Name: T細胞への抗原提示細胞による抗原の提示を研究するための抗原駆動性大腸炎モデルの開発 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 57 s
Description: 学ぶ抗原駆動性大腸炎モデルを用いて、単核貪食細胞とCD4陽性T細胞の相互作用を解析する方法。蛍光タンパク質を活用し、腸管固有層での免疫応答を可視化することで、炎症性腸疾患の病態メカニズム解明に貢献します。

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JHNは、スイス国立財団（SNSF 310030_146290）の支援を受けています。

著者らは開示するものは何もない。

他のすべてのモデルと同様に、上記の抗原駆動型大腸炎モデルは、技術を実行研究者が知っておく必要がありますいくつかの問題を提示することができます。 OT-IIホストで/レッド+ CD4 + T CD62L +細胞を注入すると、研究者は腹腔内に注射針を挿入することは非常に穏やかで注意しなければなりません。これを怠ると、死亡につながる可能性がマウスの腸、または任意の病気を誘発しない細胞の皮下投与が裂ける可能性があります。 一般的に、マウスは、細胞移入後の最初の週の間に体重が増加します。研究者は、各重みの時点で同時にマウスを計量し、手順全体を通して同じ計量バランスを使用する必要があります。時には、実験マウスは、実験の開始時に、その重量は18グラムは、以下の場合は特に、消耗症候群の兆候を発症しません。しかしながら、これらの動物はmightはまだ巨視的評価の下で重要な腸の炎症を開発しています。 遺伝的に改変された細菌で作業する場合、汚染が発生する可能性があります。これらの問題...

