マルチモーダル分子イメージングアプリケーションのためのBiofunctionalizedプルシアンブルーナノ粒子

この手順の全体的な目標は、マルチモーダル分子イメージング剤の使用のために、生体官能基化されたプルシアンブルーナノ粒子を合成することです。これは、まず、ガドリニウムイオンまたはマンガンイオンを含むプルシアンブルーナノ粒子を合成することで達成され、MRI信号が増強されます。第2のステップは、ナノ粒子の表面に蛍光アバドンを付着させることで、蛍光イメージング能力を付与します。

次に、アバドンでコーティングされたナノ粒子を、目的の細胞標的ビオチン化抗体で生体官能化します。最後のステップは、生体官能化ナノ粒子のサイズ、ゼータ電位、および時間的安定性を測定することにより、生体機能化されたナノ粒子の品質管理チェックを行うことです。最終的に、生体官能基化ナノ粒子は、蛍光イメージングとMRIを使用して混合物内の特定の標的細胞集団を視覚化するためのマルチモーダル分子イメージングアプリケーションに利用されます。

現在の市販のイメージング剤は、通常、シングルモードであり、解剖学的レベルでのみ分解能を提供します。プルシアンブルーナノ粒子は、MRIと蛍光という2つの相補的なイメージングモードを組み合わせ、分子イメージングと細胞内レベルを可能にします。マルチモーダルナノ粒子の応用は、がんや炎症性疾患の治療反応のモニタリングに加えて、がんや炎症性疾患の診断にも広がっています。

これは、生体機能化されたナノ粒子が、体の特定の領域内の細胞集団を標的にして結合できるためです。この方法は、がんや炎症性疾患の診断や治療に対する反応に関する洞察を得ることができますが、分子イメージングの感度と特異性の恩恵を受ける他の病理学的状態にも適用できます。蛍光とMRIを使用して、これらのナノ粒子を製造するというアイデアを最初に思いついたのは、プルシアンブルーとFDAが承認したヒト経口消費用薬剤を、一液合成スキームを使用して安定的に合成し、標準的なバイオコンジュゲート技術を使用して頑健に生体官能化できると判断したときでした。

まず、脱イオン水の5ミリリットルに2つのヘキササノフェレートカリウムの500万モル溶液を準備して、2.5ミリモルの鉄、3つの塩化物、および2.5ミリモルのマンガンを含む次の修復ソリューションBを作成します。マンガンプルシアンブルーナノ粒子の合成のための脱イオン水10ミリリットル中の2つの塩化物。他のナノ粒子は、テキストプロトコルに示されているように合成することができ、溶液BをAの丸底フラスコに移し、室温で1000RPMで溶液を攪拌します。

蠕動ポンプを使用して、溶液を1時間あたり10ミリリットルの速度で容器に滴下します。溶液Aの添加が完了したら、混合物を1000RPMでさらに30分間撹拌します。次に、混合物の1ミリリットルのアリコートをマイクロ遠心チューブに移し、各チューブに0.2ミリリットルの5ミリ塩化ナトリウムを追加します。

チューブをGの20, 000倍で少なくとも10分間遠心分離し、その後、ナノ粒子のペレットを残して、燻腸を慎重に除去します。次に、各ペレットに1ミリリットルの脱イオン水を追加します。マイクロチップを使用して、超音波処理によりナノ粒子を溶液中に均一に懸濁します。

最終スピン後に浮遊液から初期反応の成分を除去するために、ナノ粒子を少なくともさらに3回洗浄し、テキストプロトコルに記載されているようにナノ粒子を蛍光デンでコーティングした後、ナノ粒子を1ミリリットルの脱イオン水に再懸濁し、ビオチン化抗体ストックを冷蔵庫から取り出します。ここは。抗ニューロングリア抗原2と抗ヒトエオタキシン3を使用します。ビオチン化抗体を0.2 μ ナイロンマイクロフュージフィルターに移し、次いでチューブを 14, 000 倍 G で 10 分間遠心分離します。

次に、Adenでコーティングしたナノ粒子1ミリグラムあたり0.05ミリグラム以下の抗体を添加し、チューブをアルミホイルで覆って光から保護します。チューブを4°Cで2〜4時間穏やかに振ってインキュベートします。抗体を付着させた後、使い捨てプラスチックのベテインキャップに990マイクロリットルの脱イオン水に1ミリグラムあたり1ミリグラムのナノ粒子サンプルを10マイクロリットル加え、それをVにして混合します。

