マイクロピラーとマイクロ流体デバイス内のバイオフィルムストリーマ形成のためのプロトコル

この手順の全体的な目標は、マイクロピラーを備えたマイクロ流体デバイスにおける細菌ストリーマーの形成を実証することです。これは、最初にマイクロ流体チップを製造することによって達成されます。手順の2番目のステップは、テストされた細菌(この場合はシュードモナス蛍光)を培養することです。

最後のステップは、実験装置を組み立て、マイクロ流体チップに細菌を注入し、データを収集することです。最終的には、インフルエンザ蛍光顕微鏡画像を通じてストリーマーの時間進化を示すことができます。この金属の視覚的なデモンストレーションは、さまざまなステップを学ぶのが難しいため、非常に重要です。

実験の学際的な性質のため、この手順では、深い反応性イオンエッチングを備えたシリコンウェーハが必要です。ウェーハ上のフォトレジストを洗い流す必要があります。マスターモールドをサイレントから始めます。

バイアルに2〜3滴のトリクロロエチレンを加え、その横にある金型デザインと一緒に乾燥剤に入れます。2、3時間で、金型はサイロ化されます。サイロ化中に、PDMSミックスシガー1 8 4シリコーンベースと硬化剤を10対1の比率で調製します。

その後、PDMSを真空下で約2時間脱気します。次に、サイロ化されたウェーハをホルダーに移し、その上にPDMSを注ぎ、気泡が形成されないようにします。PDMSを80°Cのウェーハ上で2時間硬化させます。

これにより、サイズのシリコン型からA-P-D-M-Sスタンプが製造されます。硬化が完了したら、カッターを使用してPDMSスタンプを剥がします。次に、カッターを使用してスタンプをマイクロ流体チップにカットします。

次に、カッティングコアを使用して、スタンプの入口とアウトライブ位置に穴を開けます。次のステップは、スタンプをガラスに接着することです。24mmのカバースリップとPDMSスタンプを酸素プラズマに30秒間さらします。

露光後、PDMSスタンプの底面にカバースリップを貼り付けると、ボンドが形成されます。アセンブリを摂氏70度のオーブンに10分間置きます。このプロトコルのプロセスを完了するには、超純水で作られ、摂氏50〜55度で添加されたテトラサイクリンのミリリットルあたり50マイクログラムを投与したLBプレートを準備します。

皿を注ぐときは、火を立てることで泡をはじくことができます。冷却して固化させたプレートは、年代測定を行い、ブリキのラップで摂氏4度で保管する必要があります。また、超純水で作られ、テトラサイクリンのミリリットルあたり50マイクログラムを投与されたLBブロスを準備しました。

スープを摂氏4度で保存し、ホイルで包みます。次に、LBプレート上にマイナス80°Cで保存されたシュードモナス蛍光の培養ストックを、プレートをジグザグパターンに縞模様にし、暗所で摂氏30度で一晩インキュベートします。翌日、プレートからコロニーを選び、新たに調製したSワンのフラスコを摂氏30度で一晩インキュベートし、150RPMの振とうで接種します。

インキュベーション後の培養物の光学密度を測定します。次に、S 2つのソリューションを作成します。プラスチックチューブに5ミリリットルのLBを加え、バイオフィルム実験で一般的な600ナノメートルの0.1のODに対して十分な量のSワン溶液を追加します。

まず、ピンセットを使用して実験を設定します 準備したチップの入口と出口に内径0.20インチのプラスチックチューブを接続します。チューブは柔軟性があり、十分に長くなければなりません。ここでは約20インチです。

次に、シリンジにS 2溶液を充填します。30ゲージの鈍い針を取り付け、気泡を取り除きます。気泡がチャネルに入るのを防ぐことは、特に実験のライン時間のために重要なステップです。

気泡は、バクテリアによって形成された柔らかい構造を損傷する可能性があります。次に、シリンジをインレットチューブに接続し、アウトレットチューブを廃棄物容器に接続します。次に、シリンジをシリンジポンプに配置し、インキュベーション温度に設定された細胞チャンバーを備えた顕微鏡で、ポンプを1時間あたり8マイクロリットルなどの目的の流量に設定します。

40倍の対物レンズを使用して、おそらくマイクロ流体チップを表示します。次に、ポンプを始動します。細菌がチャンバーに導入されると、バイオフィルムの形成も開始されます。

バイオフィルムは形成され、何時間も何日も成熟し、その進行を追跡するために画像を撮ります。SEMAを用いて作製したマイクロ流体チップを撮像した。フォークのような入り口は、デバイス全体の圧力ヘッドを均等にするために作成されます。

また、柱の壁がほぼ垂直になっていることもわかります。バイオフィルム形成を調べるために、蛍光を1時間あたり8マイクロリットルでデバイスに注入しました。バイオフィルムの形成は、希釈した細菌培養物の注入の数分後に始まりました。

しかし、数時間後、中央部付近に微細な柱の間に伸びる糸状構造の出現が観察されました。破線の楕円は、マイクロピラーの1つの極領域に一端でつながれた形成ストリーマを形成しているストリーマを区切っています。また、2本のマイクロピラーの間の対角線に沿ってストリーマーが見られました。

ストリーマーの厚さは、細胞分裂やプランクトン性細菌の取り込みにより、時間とともに増加しました。また、デバイス内で大量のストリーマーが占める時間とともに増殖し、成熟したバイオフィルムが形成され、デバイスが詰まる可能性があります。装置を通る流れの機械的シミュレーションは、ストリーマが最初に流体の流線に沿って向きを変えることを示しています。

さらに、初期段階では、ストリーマは最も流速の高い位置から発生します。このビデオを見れば、バイオフィルムストリーマーがマイクロ流体環境でどのように形成され、進化するかを十分に理解できるはずです。バクテリアを扱う作業は非常に危険である可能性があり、この手順を実行する際には常にバイオセーフティプロトコルなどの予防措置を講じる必要があることを忘れないでください。