ケルビンプローブフォース顕微鏡を用いて細菌の表面電位測定
2014年11月28日
ここでは、高解像度のナノスケール表面電位マップを生成するためのツールとしてのケルビンプローブ力顕微鏡の使用を説明するプロトコルを提示します。このツールは、微生物の基質表面への結合能力に対する表面電位の役割を評価するために適用されました。
次の実験の全体的な目標は、異なる材料基板に付着した後の細胞膜電荷の変化を観察することです。これは、微生物を栄養豊富な培地で培養してその数を増やすことによって達成されます。次に、微生物が付着する材料表面は、最適な微生物の付着率を得るために洗浄され、機能化されます。
次に、微生物をさまざまな材料基板に播種して、ケルビンプローブフォース顕微鏡またはKPFMイメージングを可能にします。その結果、材料基質の種類とその固有の電荷が、細胞膜の電荷と細胞接着の変化に見られるように、細胞活性に影響を与えることが示されています。電気泳動、光散乱、等電点測定などの既存の方法に対するこの手法の主な利点は、KPFMが培養全体やコロニーではなく、個々の細胞やバイオフィルムの電荷を検査できることです。
これは、細胞間およびバイオフィルムの電気的特性を高精度かつ高精度に比較したい場合に有益です。まず、5%羊の血液寒天培地プレートを調製し、調製したプレートにMRSA細菌を縞模様にし、摂氏37度で24時間インキュベートして、単一のよく分離されたコロニーを生成します。500ミリリットルの三連祭壇画大豆ブロスを作り、1%グルコースと0.1%塩化ナトリウムオートクレーブを補給し、2本のきれいなガラス試験管と1ミリリットルのピペットシップの1箱を補給します。
培地と試験管をバイオセーフティキャビネットの下またはパンとバーナーの近くで冷却した後、6ミリリットルのTSBを各試験管にピペットで入れます。事前に調製したヒツジの血液寒天プレートの1つを使用して、MRSAの単一コロニーをチューブの1つに接種します。2本目のチューブをネガティブコントロールとして使用し、無菌性を確保するため、チューブをレシプロカルインキュベーターで摂氏37度、200RPMで24時間インキュベー
トします。MRSAチューブは成長を示すか、コントロール試験管で何も成長していないはずです。次に、24時間培養から1ミリリットルを使用して6ミリリットルの新鮮なトリプシン大豆ブロスを接種し、摂氏37度と200RPMでさらに6時間インキュベートすることにより、継代培養を作成します。次に、培養物1ミリリットルをAFUSチューブにピペットで移し、Gの850倍で3分間遠心分離します。
仰臥位を取り外し、脱イオン水を使用して、利き手で鉗子でペレットを2回洗います。20ミリメートルのステンレス鋼FMサンプルディスクを保持し、5ミリリットルの脱イオン水を使用して各面を洗浄します。きれいなディスクを脱イオン水のビーカーに入れ、超音波処理後1分間超音波処理します。
鉗子を使用してサンプルディスクをビーカーから取り外し、ペーパータオルの上の開いたペトリ皿の端に対して約60度の角度で傾けます完全に乾かすには、皿の蓋を使用して乾燥ディスクを覆います。乾いたら、ディスクをペトリ皿に移して、ディスクの表面を機能化します。バイオセーフティキャビネット内のディスクに0.1%ポリオールリジンの200〜400マイクロリットルをピペットで固定し、鉗子を使用して室温で1時間ディスクを保持します。
このビデオで前述したように、脱イオン水を使用してそれらを洗います。次のプレートは、コーティングされたサンプルディスクに2回洗浄された200〜400マイクロリットルの再懸濁細胞です。室温で30分間インキュベートした後、1ミリリットルの脱イオン水を使用してディスクを洗浄します。
ケルビンプローブフォース顕微鏡イメージングを実施するために、イメージングを行う前にディスクを一晩乾燥させます。原子間力顕微鏡またはAFM、HEB、MACの3つのコントローラーと一緒にコンピューターの電源を入れます。Ulence P ovu overviewなどのAFMイメージングソフトウェアを開きます。
A-C-A-F-Mを選択するか、間欠接触モードでのイメージングの正しい指定を選択します。利き手でFM鉗子を使用し、もう一方の手でスプリング式クリップホルダーを開いたまま、A-K-P-F-Mカンチレバーをヘッドピースに慎重に置きます。ヘッドピースをAFMに慎重にロードし、レーザーライトとステージリフトモーターのワイヤーを接続します。
次に、レーザーをカンチレバーの先端に合わせます。レーザーをカンチレバーの先端に合わせます。ノブを前後に時計回りに数回回して、カンチレバーチップの上にあるレーザーを動かします。
レーザーがチップに到達すると、チップはブロックされ、見えなくなります。次に、レーザースポットが再び現れるまで、ノブを反時計回りに前後に回します。レーザーはチップの端にあります。
ノブを左から右に回して、レーザーをカンチレバーに配置します。レーザーがカンチレバーを通過すると、レーザーは消えては急速に連続して再表示されます。レーザースポットは、フォトダイオードユニットが後で座るすりガラスカバーに見えるはずです。
ノブを反時計回りに回して、すりガラスのスポットが消えるまで、スポットをカンチレバーから先端に向かって動かします。次に、レーザーをカンチレバーの先端にちょうど座るように配置するために、ノブを前後に時計回りに少しだけ回すと、レーザースポットがすりガラスに再び現れます。レーザーの位置が整列したら、ステージリフトモーターを開いた位置に10秒間保持して、カンチレバーとサンプルの間に十分なスペースを確保します。
サンプルをA FMにアタッチするときは、サンプルをKPFMステージに置きます。銅線を使用してサンプルを接地し、AFMからサンプルステージに適切なワイヤを接続します。次に、ステージをAFMソフトウェアでAFMに接続します。
設定時間が10ミリ秒以下であること、およびアプローチ速度が毎秒2ミクロンを超えないようにしてください。チップの損傷を避けるために、カンチレバーを調整し、カンチレバーの先端をサンプルに向かって動かし始めます。カンチレバーの先端がサンプル表面に到達したら、イメージングウィンドウサイズと理想的なイメージング領域を選択し、カンチレバーの設定値とともにアイゲインとPゲインを最適化して、トポグラフィーイメージングが最適化されるようにします。
