ケルビンプローブフォース顕微鏡を用いて細菌の表面電位測定

本実験の全体的な目的は、異なる材料基材への接着後に細胞膜電荷に生じる変化を観察することである。これは、微生物を栄養豊富な培地で培養して個体数を増やすことで達成される。次に、微生物が接着する材料表面を洗浄し、微生物の最適な付着率を得るために機能化を行う。

次に、ケルビンプローブフォース顕微鏡（KPFM）によるイメージングを行うため、微生物をさまざまな材料基板上にプレートします。その結果、材料基板の種類およびその固有の電荷が、細胞膜電荷および細胞接着の変化として観察される細胞活性に影響を与えることが示されました。電気泳動法、光散乱法、等電点決定法などの既存の手法に対する本手法の主な利点は、KPFMを用いることで、培養液全体やコロニーではなく、個々の細胞やバイオフィルムの電荷を検討できる点にあります。

これは、細胞間およびバイオフィルムの電気的特性を高精度かつ精密に比較したい場合に有用です。まず、5%羊血液寒天培地を準備し、そこにMRSA細菌を画線して37°Cで24時間培養し、単一の分離コロニーを形成させます。1%グルコースと0.1%塩化ナトリウムを添加したトリプチカ・ソイブロスを500 mL調製し、オートクレーブで滅菌します。あわせて、清潔なガラス製試験管2本と、1 mLピペットチップ1箱を準備してください。

バイオセーフティキャビネット内またはブンゼンバーナーの付近で培地と試験管を冷却した後、TSBを各試験管に6 mLずつ分注します。あらかじめ準備した羊血寒天培地プレートを用い、MRSAの単一コロニーを試験管の1つに接種します。2本目の試験管は、無菌状態を確認するための陰性対照として使用します。試験管を往復回転式インキュベーターに入れ、37 °C、200 RPMで24時間培養します。

MRSA試験管では菌の増殖が認められるはずであり、対照試験管では何も増殖していないはずです。次に、24時間培養液から1 mLを用いて、6 mLの新鮮なトリプチケース大豆カゼイン液（TSB）に接種して継代培養を行い、37 °C、200 RPMでさらに6時間培養します。その後、培養液1 mLを遠心管に移し、850 ×gで3分間遠心分離します。

上清を除去し、利き手のピンセットを用いて、ペレットを脱イオン水で2回洗浄します。20 mmのステンレス製FMサンプルディスクを保持し、5 mLの脱イオン水で両面を洗浄します。洗浄したディスクを脱イオン水の入ったビーカーに入れ、1分間超音波処理を行います。

ピンセットを使用して、ビーカーからサンプルディスクを取り出し、ペーパータオルの上に置いた開いたペトリ皿の縁に、約60度の角度で立てかけます。完全に乾燥させるには、皿の蓋で乾燥中のディスクを覆います。乾燥後、ディスクの表面を機能化するため、ディスクをペトリ皿に移します。バイオセーフティキャビネット内で、ピンセットでディスクを保持しながら、0.1% poly-L-lysineを200〜400 µLピペットでディスクに滴下し、室温で1時間インキュベートします。

このビデオの前の手順で示したように、脱イオン水を用いて洗浄します。次に、2回洗浄した再懸濁細胞を200～400 µL、コーティング済みのサンプルディスクに分注します。室温で30分間インキュベートした後、1 mLの脱イオン水を用いてディスクを穏やかに洗浄します。

ケルビン力顕微鏡（KPFM）によるイメージングを行う前に、ディスクを一晩乾燥させます。コンピュータを起動し、原子間力顕微鏡（AFM）、HEB、およびMAC 3コントローラーの電源を入れます。Ulence P ovu overviewなどのAFMイメージングソフトウェアを開きます。

断続接触モードでのイメージング用に、A-C-A-F-Mまたは適切な名称を選択します。利き手にFMピンセットを持ち、もう一方の手でバネ付きクリップホルダーを開いたままにして、A-K-P-F-Mカンチレバーを慎重にヘッドピースに装着します。ヘッドピースをA FMに慎重にロードし、レーザー光とステージリフトモーターの配線を接続します。

