神経系の再構築、変調、モデリングのための解剖学的にインスパイアされた3次元マイクロ組織工学ニューラルネットワーク

このプロトコルは、管状ハイドロゲルの内腔内の個別のニューロン集団にまたがる長く整列した軸索路で構成されるミニチュアの3次元構築物である、微小組織工学ニューラルネットワークまたはマイクロTENNSの作製について説明しています。Micro-TENNは、脳コネクトームの一般的なシステムレベルの解剖学的構造、具体的には、長い軸索路で接続された機能的に類似したニューロンのグループを再現します。マイクロTENNは、脳経路の細胞構造をエミュレートするために事前に増殖しているため、外傷や神経変性疾患によって失われた神経回路の標的再構成や、神経生物学的研究のバイオフィデリックモデルとして適用できる可能性があります。

このプロトコルの最も困難な側面の1つは、脳への低侵襲送達を可能にするために最終的に必要なミクロンスケールのフォームファクターでの作業です。まず、ガラス製の毛細管を手作業で2〜2.5cmの断片に砕き、各断片に1本の鍼を刺します。DPBS中の3パーセントアガロース1ミリリットルを空のシャーレの表面に移します。

導入された針に毛細管を保持し、チューブの一方の端を液体アガロースプールに接触させて、毛細管現象によって充填します。液体の上昇が止まったら、キャピラリーチューブをプールから取り外し、シャーレの表面に水平に置きます。次に、親指と人差し指をチューブの両側に置き、しっかりとつかみます。

もう一方の手で針をすばやく引き抜き、親指と人差し指でマイクロカラム自体がチューブから滑り落ちるのを防ぎます。次に、30ゲージの針をキャピラリーチューブに挿入して、マイクロカラムをDPBSを含むディッシュにゆっくりと押し出します。細い鉗子を使用して、DPBSから空の皿に1つのマイクロカラムを慎重に移します。

乾燥を防ぐためにマイクロピペットでマイクロカラムの上部に10マイクロリットルのDPBSを追加します。実体顕微鏡で作業しながら、マイクロメスでマイクロカラムをトリップさせ、希望の長さに短くします。次に、細い鉗子を使用して、トリミングしたマイクロカラムをDBPSを含む別のシャーレに移します。

DPBS含有シャーレ内のマイクロカラムを紫外線下で30分間滅菌します。ドリルビットを使用して、10センチメートルのシャーレの蓋に1センチメートルの間隔で4 x 4アレイとして16個の穴を穴を開けます。ケミカルヒュームフードの内側に、ペトリ皿の底部を使用して、27グラムのPDMSと3グラムの硬化剤を計量します。

マイクロスパチュラで攪拌して、薬剤を均等に分散させます。次に、PDMS硬化剤を穴の開いた蓋で覆います。ホースの一方の端をヒュームフードの真空ポートに接続し、もう一方の端を適切なサイズの漏斗のステムに挿入します。

1ミリリットルのピペットバルブを1ミリリットルの先端に取り付けてホースに入れ、バルブがホースを漏斗のステムに密封するまでホースを上に引っ張ります。次に、穴の開いた皿の蓋に漏斗を置き、利用可能な頑丈なサポートでホースを固定します。真空バルブを5分間開いて吸引し、気泡を表面に導きます。

5分後、バルブを閉じ、漏斗を取り外し、ペトリ皿をドラフトの表面に数回ぶつけて、残っている気泡を破裂させます。ピラミッド型ウェル3Dプリント型を12ウェル培養プレートの各ウェルに、ピラミッドを上に向けて配置します。次に、プレートの各ウェルが充填されるまで、PDMS硬化剤を金型の上に注ぎます。

蓋をしたプレートを摂氏60度のオーブンに1時間移して乾燥させます。オートクレーブでPDMSアレイを滅菌し、バイオセーフティキャビネットで作業した後、滅菌済みの12ウェルプレートの各ウェルに1つのマイクロウェルアレイを挿入します。ニューロン凝集体を形成するには、マイクロピペットを使用して、PDMSアレイの各マイクロウェルに12マイクロリットルの細胞懸濁液を添加します。

