ケルビンプローブフォース顕微鏡を用いて細菌の表面電位測定

次の実験の全体的な目標は、異なる材料基板に付着した後の細胞膜電荷の変化を観察することです。これは、微生物を栄養豊富な培地で培養してその数を増やすことによって達成されます。次に、微生物が付着する材料表面は、最適な微生物の付着率を得るために洗浄され、機能化されます。

次に、微生物をさまざまな材料基板に播種して、ケルビンプローブフォース顕微鏡またはKPFMイメージングを可能にします。その結果、材料基質の種類とその固有の電荷が、細胞膜の電荷と細胞接着の変化に見られるように、細胞活性に影響を与えることが示されています。電気泳動、光散乱、等電点測定などの既存の方法に対するこの手法の主な利点は、KPFMが培養全体やコロニーではなく、個々の細胞やバイオフィルムの電荷を検査できることです。

これは、細胞間およびバイオフィルムの電気的特性を高精度かつ高精度に比較したい場合に有益です。まず、5%羊の血液寒天培地プレートを調製し、調製したプレートにMRSA細菌を縞模様にし、摂氏37度で24時間インキュベートして、単一のよく分離されたコロニーを生成します。500ミリリットルの三連祭壇画大豆ブロスを作り、1%グルコースと0.1%塩化ナトリウムオートクレーブを補給し、2本のきれいなガラス試験管と1ミリリットルのピペットシップの1箱を補給します。

培地と試験管をバイオセーフティキャビネットの下またはパンとバーナーの近くで冷却した後、6ミリリットルのTSBを各試験管にピペットで入れます。事前に調製したヒツジの血液寒天プレートの1つを使用して、MRSAの単一コロニーをチューブの1つに接種します。2本目のチューブをネガティブコントロールとして使用し、無菌性を確保するため、チューブをレシプロカルインキュベーターで摂氏37度、200RPMで24時間インキュベー

MRSAチューブは成長を示すか、コントロール試験管で何も成長していないはずです。次に、24時間培養から1ミリリットルを使用して6ミリリットルの新鮮なトリプシン大豆ブロスを接種し、摂氏37度と200RPMでさらに6時間インキュベートすることにより、継代培養を作成します。次に、培養物1ミリリットルをAFUSチューブにピペットで移し、Gの850倍で3分間遠心分離します。

仰臥位を取り外し、脱イオン水を使用して、利き手で鉗子でペレットを2回洗います。20ミリメートルのステンレス鋼FMサンプルディスクを保持し、5ミリリットルの脱イオン水を使用して各面を洗浄します。きれいなディスクを脱イオン水のビーカーに入れ、超音波処理後1分間超音波処理します。

鉗子を使用してサンプルディスクをビーカーから取り外し、ペーパータオルの上の開いたペトリ皿の端に対して約60度の角度で傾けます完全に乾かすには、皿の蓋を使用して乾燥ディスクを覆います。乾いたら、ディスクをペトリ皿に移して、ディスクの表面を機能化します。バイオセーフティキャビネット内のディスクに0.1%ポリオールリジンの200〜400マイクロリットルをピペットで固定し、鉗子を使用して室温で1時間ディスクを保持します。

このビデオで前述したように、脱イオン水を使用してそれらを洗います。次のプレートは、コーティングされたサンプルディスクに2回洗浄された200〜400マイクロリットルの再懸濁細胞です。室温で30分間インキュベートした後、1ミリリットルの脱イオン水を使用してディスクを洗浄します。

ケルビンプローブフォース顕微鏡イメージングを実施するために、イメージングを行う前にディスクを一晩乾燥させます。原子間力顕微鏡またはAFM、HEB、MACの3つのコントローラーと一緒にコンピューターの電源を入れます。Ulence P ovu overviewなどのAFMイメージングソフトウェアを開きます。

A-C-A-F-Mを選択するか、間欠接触モードでのイメージングの正しい指定を選択します。利き手でFM鉗子を使用し、もう一方の手でスプリング式クリップホルダーを開いたまま、A-K-P-F-Mカンチレバーをヘッドピースに慎重に置きます。ヘッドピースをAFMに慎重にロードし、レーザーライトとステージリフトモーターのワイヤーを接続します。

