単離とマウス大動脈の切除。心血管疾患の研究で多彩なテクニック
2014年11月24日
大動脈の病理は、重篤な罹患率と死亡率につながる可能性があるため、疾患の進行と潜在的な治療法の研究が必要です。ここでは、研究者が心血管疾患の調査を支援するために、マウス大動脈を分離して切除するプロトコルを紹介します。
この手順の全体的な目標は、マウス大動脈をスターリー、分離、および切除することです。これは、最初に胸腔と腹腔を露出させることによって達成されます。2番目のステップは、冷たく滅菌された生理食塩水で灌流することです。
次に、胸腔と腹腔の臓器が取り除かれ、心臓が大動脈に付着したままになります。最後のステップは、大動脈から血管周囲脂肪組織と外降組織を切除することです。最終的には、解剖顕微鏡を使用して周囲の組織がすべて除去されたことを確認し、大動脈をさまざまな実験分析に使用できます。
したがって、この手法は、動脈瘤の発生やアテローム性動脈硬化症プラークの形成など、心血管研究分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。ですから、遺伝子やタンパク質の発現など、分子生物学の変化を見ることで、それらを調べることができます。マウスを安楽死させた後、つま先をつまんで安楽死状態を確認します。
次に、腹部の被毛を70%エタノールで濡らして皮膚を滅菌します。次に、付属肢を伸ばした状態でマウスを仰向けの手術ボードに固定します。鉗子を使用して、剣状突起より少し劣った腹部の皮膚を見つけて分離することから手術を開始します。
次に、皮を持ち上げ、ハサミで切り落とします。これにより、腹膜の上部と下胸腔が露出するはずです。次に、鉗子とはさみを使用して、剣状突起を持ち上げ、肋骨下縁に沿ってそれよりわずかに劣る横方向の切開を行います。
胸腔を解剖するには、その過程で心臓や主要な血管を傷つけないように注意しながら、横隔膜から入ります。現在、頭蓋は肋骨下縁に沿って側方切開を延長します。したがって、胸郭の前部を取り外します。
これらの切開を完了するには、胸壁の前部から心臓を切除するための鈍的解剖が必要になる場合があります。次に、ガーゼを使用して、余分な水分の胸腔をきれいにし、臓器にアクセスしやすくします。次に、鉗子とハサミを使用して肺をローブごとに取り除きます。
その後、心臓と大動脈を完全に露出させ、心臓穿刺を介して血液を採取するために簡単にアクセスする必要があります。心臓を灌流するための灌流を進める前に、10ccの注射器に10ミリリットルの滅菌氷冷XPBSを満たしてください。次に、25ゲージの針を取り付けます。
針を左心室に慎重に挿入します。次に、次のステップで循環器系に過度の圧力が蓄積しないように、右心房を切開します。次に、次の2〜3分で、PBSを注射器から心臓にゆっくりと排出します。
PBS排出中は、滅菌ガーゼを使用して、切開部で心房から注がれる液体を吸収します。PERFUSE eightがすべて排出されたら、胸腔のきれいな視界を遮るガーゼで残りの液体を吸収します。消化管の内容物を露出させるには、腹壁をこっそりと切り取り、切開部を恥骨上領域まで伸ばします。
そこに一度、下肢に向かって両側に切って皮膚のフラップを作り、ピンで留めたり切除したりできます。次に進むと、いくつかの臓器、肝臓の葉、膵臓、脾臓、腸、下部食道が取り除かれます。これにより、大動脈への視界が広がります。
この領域には大動脈から腎動脈への表在枝があるため、ペレン領域を解剖する際には特に注意してください。消化管の細菌が他の組織を汚染し、片付けられた部分を1つのXPBSで洗い流し、ガーゼで余分な溶液を吸収する可能性があるため、この解剖は正確かつ慎重に行ってください。したがって、はさみと鉗子を使用して、大動脈を脊椎から分離します。
鈍器解剖が適切であり、解剖顕微鏡の使用を強くお勧めします。大動脈は、コドリーまたはクランから取り外すことができます。重要なのは、組織を洗浄し、分離する整然とした植物プロセスです。
血管周囲脂肪組織を解剖するときは、大動脈壁の損傷を避けるために、細いマイクロハサミを使用してそれを取り除きます。これにより、大動脈平滑筋細胞を培養する際の線維芽細胞汚染の可能性が最小限に抑えられます。血管周囲組織、脂肪組織、および外膜の慎重な切除は非常に重要です。
残った組織は、細胞培養に汚染を引き起こすだけでなく、分子アッセイに偏りを与える可能性もあります。この手順を使用すると、心臓に由来する無傷の大動脈が胸腔と腹腔に下降します。腎動脈が付着したままの状態で、腹部大動脈瘤の研究において診断的である形態測定の変化を定量化するために、大動脈をその場で画像化することができます。
その後、大動脈を切除し、固定し、染色してヘマット、トイン、エオイン染色などの組織学的変化を観察したり、ベラスチンバンドを見て大動脈の構造的完全性を見るためにver Hoff Van Geen染色を行うことができます。大動脈細胞は、初代細胞の単離や、生存率研究やタンパク質局在化などのin vitro研究にも使用できます。手順に続いて、タンパク質やRNAの単離などの他の手法を使用して、タンパク質の発現、酵素活性、および遺伝子の発現を調べることができます。
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概要
