ラジアルモビリティおよびレトロウイルス複製ベクター形質導入、非付着Alloresponsive Tリンパ球の細胞傷害機能

本実験の全体的な目的は、接着性腫瘍細胞の単層上における非接着性エフェクターTリンパ球の遊走を示すことです。まず、ポリDリジンコートされたテフロンマスクスライドのウェル内に接着性腫瘍細胞の単層を形成し、次に細胞沈降マニホールドを用いて、蛍光標識したエフェクターTリンパ球を単層の中央に沈降させます。その後、光学顕微鏡および蛍光顕微鏡を用いて、単層上における非接着性細胞の遊走を可視化します。

結果から、接着性腫瘍細胞単層との共培養における非接着性Tリンパ球の遊走能およびエフェクター機能は、レトロウイルスベクターによるリンパ球の形質導入後も維持されることが示されました。既存の手法に対する本手法の主な利点は、接着性腫瘍細胞との共培養において、非接着性エフェクターTリンパ球の放射状遊走を測定できる点にあります。シトシンデアミナーゼなどのプロドラッグ活性化遺伝子を発現するように改変された同種細胞性細胞傷害性Tリンパ球が、脳内腫瘍を除去するためのマルチモーダルアプローチとして試験されており、この知見は原発性または転移性脳腫瘍の患者にとって広範な意義を持つと考えられます。

一般的に、この手法に不慣れな方は、腫瘍細胞の接着特性における増殖の不均一性のため、接着性の腫瘍細胞単層を形成することに苦慮します。均一な腫瘍細胞単層の作製と、非接着性のL-O-C-T-Lを効果的に沈降させるための手順には、両細胞種の特性に関する経験的な理解が必要であるため、本手法を視覚的に提示することが極めて重要です。まず、滅菌済みのものを最大4つ用意します。

10ウェルのテフロンコートスライドを、滅菌済みの150 millimeter by 15 millimeterのペトリ皿に入れます。湿度の維持のため、2 to 3 millilitersの滅菌水を入れた35 millimeter by 10 millimeterのペトリ皿をスライドの隣に配置します。次に、各ウェルを100 micrograms per milliliterのポリ-D-リシンまたはポリ-L-リシンの溶液で覆い、スライドをプレコートします。

スライドを室温で1時間インキュベートし、次いで溶液を吸引し、準備したサンプルウェルの表面をPBSで2回洗浄します。コンフルエントになった接着性腫瘍細胞をフラスコから回収します。光学顕微鏡で生存細胞数をカウントし、細胞濃度を5×10⁶ cells/mLに調整して懸濁します。

緩衝増殖培地を用い、腫瘍細胞の種類に応じて5〜10 µLの細胞懸濁液を各ウェルに添加し、培地でウェルの液量を40 µLまで調整した後、ピペッティングをゆっくりと行い、細胞を均一に分散させます。ウェルへの播種後、室温で30分間静置して腫瘍細胞を沈降させます。その後、ペトリ皿に蓋をし、5% CO2濃度の37 °C加湿インキュベーターに慎重に移し、少なくとも24時間インキュベートします。

単層から培地の一部を慎重に取り除き、より多量の新鮮なT細胞完全培地で補充することで、ウェル内の培養液を毎日交換します。通常、細胞は1〜3日以内にコンフルエントになり、腫瘍細胞単層への沈降準備が整います。非接着性のT細胞を回収し、アッセイ開始の少なくとも1時間前に、メーカーのプロトコルに従って細胞増殖染料で標識します。

次に、腫瘍細胞を播種したスライドを入れた加湿チャンバーを生物安全キャビネット内に配置します。ピペッティングによりウェルをPBSで洗浄し、10%血清を含む完全培地を45 µLずつウェルに加えます。滅菌済みの細胞沈降用マニホールドを、マニホールド端のフックがスライドの底に触れるまでウェルの上にスライドさせて設置します。