次に、レーザーをカンチレバーの先端に合わせます。レーザーをカンチレバーの先端に合わせます。ノブを前後に時計回りに数回回して、カンチレバーチップの上にあるレーザーを動かします。

レーザーがチップに到達すると、チップはブロックされ、見えなくなります。次に、レーザースポットが再び現れるまで、ノブを反時計回りに前後に回します。レーザーはチップの端にあります。

ノブを左から右に回して、レーザーをカンチレバーに配置します。レーザーがカンチレバーを通過すると、レーザーは消えては急速に連続して再表示されます。レーザースポットは、フォトダイオードユニットが後で座るすりガラスカバーに見えるはずです。

ノブを反時計回りに回して、すりガラスのスポットが消えるまで、スポットをカンチレバーから先端に向かって動かします。次に、レーザーをカンチレバーの先端にちょうど座るように配置するために、ノブを前後に時計回りに少しだけ回すと、レーザースポットがすりガラスに再び現れます。レーザーの位置が整列したら、ステージリフトモーターを開いた位置に10秒間保持して、カンチレバーとサンプルの間に十分なスペースを確保します。

サンプルをA FMにアタッチするときは、サンプルをKPFMステージに置きます。銅線を使用してサンプルを接地し、AFMからサンプルステージに適切なワイヤを接続します。次に、ステージをAFMソフトウェアでAFMに接続します。

設定時間が10ミリ秒以下であること、およびアプローチ速度が毎秒2ミクロンを超えないようにしてください。チップの損傷を避けるために、カンチレバーを調整し、カンチレバーの先端をサンプルに向かって動かし始めます。カンチレバーの先端がサンプル表面に到達したら、イメージングウィンドウサイズと理想的なイメージング領域を選択し、カンチレバーの設定値とともにアイゲインとPゲインを最適化して、トポグラフィーイメージングが最適化されるようにします。

トポグラフィーイメージングが最適化されたら、FMモードでKPFMモジュールの電源を入れます。イメージングウィンドウを5ミクロン×5ミクロンに設定し、解像度は5、12、5、12、またはスキャン速度を遅くします。FM KPFM設定の場合、ドライブを5〜10%に設定します。ドライブ周波数を1〜5キロヘルツに設定し、帯域幅を2キロヘルツに設定します。

F-M-K-P-F-Mの鉄NPゲインを0.3%に設定します KPFM画像を取得した後、ポストイメージング処理ソフトウェアを使用して画像を解析し、このビデオデモで概説されている設定を使用してSPデータを収集します。KPFM画像は、ステンレス鋼と金の両方の表面にある15個のMRSAセルで撮影されました。ここでは、収集される画像の種類を示します。

KPFMはデュアル周波数で動作するため、セル表面のトポグラフィー画像と電気データを同時に収集しました。表面電位マップにサーマルフィルターを適用して、表面電位の小さな変化をより簡単に識別できるようにしました。このグラフでは、画像を分析して微生物の膜表面電位を決定し、次にさまざまな基質での増殖を比較するために使用しました。

裸のステンレス鋼と裸の金基板の表面電位スキャンは、全体的に負の表面電位を示しました。ポリオールリジン被覆されたステンレス鋼と金のディスクは、どちらも正の表面電位へのシフトを示しました。MRSA細胞膜電位は、ステンレス鋼と金の表面で異なりました。

ステンレス鋼は、負の表面電位を示した金基板上のMRSA細胞と比較して、細胞の正の膜表面電位が有意に大きいことを示しました。KPFMの全機能を実証するために、ステンレス鋼上のMRSAのステップ高さグラフの例を以下に示します。これは、基板表面と微生物膜との間の表面電位の違いを示しています。

このビデオを見れば、ケルビンプローブフォース顕微鏡を使用して、さまざまな材料基板表面上の微生物細胞の付着と活動に対する電荷の影響を調べる方法について十分に理解できるはずです。