ラジアルモビリティおよびレトロウイルス複製ベクター形質導入、非付着Alloresponsive Tリンパ球の細胞傷害機能

次の実験の全体的な目標は、接着性腫瘍細胞の単層上を非接着性エフェクターTリンパ球の移動を示すことです。これは、まず、蛍光標識エフェクターとして第2のステップとして、ポリDリジン被覆テフロンマスクスライドのウェル内に接着腫瘍細胞の単層を確立することによって達成され、Tリンパ球は細胞沈降多様体を使用して単層の中心に沈殿されます。次に、光学顕微鏡と蛍光顕微鏡を使用して、単分子膜上の非接着細胞の移動を視覚化します。

結果は、接着性腫瘍細胞単層との共培養における非接着性Tリンパ球の遊走およびエフェクター機能が、リンパ球がレトロウイルスベクターで形質導入された後も維持されることを示しています。既存の方法に対するこの手法の主な利点は、非接着性エフェクターTリンパ球の放射状移動を、接着性腫瘍細胞を用いた石炭培養で測定できることです。これは、シトシンデアミナーゼなどのプロドラッグアクチベーター遺伝子を発現するように修飾された同種細胞傷害性Tリンパ球が、脳内の腫瘍を排除するためのマルチモーダルアプローチとしてテストされているため、原発性または転移性脳腫瘍の患者にとって広範囲にわたる影響を及ぼします。

一般に、この方法に不慣れな個人は、接着特性における腫瘍細胞の成長の不均一性のために、接着性腫瘍細胞単層の確立に苦労します。この方法の視覚的なデモンストレーションは、均一な腫瘍単層を生成し、非接着性L-O-C-T-Lを効果的に沈降させるためのステップには、両方の細胞タイプの特性を経験的に理解する必要があるため、非常に重要です。まず、滅菌した4つまで配置します。

10ウェルテフロンコーティングされたスライドを、150ミリメートル×15ミリメートルの滅菌シャーレに入れます。2〜3ミリリットルの滅菌水が入った35ミリメートル×10ミリメートルのペトリ皿をスライドの横に置き、湿度を確保します。次に、各ウェルを1ミリリットルあたり100マイクログラムのポリDリシンまたはポリLリジンの溶液で覆うことにより、スライドをプレコレーションします。

スライドを室温で1時間インキュベートした後、溶液を吸引し、サンプルウェルを調製した状態でウェルの表面をPBSで2回すすぎます。付着性腫瘍細胞のコンフルエントフラスコを採取します。光学顕微鏡で生細胞の数を数え、10の5倍から1ミリリットルあたり6個の細胞の濃度で細胞を懸濁します。

緩衝増殖培地では、腫瘍細胞の種類に応じて、各ウェルに5〜10マイクロリットルの細胞懸濁液を追加し、培地でウェルの容量を最大40マイクロリットルにし、細胞を均等に分配するためにゆっくりと上下にピペットします。ウェルに播種した後、腫瘍細胞を室温で30分間沈殿させます。次に、蓋をシャーレに置き、摂氏37度の加湿インキュベーターに5%二酸化炭素を少なくとも24時間インキュベートして慎重に移します。

ウェル上の培地を毎日交換するには、単層から培地の一部を慎重に取り除き、大量の新鮮な完全T細胞培地と交換します。細胞は通常、腫瘍細胞単層に沈降するための細胞を準備するために、1〜3日以内にコンフルエントになります。非接着性T細胞を回収し、アッセイの少なくとも1時間前に、メーカーのプロトコルに従って細胞増殖色素で標識します。

次に、腫瘍細胞を含む加湿チャンバーを生物学的安全キャビネットにスライドさせます。ピペッティングでウェルをPBSで洗浄し、10%血清を含む45マイクロリットルの完全な培地をウェルに加えます。滅菌した細胞沈降マニホールドをウェル上にスライドさせ、マニホールドの端にあるフックがスライドの底に触れるまで

媒体がマニホールドチャネルに表示されていることを確認します。次に、非接着性細胞を数え、それらを1〜2倍10〜5倍で懸濁します。培地中のマイクロリットルあたりの細胞数。

