留しているAgrobacteriumを完全に除去し、その増殖を抑制することが重要です。Agrobacteriumが過剰に増殖すると、根の組織の成長が阻害され、死滅してしまいます。このビデオを視聴することで、DNAアセンブリを用いたCRISPRベクターの作製方法、および hairy root モデルシステムとトマトを用いたそれらのベクターの検証方法について深く理解することができます。

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Biology

生物学

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トマト毛状根の発生によるDNAの修飾のハイスループットCRISPRベクター構築と特性

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