次に、測定角度173度の動的光散乱システムを使用して、ナノ粒子の平均サイズを決定します。各細胞株の異なる比率を含む混合培養チューブのための混合培養チューブのためのミリリットルあたり約100、000細胞の濃度でPBS中の細胞の10ミリリットルの懸濁液を準備することから始める細胞をブロックし、非特異的結合を最小限に抑えるために、各チューブに5%BS、Aの2ミリリットルでテキストプロトコルに記載されているように調製する必要があります。次に、1ミリリットルあたり1ミリグラムを1ミリリットル加え、各チューブにナノ粒子を生体官能化し、混合物を1時間インキュベートします。

次に、チューブをGの1000倍で5分間回転させ、ペレットを1ミリリットルのPBSで再度曲げることにより、結合していないナノ粒子のない細胞をすすぎます。このプロセスを少なくとも 2 回繰り返します。PBSで10%ホルムアルデヒドを使用して細胞を固定し、PBSで1ミリリットルあたり10マイクログラム、7つのアミノアクチン、およびマイシンDを加えて細胞を染色し、チューブを氷上で30分間インキュベートした後、PBSで細胞をすすぎます。

次に、サンプルをフローサイトメーターにロードし、各サンプルから10, 000個のゲート細胞を分析します。レーザー共焦点顕微鏡を使用して蛍光ナノ粒子に結合した細胞を画像化するのと同様の手順は、テキストプロトコルに記載されています。まず、T 75フラスコの細胞を約80%のコンフルエンスまで着用し、次に細胞を培地から解放し、5ミリリットルのPBSですすいでください。

PBSに5ミリリットルの1%BSAを加え、細胞を1時間ブロックします。次に、0.5ミリリットル/ミリグラム/ミリリットルの抗体被覆ナノ粒子をフラスコに加え、細胞を1時間インキュベートしてナノ粒子を結合させます。次に、細胞を5ミリリットルのPBSで3回すすぎ、結合していないナノ粒子を除去します。

次に、2ミリリットルの0.25%tripsin EDTA溶液を加え、細胞を5分間インキュベートしてフラスコから細胞を分離します。8ミリリットルのDMEMを添加してトライインを急冷し、細胞懸濁液を遠心チューブに移します。それらをGの1000倍で5分間回転させ、細胞をペレット化します。

次に、仰臥位を吸引し、細胞を1ミリリットルのPBSに再懸濁します。PBSに1ミリリットルの10%ホルムアルデヒドを加えて細胞を固定し、各サンプルの100マイクロリットルを96ウェル平底プレートの別々のウェルに移します。脱イオン水に100マイクロリットルの溶融1%arosを各ウェルに加え、ピペッティングで上下に混合します。

ゲルを摂氏4度で12時間固化させて、ファントムを生成します。ゲルが固まったら、ファントムを2%寒天の固体150センチメートル立方体ブロックの隣にある水平の3T臨床磁石に置きます。次に、ファントムと寒天ブロックを8チャンネルのHDブレインコイルの中心に固定して緩和時間を測定し、96ウェルプレートの中央高さで撮影された厚さ0.5ミリメートルのコロナスライスを使用して、生成されたナノ粒子の流体力学的直径を決定しました 安定性 ナノ粒子の長期安定性を確認した研究は、水ベースおよび細胞培地ベースの実験の両方で使用されます。

レーザー共焦点顕微鏡法では、EOT 3の抗体を充填した蛍光ナノ粒子がEOL One細胞の表面に特異的に発見されたことが示されました。NG 2の抗体を使用すると、BSGニューロスフェアの表面に特異的に結合します。生体機能化ナノ粒子は、フローサイトメトリーで測定した標的細胞の集団を蛍光標識することに成功しました。

さらに、ナノ粒子は、低標的細胞でも混合物中の細胞の特定の亜集団を標的とすることができ、細胞比率を制御することができました。最後に、生体官能化ナノ粒子は、標的細胞、nngを充填したナノ粒子で処理された細胞のMRIコントラストを増加させた。2つの抗体は、対照粒子で処理した細胞と比較して、T one加重配列で高強度を示しました。

対照的に、A NNGの2つのナノ粒子は、対照粒子と比較して、Tの2つの重み付け配列に低強度を与えました。かつてのマスター。バイオ官能基化プレシオンブルーナノ粒子の合成は、適切に行えば2日以内に完了することができます。

この手順と同様に、ナノ粒子は、さまざまな生体高分子と標的リガンドを使用して生体修飾され、新しい疾患や新しい状態を調査することができます。このビデオを見れば、蛍光や細胞集団を標識するためのイメージングアプリケーションのためのプルシアンブルーナノ粒子の合成方法について十分に理解できるはずです。臨床用MRI磁石での研究を実施するための安全ガイドラインと標準操作手順に厳密に従うことを忘れないでください。