次に、レーザーをカンチレバーの先端に合わせてください。レーザーをカンチレバーの先端に合わせるため、前後の調整ノブを時計回りに数回回し、レーザーをカンチレバーチップの上に移動させます。

レーザーがチップに到達すると、遮られて見えなくなります。そこで、レーザースポットが再び現れるまで、フロント・トゥ・バックノブを反時計回りに回します。これでレーザーがチップの端に位置したことになります。

左右調節ノブを回して、レーザーをカンチレバー上に配置します。レーザーがカンチレバーを通過すると、急速に消失と再出現を繰り返します。レーザー光が、後でフォトダイオードユニットを設置する曇りガラスのカバー上で確認できる必要があります。

フロントバックノブを反時計回りに回し、すりガラス上のスポットが消えるまで、カンチレバー上のスポットをチップ方向へ移動させます。次に、フロントバックノブをわずかに時計回りに回し、レーザーがちょうどカンチレバーチップ上に位置するように調整します。すると、すりガラス上にレーザースポットが再び現れます。レーザーのアライメントが完了したら、カンチレバーとサンプルの間に十分な隙間を確保するため、ステージリフトモーターをオープンポジションのまま10秒間保持します。

サンプルをAFMに取り付ける際は、まずサンプルをKPFMステージ上に配置します。銅線を用いてサンプルを接地し、AFMからサンプルステージへの適切な配線を行ってください。その後、AFMソフトウェア上でステージをAFMに接続します。

セッティングタイムを10 milliseconds以下に、アプローチ速度を2 microns per second以下に設定してください。チップの損傷を避けるため、カンチレバーをチューニングし、チップをサンプルに向けて移動させます。カンチレバーチップがサンプル表面に到達したら、イメージングウィンドウのサイズと最適なイメージング領域を選択し、地形イメージングが最適化されるように、アイゲインとPゲイン、およびカンチレバーのセットポイントを最適化してください。

トポグラフィーイメージングの最適化が完了したら、FMモードでKPFMモジュールをオンにします。イメージングウィンドウを5 µm × 5 µmに設定し、解像度を512 × 512にするか、スキャン速度を低速に設定します。FM KPFMの設定では、ドライブを5〜10%に設定してください。ドライブ周波数は1〜5 kHzとし、帯域幅を2 kHzに設定します。

F-M-K-P-F-Mの鉄NPゲインを0.3%に設定します。KPFM画像の取得後、画像処理ソフトウェアを使用して画像を解析し、本ビデオデモンストレーションで概説した設定を用いてSPデータを収集します。KPFM画像は、ステンレス鋼および金の両方の表面上の15個のMRSA細胞に対して撮影されました。ここでは、収集された画像の種類を示しています。

KPFMは2つの周波数を用いて動作するため、細胞表面のトポグラフィ画像と電気的データが同時に収集されました。表面電位の微小な変化をより容易に判別するため、表面電位マップにサーマルフィルタを適用しました。このグラフでは、画像を解析して微生物の細胞膜表面電位を決定し、異なる基質上での増殖について比較するために使用しました。

未処理のステンレス鋼および金基材の表面電位スキャンでは、全体的に負の表面電位が示されました。ポリリシンでコーティングしたステンレス鋼および金のディスクはいずれも、正の表面電位へのシフトを示しました。MRSAの細胞膜電位は、ステンレス鋼表面と金表面で異なっていました。

ステンレス鋼は、負の表面電位を示した金基板上のMRSA細胞と比較して、細胞の膜表面電位が著しく大きな正の値を示しました。KPFMの全機能を実証するため、ステンレス鋼上のMRSAのステップ高さグラフの例をここに示します。これにより、基板表面と微生物膜の間の表面電位の差が示されます。

このビデオを視聴することで、ケルビンプローブ力顕微鏡を用いて、さまざまな材料基板表面における微生物細胞の付着および活性に電気電荷が及ぼす影響を調べる方法について、十分に理解することができます。