細胞を穏やかに破壊して、細胞の沈降を妨げる細胞クラスターを排除します。細胞懸濁液の1マイクロリットルをそれぞれマニホールドのチャネルにゆっくりとピペットで移します。次に、装置を室温で20〜30分間インキュベートして、チャネル内の細胞が単分子膜に沈殿するのを待ちます。

セルが落ち着いたら、スライドに触れずにマニホールドをゆっくりとまっすぐ持ち上げます。セルペレットがマニホールドチャネルの円周内に装着されていることを確認してください。顕微鏡を使用して、スライドを穏やかに動かしてもペレットが分散しないように、着座した細胞が単層にわずかに接着する必要があります。

細胞が沈殿したことを確認したら、スライドを二酸化炭素と湿度のチャンバーを備えた倒立顕微鏡に移します。4つのx対物レンズは、細胞の明視野およびマルチチャンネル蛍光イメージングに使用します。明視野および蛍光チャネルの特定の領域の画像を取得し、画像キャプチャソフトウェアでミクロンバーを追加します。

すべての時点が取得されたら、スライドを時間ポイント間で加湿インキュベーターに保管します。画像ファイルを画像編集プログラムにドラッグアンドドロップし、レイヤーの追加オプションを選択して、複数のレイヤーを持つ画像ファイルを作成します。光と蛍光画像を1つのレイヤーにマージします。

取得ソフトウェアを使用して、8ミリメートル×8ミリメートルの領域の写真を撮ります。ソフトウェアは、ウェル全体で最もよく表現されるチャネルを使用して、キャプチャされた画像を自動的につなぎ合わせるように設定する必要があります。蛍光チャンネルのみをイメージングする場合は、接着細胞をイメージングするためのチャンネルにする必要があります。

または、画像編集ソフトウェアを使用して画像をステッチすることもできます。これは、ある画像から別の画像に保存された画像の領域を整列させ、完全な画像が生成されるまで画像を互いに重ね合わせることによって行われます。画像ソフトウェアを使用して画像をつなぎ合わせます。

結合された画像を使用して、Image Jソフトウェアで表面強度蛍光マップを作成し、蛍光T細胞の凝集または経時的な広がりを視覚化します。アロCTL形質導入として知られるヒトアロ反応細胞傷害性Tリンパ球は、エメラルドグリーンの蛍光タンパク質発現遺伝子をコードする複製コンピテントレトロウイルスベクターとともに、神経膠腫細胞の単層の中心に座っていました。4時間後、すべてのOCTLは24時間までに目に見える凝集体を形成しました。

付着細胞単層に空のパッチが現れ、腫瘍細胞の溶解を示し、一部の同種CTLが前縁を超えて移動した。蛍光標識されたマウスAllo CTLは、1時間で蛍光標識された神経膠腫細胞のインフルエンザ単層の中心に着座していた 48時間までに神経膠腫細胞と密接に関連するAllo CTLは、Allo CTLが単層表面強度の中心から離れて移動していた。蛍光マップは、これらの画像から画像Jソフトウェアで生成され、48時間後に中心から大幅に離れる移動を示しています。

腫瘍細胞単層の培養液を毎日交換して、健康な培養条件を維持することが重要です。また、一度習得すると、非接着性細胞の沈降にはこの手順に続いて約20分かかるはずです。細胞経路追跡などの他の方法を使用して、allo CTLが単層を横切って移動する速度や、細胞傷害性機能を果たす腫瘍細胞と接触する時間に関する質問に答えることができます。

このプロトコルは、免疫遺伝子治療の分野の研究者が、腫瘍細胞との共培養における遺伝子改変Tリンパ球の移動を探求するのに役立ちます。このビデオを見れば、非接着性細胞の調製方法と共培養あたりの接着性細胞の調製方法、および細胞沈降マニホールドを使用して腫瘍細胞単分子膜上の非接着性細胞の水平方向移動を研究する方法について十分に理解できるはずです。