腸は、外部環境にさらされる体の最大の表面です。常駐微生物の広大な配列は、腸内細菌叢（または微生物叢）を形成するために、ヒトの腸にコロニーを形成します。これは、最大100000000000000微生物細胞からなると推定され、生物学1-3で知られている最も人口密度の高い細菌の生息地の1を構成しています。 GITでは細菌は、彼らが生き残ると4を掛け腸のニッチを植民地化。リターンでは、微生物は、そのゲノム1でエンコードされていない追加の機能的特徴を持つホストを付与します。例えば、微生物は、上皮細胞の増殖を刺激し、ホストは自分で作り出すことができないビタミンを生成し、代謝を調節し、病原体4-6から保護します。この有益な関係を考えると、いくつかの著者は、人間が「超生物」または細菌とヒト遺伝子7,8のミックスである「holobionts」であることを示唆しています。 （人間の）ホスト上の微生物叢の有益な影響を考えると、腸管免疫系はルーメンでその存在を可能にするだけでなく、腔側9-11から侵入する病原体を殺すために共生微生物を容認する必要があります。腸管免疫系は無害と潜在的に有害な管腔の微生物を区別するためのメカニズムを開発しました。しかし、これらのメカニズムはまだよく12を理解されていません。腸の整合性を維持することは寛容と免疫の13の間のバランスを保つために厳密に調節免疫恒常性を必要とします。免疫恒常性のアンバランスは、炎症性腸疾患（IBD）3,14などの腸疾患の誘導に寄与する。 クローン病（CD）および潰瘍性大腸炎（UC）：IBDの2つの主要なタイプがあります。これらの疾患を有する患者は、通常、直腸出血、重度の下痢や腹痛15,16苦しみます。 IBDの一つの原因はまだです不明ですが、遺伝的要因の組み合わせ、環境の影響および調節不全免疫応答が疾患の発症15のための重要な事象であるかもしれません。 IBDの動物モデルは、50年以上にわたって使用されてきました。過去数十年間、新しいIBDモデル系は、IBD 17,18の病因に関するさまざまな仮説をテストするために開発されてきました。慢性大腸炎の最もよく特徴付けられたモデルは、T細胞ホメオスタシス19,20の破壊を誘導し、T細胞移入モデルです。 16,21このモデルは、（ - / -およびSCIDマウスのようなRAGなど）TおよびB細胞を欠いている宿主に免疫したマウスからのナイーブT細胞を転送することを含みます。このモデルにおける疾患の発症は、下痢の存在を評価することによって、3-10週間モニター身体活動の減少、及び体重減少です。これには、消耗症候群16と呼ばれています。健康なマウスと比較して移植したホストの大腸組織は、シックですR、16短いと重いです。 T細胞移入モデルを使用して、T細胞集団は、IBD 22の病因に寄与することができる方法の異なる理解することが可能です。 T細胞移入モデルでは、抗原特異的様式で疾患プロセスにおけるAPCおよびT細胞の間の相互作用を分析しません。骨髄細胞およびリンパ系細胞間の相互作用は、腸の炎症23の発症の原因であることが示されています。 IBDの多くの側面が明らかにされてきたが、病気の開発につながる初期のイベントは、まだ明確に理解する必要があります。 微生物転写大腸炎の非存在下で24を確立できないことが示されています。最近、いくつかの説は、IBDは、共生細菌25に対する免疫応答の結果であることを示唆しています。著者らは、共生細菌は、遠位腸内の炎症を誘導するのに不可欠であることも提案しています26。生殖無料（GF）動物では腸管免疫系は、一般的に27,28を低下しているが、完全に有能な腸管免疫系29の開発における特定の病原体を含まない細菌の結果の混合物とこれらのマウスの植民地化。したがって、微生物叢は、いずれかの素因または腸の炎症30,31の開発から保護するメカニズムとして、IBDの病因における重要な要素であると思われます。現在の理論は、遺伝的素因の患者32に、IBDは、腸内毒素症と呼ばれる、微生物の不均衡の結果であることを示唆しているが、それは明らかではないが、まだ腸内毒素症は、原因や病気12の結果である場合。 IBDの発症における微生物の役割を考慮すると、 インビトロ実験において CD4 + T細胞は、腸内細菌33,34でパルスしたAPCにより活性化することができることを示しました。 また、より抗原ことが示されています例えば、Eなど、さまざまな共生細菌種、 大腸菌、バクテロイデス、ユーバクテリウムおよびプロテウスは 、CD4 + T細胞35を活性化することができます。これは、T細胞への細菌抗原の提示は、IBDの開発のために重要であることを示しています。疾患過程における微生物叢によって誘導される複数の抗原の複雑さを軽減するために、 大腸菌株は、OVA抗原を産生するように作成されています。転写性大腸炎は、RAGにOVA特異的T細胞を注射することによって誘導した- / - OVAを発現する大腸菌を保菌動物大腸菌 。 このモデルは、CX 3 CR1 +議員、結腸粘膜固有層（CLP）36の主要な細胞サブセットは、転送37を大腸炎の間にCD4 + T細胞と相互作用していることを示唆している最近の証拠に基づいています。国会議員は、その樹状突起36、38,39を使用して、細菌のような、粒子状抗原のための腸管腔をサンプリング。以前の研究国会議員はまた、腸管腔40,41に導入され、このようなOVAなどの可溶性抗原を、取ることができることを実証しました。 CLPにおけるCX 3 CR1 + MPの存在量を考えると、これらの細胞が管腔細菌をサンプリングし、CD4 T細胞と相互作用することが可能です。 E.が定着OVA特異的CD4 + T細胞を移植したマウスの共焦点イメージングコリ CFP-OVAは、CX 3 CR1 + MPSは抗原駆動型大腸炎の開発中OT-II CD4 + T細胞と接触していることを示しています。このモデルは、腸のAPCおよび唯一の腸管内腔における特定の抗原を発現する細菌に特異的なT細胞間の抗原提示プロセスの研究を可能にします。

