エフェクターCD4の養子移入によるマウス腸の炎症の誘導 ⁺ CD45RB^高い免疫不全マウスへのT細胞

この手順の全体的な目標は、ナイーブT細胞を免疫不全マウスに養子移行することにより、腸の炎症を誘発することです。これは、最初にマウスの脾臓から細胞を分離し、血液細胞を溶解し、次にCDの4つの陽性T細胞のために集団を濃縮することによって達成されます。第2のステップは、これらの細胞を蛍光DI標識CD4およびCD45RB抗体で標識することです。

次に、標識された細胞をファクトを使用してCD 45、RB低、およびCD45 RB高集団に選別します。最後のステップは、腹腔内注射により、CD 45 RB高細胞を免疫不全マウスに移すことです。最終的に、移植された細胞は活性化され、制御性T細胞の不在下で局所組織損傷を引き起こし、実験的大腸炎を引き起こします。

この方法は、疾患の病因における特定の細胞集団や胃腸内細菌叢の役割など、炎症性腸疾患の研究における重要な質問に答えるのに役立ちます。ドナーマウスを安楽死させた後、腹部に70%エタノールをスプレーしてその領域を滅菌します。次に、腹部を横切って水平に切開し、鉗子を使用して皮膚を剥がして腹膜を露出させます。

腹膜を内臓から離し、左腹部腹膜を切開します。次に、マウスから脾臓を摘出し、10ミリリットルの氷冷した完全な培地が入ったシャーレに入れます。脾臓を2枚の滅菌スライドガラスで粉砕し、単細胞懸濁液を作ります。

70ミクロンのストレーナーで細胞を50ミリリットルの円錐管にろ過し、次に1本の円錐管に最大5つの脾臓までの完全な中ひずみ5ミリリットルでストレーナーをすすぎます。次に、細胞をGの450倍で摂氏4度で7分間遠心分離します。上清を廃液容器に吸引し、次いで細胞を10ミリリットルの氷冷標識緩衝液に穏やかに再懸濁する。

20マイクロリットルの細胞懸濁液と180マイクロリットルの0.4%トライアンブルー溶液を組み合わせ、細胞を室温で5分間インキュベートします。次に、10マイクロリットルの細胞懸濁液をヘモサイトメーターに加え、顕微鏡下で非青色細胞の数を数えて濃縮ペレットを開始し、細胞を氷冷標識緩衝液に10の20倍10の濃度で穏やかに懸濁液を1ミリリットルあたり6細胞に蘇生します。6つの細胞に10分の1につき5マイクロリットルのビオチン化CD 4 T細胞濃縮抗体を添加し、抗体と氷上で15分間細胞をインキュベートします。

細胞懸濁液に10倍の量の標識バッファーを加え、Gの450倍で細胞を7分間遠心分離します。細胞ペレットを乱さずに上清を慎重に吸引します。次に、ストレプトアビジン結合磁性粒子をボルテックスにより再懸濁し、細胞に6つの細胞に1×10あたり5マイクロリットルの粒子を添加する。

チューブを静かにフリックして粒子を細胞と混合し、次に混合物を摂氏6〜12度で30分間インキュベートします。標識緩衝液を用いて、細胞を1ミリリットルあたり6細胞の20〜80倍10倍の濃度に再懸濁します。次に、標識された細胞1ミリリットルを12ミリメートル×75ミリメートルの丸底試験管に移し、この正の画分チューブを磁石に6〜8分間置きます。

チューブを磁石に取り付けた状態で、標識された細胞を乱さずにガラスペーストピペットで上清を慎重に取り除き、新しい滅菌50ミリリットルの円錐形チューブに移します。この画分は、CDの4つの陽性T細胞を含んでいます。正極画分チューブを磁石から取り外し、激しくピペッティングして細胞を標識バッファーに再懸濁します。

チューブをさらに6〜8分間磁石に戻します。再度、SUPナインを濃縮フラクションチューブに慎重に移します。必要に応じて濃縮を繰り返すことにより、CDの4つの陽性T細胞の収量を増加させ、標識用の細胞を調製するまず、濃縮された画分をGの450倍で7分間遠心分離し、上清を廃棄する。

次に、標識緩衝液中の細胞を10×10〜6細胞/mLの濃度に再懸濁します。未染色の同位体染色されたコントロール細胞および単一染色されたコントロール細胞のために、個々のマイクロフュージチューブ内の5番目の細胞の10倍を分注します。次に、CD 4、FEを1ミリリットルあたり5マイクログラム、およびCD 45 RB PE抗体を1ミリリットルあたり1マイクログラムを元の細胞懸濁液を含むチューブに加えます。

同位体コントロール染色剤と同濃度の単一染色剤を適切な細胞分注液に加えます。細胞を抗体と穏やかに混合し、チューブを氷上で30分間インキュベートします。チューブを光から保護するためにチューブを覆います。

次に、テキストプロトコルに示されているように、細胞を標識緩衝液中で2回洗浄し、標識緩衝液中の6細胞/ミリリットルの10倍で細胞を再懸濁します。次に、細胞懸濁液を70ミクロンのストレーナに通してファックスチューブに入れます。チューブを氷の上に置き、それを覆って、汚れの写真の漂白を防ぎます。

未染色のシングルステージコントロールセルを使用して、セルソーターの補正をキャリブレーションします。前方および側方散乱ゲーティングを使用して、生存不能な細胞を除外します。次に、同位体染色コントロールを使用して、CD 4陽性細胞およびCD 4 RB陽性細胞のゲーティングを設定します。

次に、CD 4 の陽性集団を CD 45、RB 高、CD 45 RB 低の集団に細胞を分類します。2ミリリットルの完全培地を含むチューブに細胞を収集し、次いでセルソーター上の各画分から第3の細胞に約10倍のアリコートを実行してサンプル純度を評価し、注射洗浄用のCD 45 RB高細胞およびCD 45 RB低細胞を調製し、テキストプロトコルに示されているようにPBSで適切な細胞密度に再懸濁します。次に、レシピエントマウスをしっかりと拘束し、腹部の右側と左側に細胞懸濁液100マイクロリットルを腹腔内に注入します。

レシピエントマウスの臨床パラメータを毎週テキストプロトコルに示されているように監視します。注射後の疾患の進行は、通常、5週目に明らかになります。所定の時点でマウスを犠牲にするか、開始時の体重の20%が失われたときにマウスを生け贄に捧げ、結腸を抽出します。

次に、結腸の長さと重量を測定して記録します。注射後5週間までに、4つの陽性CD45 RB高T細胞を、1ノックアウトおよびNFIL3つのRAG1つのダブルノックアウトレシピエントマウスに移植した。ダブルノックアウトマウスは、最初の体重の10%を失い、1回のノックアウトとダブルノックアウトの両方の結腸が減少しました。

レシピエントマウスは、対照マウスの結腸と比較して肥厚し、短縮されたCD45 RB高T細胞をラグ1ノックアウトおよびラグ1ノックアウトP110デルタ変異体レシピエントマウスに移すための移植後3週間での組織学的分析は、上皮過形成、炎症性細胞浸潤および陰窩膿瘍を示したラグ1ノックアウトデルタ変異体レシピエントがラグ1ノックアウトマウスでは一度習得した。この手法は、適切に実行すれば4〜6時間で実行できます。