プレートを200倍gで5分間遠心分離し、マイクロウェルの底部に細胞を強制的に凝集させます。次に、約2ミリリットルの培地を各PDMSアレイの上部に慎重に追加して、播種したすべてのマイクロウェルを覆います。プレートを5%二酸化炭素中で摂氏37度で12〜24時間インキュベー

CEMコアの作製を開始するには、1型コラーゲン、ラミニン、培地をマイクロ遠心チューブで混合し、pHを7.2〜7.4に調整します。次に、CEMの入ったチューブを氷の上に置きます。滅菌鉗子を使用して、マイクロカラムを空の35mmまたは60mmのシャーレに移します。

次に、実体顕微鏡で作業しながら、1000マイクロリットルの先端に取り付けられた10マイクロリットルの先端を使用して、ルーメンから残留DPBSと気泡を抽出します。マイクロピペットで4〜5マイクロリットルのCEMをすばやく引き出し、マイクロピペットの先端をマイクロカラムの一端に置き、ルーメンを満たすのに十分なCEMを排出します。脱水症状を防ぐために、各マイクロカラムの周囲に2マイクロリットルのCEMを追加します。

ヒドロゲルCEMマイクロカラムをペトリ皿内で摂氏37度の5%二酸化炭素中で15分間インキュベートします。インキュベーション後すぐに細胞播種に進みます。約10〜20マイクロリットルの培地を、マイクロカラムを保持しているシャーレ内の2つの空き領域に移します。

マイクロピペットを使用して神経細胞凝集体を個別に収集し、それらをコンストラクトを含むペトリ皿に移します。鉗子で凝集体を培養培地の小さなプールの1つに移し、細胞の健康を維持します。実体顕微鏡で観察しながら、鉗子を使用して、一方向マイクロTENNの場合はマイクロカラムの一方の端に、双方向アーキテクチャの場合は両端に凝集体を挿入します。

次に、播種したマイクロカラムを他の小さな培地プールに移動して、脱水を防ぎ、凝集体の健康を維持します。すべてのマイクロカラムをロードしたら、5%二酸化炭素中37°Cで45分間インキュベートし、凝集体がCEMに付着します。インキュベーション後、実体顕微鏡を使用して、凝集体がマイクロカラムの端に残っていることを確認します。

最後に、マイクロTENNsが入ったシャーレにピペットで培地を慎重に浸します。長期培養のために、5%二酸化炭素で摂氏37度のインキュベーターに皿を置きます。これらの位相差画像は、in vitroで最大8日間、一方向2ミリリットル長のmicro-TENNを示しています。

これらの画像では、マイクロカラムの両端にあるニューロンの凝集体と、整列した軸索路が内腔を横切って突き出ていることに注意してください。ここで見られるように、軸索路はin vitroでマイクロカラムのほぼ全長を5日間延長します。5ミリメートル双方向マイクロTENNSの場合、軸索路はin vitroで5日でマイクロカラムの長さに占められ、このアーキテクチャは少なくともin vitroで10日まで維持されます。

次の 2 つの画像は、手順に関する問題のトラブルシューティングに役立ちます。この画像は、製造中にDPBS、CEM、または培地を完全に除去および/または蒸発させた結果として、完全に脱水された乾燥ハイドロゲルマイクロカラムを示しています。この画像は、鍼と毛細管の同心円状の整列がないために、内腔が外壁を覆うマイクロカラムを示しています。

最後に、この共焦点画像は、in vitroで28日目の双方向マイクロTENNを示しており、細胞核を青でHoechstで染色し、赤でTudge Oneで標識した軸索を、緑色でシナプシン1で標識したシナプス前ブートンで染色したものです。軸索路に沿った凝集体からの細胞移動は、示唆されているように、シナプス前末端の存在下で見られます。Micro-TENNは、コネクトーム細胞構造の主要な側面をエミュレートする、解剖学的に着想を得た自己完結型のコンストラクトです。したがって、マイクロTENNは、脳への移植時に失われた神経経路を置き換える手段を提供する可能性があります。

この方法の重要な構成要素には、縦方向の軸索成長を可能にする管状生体材料包囲方式と、内部に沿った軸索路の端に限定された細胞体の適切な細胞構造を確実に得る集約法が含まれます。これらの方法を習得した後、この技術の原理は、特定の用途に応じて、他の細胞表現型や生体材料成分とマイクロTENNを構築するために適用できます。