本記事では、心血管疾患の研究において極めて重要な、マウス大動脈の単離および摘出プロトコルを紹介します。大動脈の病理を理解することは、罹患率および死亡率への影響があるため不可欠です。
研究の主要構成要素
科学分野
- 心血管疾患
- マウスモデル
- 病理学研究
背景
- 大動脈の病理は深刻な健康問題を引き起こす可能性があります。
- 疾患の進行に関する研究は、治療法の開発において極めて重要です。
- 大動脈を単離することで、詳細な実験的解析が可能になります。
- 本プロトコルは、研究者の調査を支援するものです。
研究目的
- マウス大動脈を分離するための信頼性の高い手法を提供すること。
- 心血管疾患の研究を促進すること。
- 大動脈の病理学的理解を深めること。
使用された手法
- 胸腔および腹腔を露出させます。
- 冷たい滅菌生理食塩水で灌流します。
- 心臓を大動脈に付着させたまま、他の臓器を摘出します。
- 大動脈から血管周囲脂肪組織および外膜組織を除去します。
主な結果
- マウス大動脈の分離に成功すること。
- 解剖顕微鏡を用いて、周囲の組織が完全に除去されていることを確認すること。
- さまざまな実験的解析に向けて大動脈を調製すること。
結論
- 本プロトコルは、大動脈分離のための体系的なアプローチを提供する。
- この手法は、心血管研究に大きく貢献し得る。
- 今後の研究において、この基礎的な技術を応用することが可能である。
よくある質問
産業界における重要性
マウス大動脈の単離により、前臨床モデルにおける血管病理の直接的な評価が可能となり、心血管系薬剤開発におけるターゲットバリデーションおよびメカニズム的なリスク低減を支援します。本手法は、定量的形態計測および分子レベルのリードアウトを提供し、初期段階の治療評価における予測的信頼性を向上させます。再現性のある組織調製を容易にすることで、創薬から前臨床バリデーションに至るトランスレーショナルな連続性を強化します。
バイオファーマR&Dにおける戦略的応用
初期発見とターゲットバリデーション
- 科学的価値： 大動脈組織の解析を可能にし、アテローム性動脈硬化および動脈瘤モデルにおける疾患メカニズムの解明と治療標的の検証を実現します。
- 運用的価値： 分離組織におけるタンパク質および遺伝子発現の分子解析を通じて、機能的な標的検証をサポートします。
- 予測的価値： 標的への結合（ターゲット・エンゲージメント）および経路変調の直接的なリードアウトを提供することで、ポートフォリオの優先順位付けを強化します。
スクリーニングおよびアッセイの開発
- 科学的価値：生存能研究やタンパク質の局在化などの後続アッセイに向けて、検証済みの大動脈組織を調製する。
- 運用の価値：in vitroシステムにおける再現性のある化合物評価のために、組織調製の標準化を可能にする。
- 拡張性：組織学、分子プロファイリング、一次細胞の単離など、複数の実験的読み取り項目にわたるプラットフォームの再利用をサポートする。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 科学的価値：大動脈の構造を維持することで、組織学的解析およびエラスチンバンド解析における疾患との関連性を保持する。
- 運用的価値：一貫した組織標本作製を可能にすることで、探索段階から前臨床検証までの連続性を確保する。
- リスク軽減：腹部大動脈瘤の診断根拠となる定量的な形態計測学的変化を通じて、リスク調整後の進展判断を支援する。
パイプラインおよびワークフローの統合
大動脈の単離技術は、ディスカバリー・コンティニュアム（創薬の連続的プロセス）に適合しており、初期創薬における仮説検証、スクリーニングにおけるアッセイの準備、および前臨床評価における定量的分析を支援します。
- 探索生物学：直接的な組織解析を通じて、仮説検証およびパスウェイの解明を促進します。
- スクリーニング：標準化された組織調製および交絡要因となる血管周囲組織の除去により、アッセイの準備を可能にします。
- 分析学：条件間の比較解析のための、定量的な形態計測および分子測定を提供します。
- トランスレーショナルリサーチ：組織学的染色およびエラスチンバンドの評価を通じて、前臨床研究への継続性を確保します。
- エンタープライズ再利用：複数のプロジェクトにわたる心血管病理学研究において、再利用可能な機能として活用できます。
運用および企業への影響
- 科学的価値：大動脈病理と標的修飾を直接評価することによる予測信頼性の向上。
- 運用上の価値：分子および組織学的解析に向けた組織調製における標準化と再現性の確保。
- 戦略的価値：心血管モデルにおける生物学的不確実性の低減による、go/no-go判断の改善。
- ポートフォリオへの影響：定量化可能な大動脈の構造的および機能的リードアウトに基づいた、リスク調整後の優先順位付け。
実施上の検討事項
- マウスの解剖および無菌的な組織操作に関する専門知識が必要です。
- 精密な組織分離のため、解剖顕微鏡および外科手術器具に依存します。
- 灌流および摘出プロトコルのチーム間での標準化が必要です。
- 異なる疾患モデルや系統背景に適用する場合、適応に関する検討が必要です。
- 本手順は終末的な操作であるため、サンプルごとに動物を犠牲にする必要があるという制限があります。