<table><tbody><tr><td>LBブロス、ミラー(ルリア-ベルターニ)</td><td>Difco</td><td>244620</td><td></td></tr><tr><td>ロータリーシェイク</td><td>Reiss Laborbedarf e. K.</td><td>モデル 3020 GFL</td><td></td></tr><tr><td>2 mm ギャップ クーベット&nbsp;</td><td>Peqlab Biotechnologie GmbH</td><td>71-2020</td><td></td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516-100ML</td><td></td></tr><tr><td>遺伝子パルサー Xcell システム&nbsp;</td><td>BioRad Laboratories GmbH</td><td>1652660</td><td></td></tr><tr><td>LB Agar, Miller (Luria-Bertani)</td><td>Difco</td><td>244510</td><td></td></tr><tr><td>アンピシリン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9393-5G</td><td></td></tr><tr><td>SOC ミディアム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1797-100ML</td><td></td></tr><tr><td>高純度プラスミド分離キット</td><td>Roche</td><td>11754777001</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Carl Roth GmbH &Co</td><td>3810.1</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9884-100G</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5941</td><td></td></tr><tr><td>氷酢酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>537020&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ゲルチャンバー&nbsp;</td><td>PEQLAB Biotechnology GmbH</td><td>40-0708</td><td></td></tr><tr><td>Loading Dye</td><td>Thermo Fisher</td><td>R0611</td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler 1 kb DNA Ladder&nbsp;</td><td>サーモフィ</td><td>ッシャーSM0312</td><td></td></tr><tr><td>臭化エチジウム溶液</td>Carl <td>Roth GmbH&Co. KG</td><td>2218.3</td><td></td></tr><tr><td>写真記録システム&nbsp;</td><td>Decon Science Tech GmbH</td><td>DeVision G&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>DNAシーケンシング&nbsp;</td><td>MWG-Biotech GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水(PBS)</td><td>Biochrom</td><td>L182-50</td><td></td></tr><tr><td>蛍光顕微鏡&nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>HBO 100</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Tetra System</td><td>Bio-Rad Laboratories GmbH</td><td>1658005</td><td></td></tr><tr><td>PageRuler Prestained Protein Ladder&nbsp;</td><td>Fermentas, St. Leon-Rot, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IstanBlue Solution</td><td>Expedeon, Cambridgeshire, United Kingdom</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ニトロセルロース膜&nbsp;</td><td>Macherey-Nagel GmbH & Co. KG</td><td>741280</td><td></td></tr><tr><td>エレクトロブロッター&nbsp;</td><td>Biometra GmbH</td><td>846-015-600</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6003-25G</td><td></td></tr><tr><td>抗オボアルブミン抗体&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab181688</td><td></td></tr><tr><td>抗ウサギIgG&nbsp;HRP</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>A0545&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Pierce ECL Plus Western Blotting Substrate</td><td>Pierce Biotechnology, Thermo Fischer Scientific Inc</td><td>32132</td><td></td></tr><tr><td>Forene</td><td>Abbott</td><td>2594.00.00</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>10500-064</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Cell Strainers</td><td>Fischer Scientific&nbsp;</td><td>08-771-2</td><td></td></tr><tr><td>塩化アンモニウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>254134-5G</td><td></td></tr><tr><td>トリスベース</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10708976001</td><td></td></tr><tr><td>CD4+ CD62 L+ T アイソレーションキット&nbsp;</td><td>ミルテニーバイオテック</td><td>130-093-227&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>MACS LSカラム&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>MACS MS カラム&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>MidiMACS セパレーター</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>MiniMACS セパレーター</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-102</td><td></td></tr><tr><td>MACS マルチスタンド</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>給餌針 20G</td><td>SouthPointe Surgical Supply, Inc</td><td>FN-7903</td><td></td></tr><tr><td>ホルマリン溶液、中性緩衝、10%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>パラフィン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1496904</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxylin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9627</td><td></td></tr><tr><td>Eosin</td><td>Y Sigma-Aldrich</td><td>230251&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ジチオスレイトール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9779&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>コラゲナーゼ VIII 型</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-2139</td><td></td></tr><tr><td>ロズウェル パーク記念研究所 (RPMI) 培地</td><td>AppliChem</td><td>A2044, 9050</td><td></td></tr><tr><td>アジ化ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>438456</td><td></td></tr><tr><td>マウス BD Fc Block</td><td>BD Pharmingen</td><td>553141</td><td></td></tr><tr><td>FITC 標識モノクローナル抗体 V&szlig; 5.1, 5.2&nbsp;</td><td>BD Pharmingen</td><td>553189</td><td></td></tr><tr><td>APC標識モノクローナル抗体結合CD4 GK1.5&nbsp;</td><td>eBioscience</td><td>17-0041-83</td><td></td></tr><tr><td>FACSキャリバー&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FCS Express V3 ソフトウェア</td><td>DeNovo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Meta 走査型共焦点顕微鏡&nbsp;</td><td>ツァイス</td><td>LSM 710&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Workstation</td><td>Zeiss</td><td>LSM 7</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss ZEMソフトウェア&nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>v4.2.0.121</td><td></td></tr><tr><td>Maxisorpイムノプレート&nbsp;</td><td>NUNC, Roskilde</td><td>442404</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin 結合アルカリホスファターゼ</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>016-050-084</td><td></td></tr><tr><td>アルカリホスファターゼ基質 4-ニトロフェニルリン酸二ナトリウム塩六水和物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71768-5G</td><td></td></tr><tr><td>mAb R4-6A2</td><td>BD Biosciences</td><td>551216</td><td></td></tr><tr><td>mAb XMG1.2&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>554410</td><td></td></tr><tr><td>TECANマイクロプレート-ELISAリーダー</td><td>Tecan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EasyWinソフトウェア</td><td>Tecan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNase I 組換え4536282001</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

