共焦点肉眼検査を使用した生後小脳顆粒細胞の移動のex vivoイメージング
2015年5月12日
出生後の小脳の発達中に、胚帯に由来する未熟な顆粒細胞は、最終目的地に到達し、ニューロンネットワークを確立するための明確な移動の様相を示します。このプロトコルでは、小脳スライスの準備と、ニューロンの移動を調節する要因を調査するために使用される共焦点巨視的アプローチについて説明します。
この手順の全体的な目標は、生きている脳スライス内の移動するニューロンを視覚化することです。これは、最初にP 10ラットから小脳を解剖することによって達成されます。次のステップは、急性小脳切片を調製し、蛍光プローブでニューロンを標識することです。
次に、タイムラプス実験をマクロ共焦点イメージングまたは共焦点顕微鏡法で行います。最後のステップは、結果の映画のニューロンを追跡することです。最終的に、ex vivo顕微鏡法は、ニューロンの移動を調節する内因性因子または有毒物質の役割を示すために使用されます。
共焦点顕微鏡法のような既存の方法のこの技術の主な利点は、マクロ共焦点イメージングが、鼠径部インサートに直接配置された脳の芸術スライスを残すときの視界の感触を向上させることです。私は最初に、私は共焦点顕微鏡実験のための脳の芸術スライスを転送し、安定させるのが困難だったときに、この方法のアイデアを持っていた細かい虹彩はさみを使用して、頭蓋骨の基部から吻側領域に2つの横方向の切開を繊細に行う、斬首されたP 10ラットの子犬の頭蓋骨にアクセスすることから始めます。次に、解剖された頭蓋骨を2つの3番鉗子で取り除き、脳と頭蓋骨の間の接着を切断します。
次に、ヘラのスプーンの端で脳をすくい取り、氷の上に2ミリリットルの冷たいHBSSを入れた35ミリメートルのシャーレに入れます。次に、実体顕微鏡下で、2つの3番鉗子を使用してD裂傷によって脳から小脳を分離します。小脳を氷冷バッファー付きの新しい皿にスプーンで入れます。
次に、同じツールを使用して、残っている脊髄と剥離膜を取り外して廃棄します。15番の外科用刃が付いた3番の頑丈なメスの柄を用意します。実体顕微鏡下でブレードを使用して、真と右半球の間の小脳を切断します。
次にビブラートで、シアノクリレート接着剤を試料ディスクに一滴垂らし、溶媒蒸気が消えるのを15〜25秒待ってから、小脳をディスクに移します。次に、小脳の縁を検体椎間板に固定し、10秒待ちます。次に、マニピュレーターを使用して、小脳の横軸がナイフホルダーに対して垂直になるように、標本ディスクをバッファートレイに挿入します。
必ずアルミレンチを使用してディスクを固定してください。次に、小脳をHBSSで慎重に覆い、砕いた氷を冷却浴に入れます。試料をスライスするには、洗浄したブレードを配置し、その端が試料の後端のすぐ後ろになるようにします。
これをアイシングの開始点として定義します。次に、forwardコマンドを使用して、端点を試験片の前端を過ぎたところに定義します。次に、スライスの厚さを180ミクロンに設定します。
次に、切片化速度を2.5に、周波数を8に設定し、試験片の切片化を開始します。小脳ごとに最大5つのスライスを収集します。切り捨てられた幅広のイノシシガラスピペットを使用して各セクションをピックアップします。
切片を氷の上に冷たいHBSSが入った皿に移します。実体顕微鏡でスライスを採取した後、2つのNo.5鉗子を使用して髄膜を慎重に取り除きます。また、プローブのローディングを改善するために、LOEを静かに分離します。
試料をスライスした後、切り捨てられた幅広のイノシシピペットを使用して、HBSSを各ウェルに最大3スライスの6ウェルプレートロードに移します。次に、各ロード中の培地を空にした後、サンプルを光から保護するために蛍光色素の10マイクロモルを含むローディング溶液を5ミリリットルよく加え、プレートをホイルで覆います。次に、プレートを35RPMに設定されたミューテーターに置きます。
プレートを室温で10分間インキュベートし、色素が細胞ウェルを標識します。次に、前と同様にスライスを3ミクロンの細孔を持つトランズウェルインサートのメンブレンに移します。次に、ローディングメディアを吸引し、スライスだけを残します。
次に、インサートとスライスを取り外して、ウェルに1.9ミリリットルのDMEMを充填します。次に、インサートを元に戻し、さらに100マイクロリットルのDMEMを追加して組織を覆います。この調製物を2時間インキュベートすると、顆粒細胞が見えるようになります。
蓋をせずにプレートを、共焦点顕微鏡上のガスが一定の流れを持つ環境チャンバーに移します。次に、タイムラプス実験用の共焦点顕微鏡のプレートインサートにガラスカバーを置きます。細胞をチャンバー内でさらに2時間インキュベートしてから進めます。
組織スライス内を移動する顆粒細胞を可視化するには、488ナノメートルの光で調製物を照らし、2 x ドライ対物レンズを使用します。タイムラプス動画の各画像について、標準偏差モードを使用してザック投影を実行し、各画像のコントラストと明るさのレベルを調整して、標識された顆粒細胞が見やすくなるようにします。次に、粒子分析メニューから手動追跡プラグインを選択します。
プラグインを使用して、タイムラプス画像シーケンス全体でラベル付けされた各セル本体の中心点をクリックします。次に、未加工のトラッキングデータをスプレッドシートにエクスポートして、さらに分析します。Image Jからエクスポートされた生のトラッキングデータを、プログラムを使用して各セルと関連する位置を識別するスマートな自家製ツールで再編成します。