培地がマニホールドのチャネル内に満たされていることを確認します。次に、非接着細胞をカウントし、培地中で1〜2 × 10⁵ cells/µLの濃度で懸濁させます。

細胞の沈降を妨げる細胞塊をなくすため、細胞を緩やかに分散させます。各ウェルのマニホールドのチャネルに、細胞懸濁液を1 µLずつゆっくりとピペッティングします。その後、装置を室温で20〜30分間インキュベートし、チャネル内の細胞を単層上に沈殿させます。

細胞が沈降した後、スライドに触れないようにマニホールドを垂直にゆっくりと持ち上げます。細胞ペレットがマニホールドチャネルの円周内に収まっていることを確認してください。顕微鏡で観察し、定着した細胞が単層にわずかに付着していることを確認します。これにより、スライドをゆっくりと動かしてもペレットが分散しなくなります。

細胞が沈降したことを確認した後、スライドを二酸化炭素および湿度制御チャンバーを備えた倒立顕微鏡に移動させます。4倍対物レンズを使用して、細胞の明視野およびマルチチャンネル蛍光イメージングを行います。特定の領域の明視野および蛍光チャンネルの画像を撮影し、画像キャプチャソフトウェアを用いてスケールバーを追加します。

すべてのタイムポイントでの撮影が完了したら、タイムポイントの間はスライドを加湿インキュベーターに保管します。画像ファイルを画像編集プログラムにドラッグ＆ドロップし、「レイヤーを追加」オプションを選択して、マルチレイヤーの画像ファイルを作成します。明視野画像と蛍光画像を1つのレイヤーに統合します。

撮像ソフトウェアを使用して、8 mm × 8 mmの領域を撮影します。ソフトウェアの設定は、ウェル全体で最も適切に表現されているチャネルを使用して、キャプチャした画像を自動的にステッチ（結合）するように設定してください。蛍光チャネルのみで撮像する場合は、接着細胞を撮像するためのチャネルを選択してください。

あるいは、画像編集ソフトウェアを使用して画像をスティッチすることも可能です。これは、画像間で共通する領域を合わせ、完全な画像が生成されるまで画像を重ね合わせることで行われます。画像ソフトウェアを用いて、これらの画像をスティッチしてください。

Image Jソフトウェアを使用して合成画像から表面強度蛍光マップを作成し、時間経過に伴う蛍光T細胞の凝集または拡散を可視化します。エメラルドグリーン蛍光タンパク質発現遺伝子をコードする複製能を持つレトロウイルスベクターで導入された、Allo CTLとして知られるヒト同種反応性細胞傷害性Tリンパ球を、グリオーマ細胞の単層の中央に配置しました。4時間後、Allo CTLは24時間までに目に見える凝集体を形成しました。

接着細胞の単層に空隙が現れ、腫瘍細胞の溶解が示されたほか、一部の同種CTLが前縁を超えて遊走していた。蛍光標識したマウス同種CTLを、蛍光標識した神経膠腫細胞の単層の中心に配置したところ、1時間後には同種CTLが神経膠腫細胞に密接に関連していた。48時間後までに、同種CTLは単層の中心から遠ざかる方向に遊走していた。これらの画像からImageJソフトウェアを用いて蛍光マップを作成したところ、48時間後に中心から大幅に遊走していることが示された。

腫瘍細胞の単層を健康な培養状態で維持するためには、培養液を毎日交換することが重要です。また、この手順に習熟すれば、非接着細胞の沈降には約20分かかります。同種CTLが単層を横切って遊走する速度や、細胞傷害機能を果たすために腫瘍細胞と接触している時間などの疑問を解消するには、細胞パス追跡などの他の手法を用いることができます。

本プロトコルは、免疫遺伝子治療分野の研究者が、腫瘍細胞との共培養における遺伝子改変Tリンパ球の遊走を探索するのに役立ちます。このビデオを視聴することで、共培養用の非貼着性細胞および貼着性細胞の調製方法と、細胞沈降マニホールドを用いて腫瘍細胞単層上における非貼着性細胞の水平方向の放射状遊走を研究する方法について十分に理解できるはずです。