神経系の再構築、変調、モデリングのための解剖学的にインスパイアされた3次元マイクロ組織工学ニューラルネットワーク

本プロトコルでは、マイクロ組織工学神経ネットワーク（micro-TENNs）の作製について説明します。micro-TENNsは、管状ハイドロゲルの内腔内で、離れた神経細胞集団をまたいで伸びる、整列した長い軸索束で構成される小型の三次元構造体です。micro-TENNsは、脳コネクトームの一般的なシステムレベルの解剖学的構造、具体的には、長い軸索束で接続された機能的に類似した神経細胞群を再現しています。脳経路の細胞構築を模倣するようにあらかじめ育成されるため、micro-TENNsは、外傷や神経変性疾患によって失われた神経回路の標的再構築や、神経生物学的研究のための生体忠実度の高いモデルとして応用できる可能性があります。

本プロトコルで最も困難な点の一つは、脳への低侵襲的な送達を実現するために不可欠な、ミクロンスケールのフォームファクタを扱うことです。まず、ガラスキャピラリーチューブを手作業で 2 ～ 2.5 cm の断片に分割し、各断片に鍼を1本ずつ挿入します。DPBSで調製した 3 % アガロース 1 mL を、空のペトリ皿の表面に転移させます。

導入済みニードルでキャピラリーチューブを保持し、チューブの一端を液体アガロースプールに接触させ、毛細管現象によって液体を満たします。液面の上昇が止まったら、キャピラリーチューブをプールから取り出し、ペトリ皿の表面に水平に置きます。次に、チューブの両側に親指と人差し指を添えて、しっかりと掴みます。

親指と人差し指でマイクロカラム自体がチューブから滑り出ないように固定しながら、もう一方の手で素早く針を抜き取ります。次に、30ゲージの針をキャピラリーチューブに挿入し、DPBSが入ったディッシュの中にマイクロカラムをゆっくりと押し出します。精密切削ピンセットを用いて、DPBSから空のディッシュへマイクロカラムを1つずつ慎重に移動させます。

乾燥を防ぐため、マイクロピペットを用いてマイクロカラムの上部に10 µLのDPBSを加えます。実体顕微鏡下で、マイクロメスを用いてマイクロカラムを切り取り、目的の長さに短くします。その後、精密ピンセットを使用して、切り取ったマイクロカラムをDPBSを含む別のペトリ皿に移します。

DPBSを含むペトリ皿内のマイクロカラムを、紫外線下で30分間滅菌します。ドリルビットを使用して、10 cmのペトリ皿の蓋に、1 cm間隔で4 cm四方の4×4配列となるよう16個の穴を開けます。化学薬品用ドラフトチャンバー内で、ペトリ皿の底部分を用いてPDMS 27 gと硬化剤3 gを計量します。

マイクロスパチュラで撹拌し、剤を均一に分散させます。次に、穿孔した蓋でPDMS硬化剤を覆います。ホースの一端をドラフトの真空ポートに接続し、もう一端を適切なサイズの漏斗のステムに挿入します。

1 mLピペットバルブを装着した1 mLチップをホースに差し込み、バルブがホースと漏斗のステムを密閉するまでホースを上に引き上げます。次に、漏斗を穴を開けたディッシュの蓋の上に配置し、利用可能な頑丈な支持台でホースを固定します。真空バルブを5分間開き、吸引して気泡を表面まで浮上させます。

5分後、バルブを閉じて漏斗を取り除き、ペトリ皿をドラフトの表面に数回叩きつけて、残っている気泡を消します。12ウェル培養プレートの各ウェルに、ピラミッド型の3Dプリント型を、ピラミッドの頂点が上を向くように配置します。次に、プレートの各ウェルが満たされるまで、型の上にPDMS硬化剤を注ぎます。

カバーをしたプレートをオーブンに入れ、60 °Cで1時間乾燥させます。オートクレーブでPDMSアレイを滅菌した後、バイオセーフティキャビネット内で、滅菌済みの12ウェルプレートの各ウェルにマイクロウェルアレイを1つずつ挿入します。神経凝集体を形成させるため、マイクロピペットを用いて、PDMSアレイの各マイクロウェルに細胞懸濁液を12 µLずつ加えます。