トポグラフィーイメージングが最適化されたら、FMモードでKPFMモジュールの電源を入れます。イメージングウィンドウを5ミクロン×5ミクロンに設定し、解像度は5、12、5、12、またはスキャン速度を遅くします。FM KPFM設定の場合、ドライブを5〜10%に設定します。ドライブ周波数を1〜5キロヘルツに設定し、帯域幅を2キロヘルツに設定します。
F-M-K-P-F-Mの鉄NPゲインを0.3%に設定します KPFM画像を取得した後、ポストイメージング処理ソフトウェアを使用して画像を解析し、このビデオデモで概説されている設定を使用してSPデータを収集します。KPFM画像は、ステンレス鋼と金の両方の表面にある15個のMRSAセルで撮影されました。ここでは、収集される画像の種類を示します。
KPFMはデュアル周波数で動作するため、セル表面のトポグラフィー画像と電気データを同時に収集しました。表面電位マップにサーマルフィルターを適用して、表面電位の小さな変化をより簡単に識別できるようにしました。このグラフでは、画像を分析して微生物の膜表面電位を決定し、次にさまざまな基質での増殖を比較するために使用しました。
裸のステンレス鋼と裸の金基板の表面電位スキャンは、全体的に負の表面電位を示しました。ポリオールリジン被覆されたステンレス鋼と金のディスクは、どちらも正の表面電位へのシフトを示しました。MRSA細胞膜電位は、ステンレス鋼と金の表面で異なりました。
ステンレス鋼は、負の表面電位を示した金基板上のMRSA細胞と比較して、細胞の正の膜表面電位が有意に大きいことを示しました。KPFMの全機能を実証するために、ステンレス鋼上のMRSAのステップ高さグラフの例を以下に示します。これは、基板表面と微生物膜との間の表面電位の違いを示しています。
このビデオを見れば、ケルビンプローブフォース顕微鏡を使用して、さまざまな材料基板表面上の微生物細胞の付着と活動に対する電荷の影響を調べる方法について十分に理解できるはずです。
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概要
この研究では、ケルビンプローブ力顕微鏡（KPFM）を使用して高解像度のナノスケール表面電位マップを作成するためのプロトコルを提示します。この技術は、表面電位が様々な基質表面への微生物の結合能力にどのように影響するかを調査するために適用されます。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 微生物学
- 表面科学
背景
- 微生物は異なる材料基質に様々な付着性を示します。
- 表面電位は微生物の付着に重要な役割を果たします。
- 従来の方法は個々の細胞の特性ではなく、全体的な特性を評価します。
- KPFMは個々の細胞やバイオフィルムの電荷に関する洞察を提供します。
研究目的
- 異なる基質への付着後の細胞膜電荷の変化を観察すること。
- 基質の電荷が微生物の付着率に与える影響を評価すること。
- KPFMが既存の方法に比べて有利であることを示すこと。
使用された方法
- 栄養豊富な培地中で微生物を培養すること。
- 最適な付着のために材料表面を洗浄および機能化すること。
- 様々な基質上で微生物をプレートに塗布すること。
- 細胞膜電荷のイメージングと分析にKPFMを利用すること。
主な結果
- 材料基質の種類が細胞活性と付着性に影響を与えること。
- 細胞膜電荷の変化が基質の特性と相関すること。
- KPFMが個々の細胞特性の詳細な検討を可能にすること。
- この技術は特異性において従来の方法を上回ること。
結論
- KPFMは表面との微生物相互作用を研究するための強力なツールです。
- 表面電位の理解は、より良い微生物付着のための材料設計に役立ちます。
- この方法はナノスケールでの微生物行動を調査する能力を向上させます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Kelvin probe force microscopy (KPFM) enables nanoscale measurement of microbial membrane surface potential, providing critical insights into electrostatic interactions that govern bacterial adhesion to biomaterials. This capability supports target validation in anti-infective development by de-risking mechanistic hypotheses about surface-mediated pathogenesis. The technique offers predictive value for screening antimicrobial coatings and implant materials by quantifying cell-surface charge dynamics at single-cell resolution.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses linking microbial membrane charge to adhesion mechanisms on medically relevant surfaces.
- Operational Value: Enables functional target validation by correlating surface potential changes with cellular metabolism and motility phenotypes.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying surface properties that modulate pathogenic biofilm formation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream antimicrobial screening by mapping surface potential heterogeneity.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible quantitative outputs for assay optimization across material substrates.
