マルチモーダル分子イメージングアプリケーションのためのBiofunctionalizedプルシアンブルーナノ粒子

この手順の全体的な目的は、マルチモーダル分子イメージング剤として使用するためのバイオ機能化プルシアンブルーナノ粒子を合成することです。まず、MRI信号を増強するガドリニウムまたはマンガンイオンを含むプルシアンブルーナノ粒子を合成します。次に、ナノ粒子の表面に蛍光アビドンを結合させ、蛍光イメージング能を付与します。

次に、アビドン被覆ナノ粒子を、目的の細胞標的化ビオチン化抗体でバイオ機能化します。最終ステップとして、バイオ機能化ナノ粒子の粒子径、ゼータ電位、および経時的安定性を測定し、品質管理チェックを行います。最終的に、これらのバイオ機能化ナノ粒子をマルチモーダル分子イメージングに応用し、蛍光イメージングおよびMRIを用いて、混合物中の特定の標的細胞集団を可視化します。

現在市販されている造影剤は通常シングルモードであり、解像度は解剖学的レベルに留まっています。プルシアンブルーナノ粒子は、MRIと蛍光という2つの相補的なイメージングモードを組み合わせており、分子イメージングおよび細胞内レベルでの解析を可能にします。マルチモーダルナノ粒子の応用範囲は、治療反応のモニタリングに加え、癌や炎症性疾患の診断にまで及んでいます。

これは、生物学的機能化されたナノ粒子が、体内の特定の領域にある細胞集団を標的として結合できるためです。この手法は、がんや炎症性疾患の診断および治療反応に関する知見を提供できるだけでなく、分子イメージングの感度と特異性の恩恵を受ける他の病理学的状態にも適用可能です。蛍光およびMRIを用いる本研究において、私たちは、プルシアンブルー（ヒトへの経口摂取がFDAによって承認されている薬剤）がワンポット合成スキームで安定して合成でき、標準的なバイオコンジュゲート技術を用いて強固に生物学的機能化できることを突き止めた際に、これらのナノ粒子を製造するという着想を得ました。

まず、5 mLの脱イオン水にヘキサシアニド鉄(II)酸カリウムを溶解させ、5 mM溶液（溶液A）を調製します。次に、マンガン・プルシアンブルーナノ粒子の合成のため、10 mLの脱イオン水に2.5 mMの塩化鉄(III)と2.5 mMの塩化マンガン(II)を含む溶液Bを調製します。その他のナノ粒子は、テキストプロトコルに記載されている通りに合成できます。溶液Bを丸底フラスコに移し、室温で1000 RPMで撹拌します。

ペリスタルティックポンプを用い、溶液Aを10 milliliters/hourの速度で容器に滴下します。溶液Aの添加が完了した後、混合物を1000 RPMでさらに30分間撹拌します。その後、混合物を1 milliliterずつマイクロ遠心チューブに移し、各チューブに5 milli sodium chlorideを0.2 milliliters加えます。

チューブを20,000 ×gで10分間以上遠心分離し、ナノ粒子のペレットを残して上澄み液を慎重に除去します。次に、各ペレットに脱イオン水を1 mL加えます。マイクロチップを用いて、超音波処理によりナノ粒子を溶液中に均一に懸濁させます。

最終遠心後、懸濁液から初期反応成分を除去するために、ナノ粒子をさらに少なくとも3回洗浄します。本文のプロトコルに従ってナノ粒子を蛍光染料でコーティングした後、ナノ粒子を1 mLの脱イオン水に再懸濁させ、ビオチン化抗体ストックを冷蔵庫から取り出します。ここでは、anti neuron glial antigen 2およびanti-human eotaxin 3を使用します。ビオチン化抗体を0.2 µmのナイロンマイクロ遠心フィルターに移し、チューブを14,000 ×gで10分間遠心分離します。

次に、Adenコーティングナノ粒子1 mgあたり0.05 mg以下の抗体を加え、遮光するためチューブをアルミホイルで覆います。チューブを4 °Cで2～4時間、緩やかに振盪しながらインキュベートします。抗体を結合させた後、1 mg/mLのナノ粒子サンプル10 µLを、使い捨てプラスチックチューブに入れた脱イオン水990 µLに加え、キャップをして転倒混和させます。