t細胞への抗原提示細胞による抗原の提示を研究するための抗原駆動性大腸炎モデルの開発

Development of an Antigen-driven Colitis Model to Study Presentation of Antigens by Antigen Presenting Cells to T Cells

炎症性腸疾患(IBD)は、消化管(GIT)に影響を与える慢性炎症です。この疾患に関与する免疫学的メカニズムを研究する最良の方法の1つは、大腸炎のT細胞移植モデルです。このモデルでは、免疫不全マウス(RAG-/-レシピエント)を、健康な野生型宿主由来のナイーブCD4+ T細胞で再構成します。
このモデルは、腸の炎症が永続するが、定義された抗原に依存しない場合に、病気や慢性炎症につながる最も初期の免疫学的事象の調査を可能にします。疾患プロセスにおける抗原提示細胞(APC)の潜在的な役割を研究するには、定義された共生由来抗原が大腸炎につながる抗原駆動型疾患モデルを持つことが有用です。したがって、抗原駆動型大腸炎モデルが開発されました。このモデルでは、OVAタンパク質の特定のエピトープのみを認識できるOT-II CD4+ T細胞を、CFP-OVA発現大腸菌にチャレンジしたRAG-/-宿主に転写します。このモデルにより、固有層におけるAPCとT細胞との間の相互作用を調べることができます。

抗原駆動型大腸炎モデルEを確立するために、 大腸菌株 CFPの遺伝子は、ニワトリオボアルブミンタンパク質のコード配列に融合され、融合構築物は、強力な構成的プロモーターP ハイパー （ 図1A）の制御下で発現されるプラスミドを含むように構成されています。蛍光顕微鏡は、組換えE.ことを示しています大腸菌 pCFP-OVAではなく、親のE.大腸菌 DH10Bは、CFP（ 図1B）を発現します 。 E.を生産する CFP-OVA- 大腸菌 インビトロで OT-II細胞を活性化し、 大腸菌とは対照的に、IFN-γ産生を誘導することができますCFPを発現している大腸菌株のみ（ 図2）。 <stro...

この抗原駆動型大腸炎モデルでは、赤色蛍光タンパク質を発現するOT-II CD4+ T細胞を、単核食細胞(MP)で緑色蛍光タンパク質を発現するRAG-/-マウスに養子として導入しました。宿主は、シアン蛍光タンパク質(CFP)に融合したオボアルブミンタンパク質(OVA)を発現する大腸菌(E.coli)で挑戦されました。

T細胞への抗原提示細胞による抗原の提示を研究するための抗原駆動性大腸炎モデルの開発

Inflammatory bowel disease (IBD) is a chronic inflammation which affects the gastrointestinal tract (GIT). One of the best ways to study the immunological ...

