T細胞への抗原提示細胞による抗原の提示を研究するための抗原駆動性大腸炎モデルの開発

この抗原駆動型大腸炎モデルでは、赤色蛍光タンパク質を発現するOT-II CD4⁺ T細胞を、単核食細胞(MP)で緑色蛍光タンパク質を発現するRAG^-/-マウスに養子として導入しました。宿主は、シアン蛍光タンパク質(CFP)に融合したオボアルブミンタンパク質(OVA)を発現する大腸菌(E.coli)で挑戦されました。

この抗原駆動型大腸炎モデルの全体的な目標は、抗原特異的大腸炎中にCX3、CR1陽性の単核食細胞がCD4陽性T細胞と相互作用して活性化するかどうか、およびこの単核食細胞依存性エフェクターT細胞の増殖が腸の固有ラミナ内で起こるかどうかを決定することです。この方法は、抗原提示細胞と結腸内膜のエフェクターT細胞内でどのような種類の相互作用が発生するかなど、炎症性腸疾患分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、免疫細胞の相互作用と炎症性腸疾患の病原性につながる要素の研究を可能にすることです。

この方法は、赤色蛍光抗原特異的ナイーブCD4T細胞を免疫不全宿主に転移させ、単核細胞に緑色蛍光タンパク質を発現させるT細胞移植性大腸炎モデルを使用します。細胞移植に続いて、青色蛍光抗原発現細菌の経口強制経口投与が行われます。宿主の腸内固有層で起こる免疫イベントは、疾患発症のさまざまな段階で監視できます。

解剖ハサミを使用して結腸を縦方向に開き、25ミリリットルのPBSを含むシャーレで組織を洗浄して、破片や粘液を取り除きます。結腸を5〜8ミリメートルの小片に切り、得られた断片をカルシウムとマグネシウムを含まない20ミリリットルの新鮮なDPBSに入れ、10ミリモルのHEPESと5ミリモルのEDTAを補充します。サンプルと一緒にチューブを最大速度で30秒間ボルテックスします。

その後、37°Cで10分間インキュベートし、穏やかに振とうして上皮を取り除きます。インキュベーションの終わりに、再び30秒間ボルテックスします。次に、上皮細胞を含む上清を捨てます。

組織片を20ミリリットルの新鮮なPBS、HEPES、およびEDTAバッファーを含む新しいチューブに移し、前後のボルテックスステップでインキュベーションを繰り返します。3回目の繰り返しの後、すべての上皮細胞が除去され、上清が透明になります。組織片をPBSでやさしく洗浄し、残留した上皮細胞を除去します。

組織片を2mmずつ2mmの小片に切断し、10mmのRPI培地で消化のために小片を移し、コラゲナーゼ8型1ミリリットルあたり0.5ミリグラムおよびDNAse1ミリリットルあたり10単位を補充します。サンプルを30秒間ボルテックスします。次に、組織片を摂氏37度で30〜35分間振とうしながらインキュベートし、インキュベーション中は5分ごとにチューブをボルテックスします。

組織が消化されたら、得られたスラリーを70ミクロンのセルストレーナーで50ミリリットルの円錐管に濾します。細胞ストレーナーを一度洗浄し、遠心分離により単一細胞懸濁液をスピンダウンします。最後に、細胞をPBSで一度洗浄し、遠心分離します。

次に、トリパンブルー排除により生細胞の数を決定します。シアン蛍光タンパク質オボアルブミンタンパク質産生大腸菌は、eとは対照的に、in vitroでOT-II細胞のインターフェロンガンマ産生を活性化します。

CFPのみを発現する大腸菌。大腸菌PCFP卵子を与えられたトランスジェニック緑色蛍光タンパク質発現マウスの結腸組織のex vivo 3D共焦点イメージングは、腸上皮細胞近くの結腸陰窩内に蛍光タンパク質発現細菌の存在を示し、宿主の腸食細胞と共局在しています。

OT-II赤色動物では、CD4陽性T細胞は、赤色蛍光タンパク質とVベータ5ポイントワンの共発現によって特徴付けられます。大腸菌PCFP卵子に挑戦すると、OT-II赤色CD4陽性CD62リガンド陽性T細胞を養子移植したBNTリンパ球欠損緑色蛍光タンパク質発現トランスジェニックマウスは、急速に体重を減らし、大腸炎の臨床徴候を発症します。

細胞移植の7日後、大腸菌をサンプリングした宿主食細胞はごくわずかで、PCFP卵子とOT-II赤色陽性細胞は検出されません。細胞移植の14日後、細胞移植後14日で、細胞移植をサンプリングした宿主食細胞は、大腸菌をサンプリングしました。

大腸菌PCFP卵子は、養子縁組に移されたOT-II赤色陽性細胞のすぐ近くに位置しています。細胞移植後21日までに、多数の宿主細胞が大腸菌PCFP卵子をサンプリングし、結腸固有層全体に分散しているドナーOT-II赤色陽性細胞が宿主腸食細胞と密接に接触しています。

このテクニックをマスターすると、適切に実行すれば4時間で完了することができます。この手順に続いて、腸リンパ球の染色や血清サイトカイン分析などの他の方法を実行して、CD4 T細胞の活性化状態に関する追加の質問に答え、大腸炎の重症度を確認できます。各開発の後、この技術は、マウスモデルで炎症性腸疾患につながる小さなイベントを探求するための免疫学の分野における研究への道を開きます。

このビデオを見れば、下流のex vivo分析のために結腸の固有層免疫細胞を単離する方法を十分に理解できるはずです。