次に、測定角173度の動的光散乱システムを用いて、ナノ粒子の平均サイズを測定します。まず、PBS中で細胞濃度が約100,000 cells/mLとなるよう、10 mLの細胞懸濁液を調製します。各細胞株の比率を変化させた混合培養チューブは、テキストプロトコルに記載されている通りに調製し、各チューブに5% BSAを2 mL加えて細胞をブロッキングし、非特異的結合を最小限に抑えます。その後、1 mg/mLのバイオ機能化ナノ粒子を各チューブに1 mLずつ添加し、混合物を1時間インキュベートします。

次に、チューブを1000 ×gで5分間遠心分離し、ペレットを1 mLのPBSで再懸濁することで、未結合のナノ粒子を洗い流します。この工程をさらに少なくとも2回繰り返します。10% formaldehyde含有PBSを用いて細胞を固定し、その後、細胞を染色するために10 µg/mLのseven amino actinおよびmycin D含有PBSを添加し、チューブを氷上で30分間インキュベートした後、PBSで細胞を洗浄します。

次に、サンプルをフローサイトメーターにロードし、各サンプルからゲート設定した10,000個の細胞を解析します。蛍光ナノ粒子が結合した細胞を共焦点レーザー走査顕微鏡で観察するための同様の手順は、テキストプロトコルに記載されています。まず、T 75フラスコ内の細胞を約80%コンフルエンスまで増殖させ、その後、5 mLのPBSで細胞を洗浄して培液を除去します。

1% BSA含有PBSを5 mL加え、細胞を1時間ブロッキングします。次に、0.5 mg/mLの抗体コーティングナノ粒子を5 mLフラスコに加え、ナノ粒子を結合させるために細胞を1時間インキュベートします。その後、結合しなかったナノ粒子を除去するため、PBS 5 mLで細胞を3回洗浄します。

次に、0.25%トリプシンEDTA溶液を2 mL加え、5分間インキュベートして細胞をフラスコから剥離させます。DMEMを8 mL加えてトリプシンを失活させた後、細胞懸濁液を遠心管に移します。1000 ×gで5分間遠心分離し、細胞をペレット状にします。

次に、上清を吸引し、細胞を1 mLのPBSで再懸濁します。細胞を固定するために10%ホルムアルデヒド（PBS溶液）を1 mL加え、その後、各サンプル100 µLを96ウェル平底プレートの別々のウェルに分注します。各ウェルに脱イオン水で溶解した1%アガロース溶液を100 µL加え、ピペッティングにより混合します。

ゲルを4 °Cで12時間凝固させ、ファントムを作成します。ゲルの凝固後、ファントムを水平設置の3 T臨床用マグネット内に、2%アガルの150 cm立方体ブロックに隣接して配置します。次に、ファントムとアガールブロックを8チャンネルHDブレインコイルの中心に固定し、緩和時間を測定します。測定には、96ウェルプレートの中央高さで撮影した厚さ0.5 mmの冠状断スライスを使用します。生成されたナノ粒子の流体力学的直径を決定するために、動的光散乱法を用いました。安定性試験により、水ベースおよび細胞培地ベースの両方の実験で使用されるナノ粒子の長期安定性を検証しました。

共焦点レーザー顕微鏡により、EOT3に対する抗体を担持した蛍光ナノ粒子が、EOL1細胞の表面に特異的に結合していることが示されました。NG2に対する抗体を用いた場合は、BSGニューロスフェアの表面に特異的に結合しました。フローサイトメトリーによる測定の結果、バイオ機能化ナノ粒子を用いて、標的細胞集団を正常に蛍光標識できることが確認されました。

さらに、これらのナノ粒子は、標的細胞とコントロール細胞の比率が低い混合物においてさえ、細胞の特定のサブポピュレーションを標的とする能力を示しました。最終的に、バイオ機能化ナノ粒子は標的細胞のMRIコントラストを向上させました。2種類の抗体をロードしたナノ粒子で処理した細胞は、コントロール粒子で処理した細胞と比較して、T1強調画像において高信号を示しました。

対照的に、A NNG two ナノ粒子は、コントロール粒子と比較して T two 重み付けシーケンスにおいて低信号強度を示しました。適切に実施すれば、バイオ機能化されたプルシアンブルーナノ粒子の合成は2日以内に完了させることができます。

この手順と同様に、ナノ粒子に異なるバイオポリマーや標的リガンドを用いてバイオ機能化させることで、新たな疾患や条件の検討が可能です。このビデオを視聴することで、細胞集団を標識するための蛍光およびイメージングアプリケーション向けプルシアンブルーナノ粒子の合成方法について、十分に理解できたはずです。臨床用MRIマグネット内で研究を実施する際は、安全ガイドラインおよび標準作業手順書を厳格に遵守することを忘れないでください。