この抗原駆動性大腸炎モデルの全体的な目的は、抗原特異的大腸炎において、CX3およびCR1陽性の単核 phagocyte がCD4陽性T細胞と相互作用して活性化するかどうか、また、この単核 phagocyte 依存的なエフェクターT細胞の増殖が腸管固有層内で起こるか determining することです。この手法は、結腸固有層における抗原提示細胞とエフェクターT細胞の間でどのような相互作用が起こるかなど、炎症性腸疾患分野における重要な疑問への回答に役立ちます。本手法の主な利点は、免疫細胞の相互作用および炎症性腸疾患の病原性に至る要因を研究できる点にあります。本手法ではT細胞転移性大腸炎モデルを用い、単核細胞に緑色蛍光タンパク質を発現する免疫不全宿主へ、赤色蛍光抗原特異的ナイーブCD4 T細胞を転移させます。細胞転移後、青色蛍光抗原発現細菌を経口投与します。これにより、疾患進行のさまざまな段階において、宿主の腸管固有層で起こる免疫イベントをモニタリングすることが可能です。解剖用はさみを使用して結腸を縦に切り開き、25 mLのPBSを入れたペトリ皿の中で組織を洗浄し、破片や粘液を除去します。結腸を5～8 mmの大きさに切断し、10 mM HEPESおよび5 mM EDTAを添加した、カルシウムおよびマグネシウム不含の新鮮なDPBS 20 mLの中に断片を入れます。サンプルが入ったチューブを最大速度で30秒間ボルテックスします。次に、上皮を除去するために、緩やかに振盪しながら37°Cで10分間インキュベートします。インキュベート後、再び30秒間ボルテックスします。その後、上皮細胞を含む上清を廃棄します。組織片を、20 millilitersの新鮮なPBS、HEPES、およびEDTA緩衝液を含む新しいチューブに移し、前後のボルテックス操作を含むインキュベーションを繰り返します。3回目の繰り返し後、すべての上皮細胞が除去され、上清が透明になります。組織片をPBSで穏やかに洗浄し、残存する上皮細胞を除去します。組織片を2 mm四方の断片に切り分け、0.5 mg/mLのcollagenase type eightおよび10 U/mLのDNAse oneを添加した10 mLのRPI培地に移して消化させます。サンプルを30秒間ボルテックスします。その後、組織片を37 °Cで30～35分間振盪しながらインキュベートし、インキュベーション中は5分ごとにチューブをボルテックスします。組織の消化後、得られたスラリーを70 micronのセルストレーナーを用いて50 milliliterのコニカルチューブにろ過します。セルストレーナーを1回洗浄し、単一細胞懸濁液を遠心分離して回収します。最後に、細胞をPBSで1回洗浄し、遠心分離します。次に、トリパンブルー排除法により生存細胞数を決定しま

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Immunology and Infection

免疫学と感染症

本稿では、マウス腸管樹状細胞（DCs）およびマクロファージを迅速に単離するための手法を詳細に説明します。腸管DCsおよびマクロファージの表現型解析には多色フローサイトメトリー分析を用い、機能研究のための高純度な細胞集団を得るには、磁気ビーズによる濃縮後、セルソート（細胞分取）を行います。...

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エフェクターCD4の養子移入によるマウス腸の炎症の誘導<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt;高い</sup&gt;免疫不全マウスへのT細胞

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免疫蛍光を用いたTNBS誘発クローン病を用いたマウスの結腸におけるエストロゲン受容体の可視化

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HLA - Igは効率のためのベースの人工抗原提示細胞生体外で</emヒトCTLの>拡大

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T細胞への抗原提示細胞による抗原の提示を研究するための抗原駆動性大腸炎モデルの開発

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