T細胞への抗原提示細胞による抗原の提示を研究するための抗原駆動性大腸炎モデルの開発

この抗原駆動性大腸炎モデルの全体的な目的は、抗原特異的大腸炎において、CX3およびCR1陽性の単核 phagocyte がCD4陽性T細胞と相互作用して活性化するかどうか、また、この単核 phagocyte 依存的なエフェクターT細胞の増殖が腸管固有層内で起こるか determining することです。この手法は、結腸固有層における抗原提示細胞とエフェクターT細胞の間でどのような相互作用が起こるかなど、炎症性腸疾患分野における重要な疑問への回答に役立ちます。本手法の主な利点は、免疫細胞の相互作用および炎症性腸疾患の病原性に至る要因を研究できる点にあります。

本手法ではT細胞転移性大腸炎モデルを用い、単核細胞に緑色蛍光タンパク質を発現する免疫不全宿主へ、赤色蛍光抗原特異的ナイーブCD4 T細胞を転移させます。細胞転移後、青色蛍光抗原発現細菌を経口投与します。これにより、疾患進行のさまざまな段階において、宿主の腸管固有層で起こる免疫イベントをモニタリングすることが可能です。

解剖用はさみを使用して結腸を縦に切り開き、25 mLのPBSを入れたペトリ皿の中で組織を洗浄し、破片や粘液を除去します。結腸を5～8 mmの大きさに切断し、10 mM HEPESおよび5 mM EDTAを添加した、カルシウムおよびマグネシウム不含の新鮮なDPBS 20 mLの中に断片を入れます。サンプルが入ったチューブを最大速度で30秒間ボルテックスします。

次に、上皮を除去するために、緩やかに振盪しながら37°Cで10分間インキュベートします。インキュベート後、再び30秒間ボルテックスします。その後、上皮細胞を含む上清を廃棄します。

組織片を、20 millilitersの新鮮なPBS、HEPES、およびEDTA緩衝液を含む新しいチューブに移し、前後のボルテックス操作を含むインキュベーションを繰り返します。3回目の繰り返し後、すべての上皮細胞が除去され、上清が透明になります。組織片をPBSで穏やかに洗浄し、残存する上皮細胞を除去します。

組織片を2 mm四方の断片に切り分け、0.5 mg/mLのcollagenase type eightおよび10 U/mLのDNAse oneを添加した10 mLのRPI培地に移して消化させます。サンプルを30秒間ボルテックスします。その後、組織片を37 °Cで30～35分間振盪しながらインキュベートし、インキュベーション中は5分ごとにチューブをボルテックスします。

組織の消化後、得られたスラリーを70 micronのセルストレーナーを用いて50 milliliterのコニカルチューブにろ過します。セルストレーナーを1回洗浄し、単一細胞懸濁液を遠心分離して回収します。最後に、細胞をPBSで1回洗浄し、遠心分離します。

次に、トリパンブルー排除法により生存細胞数を決定します。シアン蛍光タンパク質オバルブミンタンパク質を産生するe. coliは、e. coliとは対照的に、in vitroでOT-II細胞のインターフェロンガンマ産生を活性化します。

CFPのみを発現するcoli。CFPを発現するe. coliを投与した、緑色蛍光タンパク質発現トランスジェニックマウスの結腸組織をex vivo 3D共焦点イメージングで観察したところ、腸上皮細胞近傍の結腸陰窩内に蛍光タンパク質発現細菌が存在し、宿主の腸管食細胞と共局在していることが示された。

OT-II red動物において、CD4陽性T細胞は、赤色蛍光タンパク質とV beta 5.1を共発現していることが特徴です。e. coli PCFP ovaで負荷を与えると、OT-II red CD4陽性CD62 ligand陽性T細胞を養子移植したBNTリンパ球欠損GFP発現トランスジェニックマウスは、急速に体重が減少し、大腸炎の臨床症状を発現します。

細胞移植の7日後、e. coli PCFP 卵をサンプリングした宿主食細胞はわずかであり、OT-II red 陽性細胞は検出されません。細胞移植の14日後には、e.をサンプリングした宿主食細胞が

coli PCFP ovaは、養子移転されたOT-II red陽性細胞の近傍に位置しています。細胞移転から21日後までには、多数のホスト細胞がe. coli PCFP ovaをサンプリングしており、結腸固有層全体に分散して存在するドナーOT-II red陽性細胞は、ホストの腸管食細胞と密接に接触しています。

この手法を習得し、適切に実施すれば、4時間で完了させることができます。本手順に続き、腸管リンパ球の染色や血清サイトカイン分析などの他の手法を行うことで、CD4 T細胞の活性化状態に関する追加の疑問を解消し、大腸炎の重症度を確認することが可能です。本手法の発展により、マウスモデルにおける炎症性腸疾患に至る微細な事象を探索するための、免疫学分野の研究への道が開かれます。

このビデオを視聴することで、下流のex vivo解析に向けて結腸粘膜固有層の免疫細胞を単離する方法を十分に理解できるはずです。