- Scalability: Facilitates platform reuse for evaluating lead compounds against adhesion-resistant strains.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-stage surface potential metrics to preclinical validation of anti-adhesion therapeutics.
- Risk-Adjusted Decisions: Informs advancement criteria by linking membrane charge shifts to reduced biofilm burden on implant materials.
- Mechanistic De-risking: Focuses on predictive de-risking of surface-targeted interventions through nanoscale charge mapping.
Pipeline & Workflow Integration
KPFM integrates into the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification to preclinical efficacy assessment, particularly for anti-infective programs targeting microbial adhesion.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of charge-mediated adhesion pathways and biological de-risking of surface targets.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized surface potential mapping and topographical correlation.
- Analytics: Provides quantitative surface potential readouts and step-height graphs that enable condition comparison and hit selection.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by linking membrane potential changes to reduced adherence on functionalized surfaces.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for screening material libraries and compound effects on microbial electrostatic interactions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation, reduction of mechanistic ambiguity in adhesion mechanisms.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of single-cell electrostatic measurements.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions on antimicrobial coatings, capital efficiency in biomaterial screening, reduced late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of leads based on surface charge modulation efficacy.
Implementation Considerations
- Requires expertise in atomic force microscopy, KPFM operation, and nanoscale electrical data interpretation.
- Dependent on AFM instrumentation with KPFM module, conductive probes, and vibration isolation for stable measurements.
- Necessitates cross-team standardization of sample preparation, substrate functionalization, and environmental controls.
- Involves adaptation considerations for varying microbial strains, biofilm states, and substrate material properties.
- Practical limitations include sample dehydration artifacts and the need for conductive substrate coating for non-conductive materials.