プレートを200 ×gで5分間遠心分離し、マイクロウェルの底に細胞を集積させます。次に、播種したすべてのマイクロウェルを覆うように、各PDMSアレイの上部に約2 mLの培地を慎重に加えます。プレートを37 °C、5% CO2条件下で12〜24時間インキュベートします。

CEMコアの作製を開始するには、1型コラーゲン、ラミニン、および培地をマイクロ遠心チューブ内で混合し、pHを7.2から7.4に調整します。次に、CEMが入ったチューブを氷上に置きます。滅菌済みピンセットを使用して、マイクロカラムを空の35mmまたは60mmシャーレに移します。

次に、実体顕微鏡下で、1000 µLチップに取り付けた10 µLチップを用いて、管腔内の残留DPBSと気泡を取り除きます。マイクロピペットで4〜5 µLのCEMを素早く吸い上げ、マイクロカラムの一端にチップを当て、管腔を満たすのに十分な量のCEMを注入します。脱水を防ぐため、各マイクロカラムの周囲に2 µLのCEMを加えます。

ハイドロゲルCEMマイクロカラムを、37 °C、5% 二酸化炭素条件下でペトリ皿に入れ、15分間インキュベートします。インキュベーション後、直ちに細胞播種を行ってください。マイクロカラムが入ったペトリ皿の空いている2か所に、培養液を約10〜20 µLずつ分注します。

マイクロピペットを使用して神経細胞凝集体を個別に回収し、コンストラクトが入ったペトリ皿に移します。細胞の健全性を維持するため、ピンセットを用いて凝集体を培養液の小さなプールの一箇所に移動させます。実体顕微鏡下で観察しながら、単方向マイクロTENNsの場合はマイクロカラムの一端に、双方向構造の場合は両端に、ピンセットで凝集体を挿入します。

次に、脱水を防ぎ凝集体の健康状態を維持するため、播種したマイクロカラムを別の少量の培養液プールに移動させます。すべてのマイクロカラムへの充填が完了したら、凝集体をCEMに接着させるため、37°C、5% CO2条件下で45分間インキュベートします。インキュベーション後、実体顕微鏡を用いて、凝集体がマイクロカラムの端に留まっていることを確認してください。

最後に、ピペットを使用して、micro-TENNsを含むペトリ皿に培養液を慎重に満たします。これらの皿を、37°C、5% carbon dioxideのインキュベーターに入れ、長期培養を行います。これらの位相差顕微鏡像は、in-vitroで最大8日間にわたる単方向の2-milliliter長のmicro-TENNsを示しています。

これらの画像において、マイクロカラムの両端にあるニューロン凝集塊と、管腔を横切って伸びる整列した軸索束に注目してください。ここで見られるように、培養5日目までに軸索束はマイクロカラムのほぼ全長にわたって伸展します。5 mmの双方向マイクロTENNでは、培養5日目で軸索束がマイクロカラムの全長に分布し、この構造は少なくとも培養10日目まで維持されます。

以下の2つの画像は、手順における問題のトラブルシューティングに役立ちます。この画像は、作製中にDPBS、CEM、または培地が完全に除去または蒸発した結果、完全に脱水された乾燥状態のハイドロゲルマイクロカラムを示しています。この画像は、鍼針とキャピラリーチューブが同心円状に配置されていなかったため、ルーメンが外壁に沿って形成されたマイクロカラムを示しています。

最後に、この共焦点画像は、in-vitroで28日経過した双方向micro-TENNを示しています。細胞核をHoechstで青色に、軸索をtuj1で赤色に、そしてシナプス前ボタンをsynapsin 1で緑色に染色しています。想定されていた通り、シナプス前末端が存在する状態で、凝集塊から軸索路に沿った細胞移動が観察されます。micro-TENNは、コネクトームの細胞構築の主要な側面を模倣した、解剖学的な根拠に基づく自己完結型の構築物です。したがって、micro-TENNは脳内に移植された際、失われた神経経路を置換する手段となる可能性があります。

本手法の重要な構成要素には、軸索の縦方向への成長を可能にする管状バイオマテリアル封入スキームと、内部に沿った軸索路の両端に細胞体を限定させ、適切な細胞構築を確実に得るための凝集法が含まれます。これらの手法を習得することで、具体的な応用に合わせ、他の細胞表現型やバイオマテリアル構成要素を用いてマイクロTENNを構築するという本技術の原理を適用することが可能です。