各セルの合計移動距離と平均移動速度を計算します。出生後初期の小脳では、顆粒細胞は異なる皮質層を通過するときに、移動のモードと速度に大きな変化を示します。PMラット小脳組織切片中のCTG標識顆粒細胞を調べた。
説明したように、顆粒細胞は分子層内を平均18ミクロン/時間で放射状に移動しました。次に、別の製剤を使用して、移動速度を変えると予想される薬物の効果をテストしました。ペイキャップ38を培地に適用した結果、分子層の顆粒細胞の速度が79%低下し、1時間あたり2.5ミクロンに低下しました。
内因性TPA阻害剤であるPI oneを投与すると、顆粒細胞の移動速度は制御速度から1時間あたり4.2ミクロンに78%低下しました。このビデオを見れば、開発中の理論バルーンで細胞を追跡する方法について十分に理解できるはずです。この手順を試みている間、細胞の移動に不可欠な適切で一定の環境パラメータを提供することを覚えておくことが重要です その開発後。
この技術は、神経科学の分野の研究者が脳内の事実プロセスを探求する道を開きました。
概要
本研究では、共焦点マクロスコピックアプローチを用いて生体脳切片におけるニューロンの移動を可視化し、出生後小脳における未熟顆粒細胞の遊走に焦点を当てます。本プロトコルでは、小脳切片の調製方法およびニューロンの遊走に影響を与える要因について概説します。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 神経細胞遊走
- 共焦点顕微鏡法
背景
- 小脳の発達過程において、顆粒細胞は神経ネットワークを構築するために移動します。
- 神経細胞の移動を理解することは、脳の発達および疾患に関する洞察を得るために不可欠です。
- 共焦点顕微鏡を用いることで、神経細胞の挙動を詳細に可視化できます。
- ex vivo顕微鏡観察により、さまざまな因子が神経細胞の移動に及ぼす影響を明らかにできます。
研究目的
- 小脳における顆粒細胞の移動を可視化すること。
- 内因性因子および毒性物質がニューロンの移動に及ぼす影響を調査すること。
- 脳切片におけるニューロンダイナミクスの研究手法を改善すること。
使用した手法
- P10ラットからの小脳の摘出および急性スライスの作製。
- 可視化のための蛍光プローブによるニューロンの標識。
- マクロ共焦点顕微鏡を用いたタイムラプスイメージング。
- ニューロンの移動の追跡、および移動速度と距離の解析。
主な結果
- 顆粒細胞は、皮質層全体で移動様式および速度に顕著な変化を示した。
- 分子層における平均移動速度は 18 microns per hour であることが判明した。
- 特定の薬物の投与により、顆粒細胞の移動速度が有意に変化した。
- これらの結果は、神経細胞移動の制御メカニズムに関する知見を提供する。
結論
- 本研究では、小脳スライスにおける顆粒細胞の遊走を可視化することに成功した。
- 得られた知見は、ニューロンの移動に対する内因性因子の影響を強調している。
- この手法により、発達期におけるニューロンのダイナミクスの理解が深まる。
よくある質問
産業界における意義
この手法により、生体脳スライスにおける神経細胞遊走のリアルタイム可視化が可能となり、神経発達標的の妥当性確認におけるメカニズム的なリスク低減がサポートされます。遊走速度と経路ダイナミクスを定量化することで、神経回路に対する化合物の影響を評価するための予測的信頼性が提供されます。本アプローチは、探索生物学と神経活性物質の前臨床評価を橋渡しするものです。
バイオ医薬品R&Dにおける戦略的応用
初期創薬およびターゲットバリデーション
- 科学的価値： 顆粒細胞の移動を神経路の完全性の機能的リードアウトとして可視化することにより、治療仮説を検証します。
- 運用的価値： 内因性因子や毒性物質が細胞移動に及ぼす影響を直接観察することで、生物学的なリスク低減を可能にします。
- 予測的価値： 移動の変化を小脳回路における潜在的な機能不全に結びつけることで、ポートフォリオの優先順位付けを支援します。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値： 皮質層におけるベースラインの移行キネティクスを確立することにより、下流のワークフローに適した検証済み生物学的システムを準備します。
- 実用的価値： 総移動距離と平均速度を定量的に追跡することで、アッセイの標準化と再現性の課題に対処します。
- スクリーニングへの適用性： タイムラプス形式での信頼性の高い化合物評価に向けた、スケーラビリティとプラットフォームの再利用性を強調しています。
トランスレーショナル＆前臨床研究
- トランスレーショナルな連続性：遊走の調節不全を多様な小脳機能の欠損と結びつけることで、疾患との関連性について論じています。
- リスク調整済み進展：発見から神経活性化合物の前臨床検証に至るまでの連続性について記述しています。
- 予測的リスク低減：アルコールやメチル水銀などの物質が神経細胞の遊走に及ぼす影響を評価する際、メカニズム的な洞察に焦点を当てています。
パイプラインおよびワークフローの統合
遊走を機能的なエンドポイントとして測定できる能力に基づき、本手法を仮説検証からリード化合物同定に至る創薬の連続的なプロセスにおける位置づけとして提示します。
- 探索生物学：本手法が、神経細胞移動メカニズムの仮説検証、パスウェイの解明、および生物学的リスクの低減をどのようにサポートするかを解説します。
- スクリーニング：化合物に対する顆粒細胞の移動を追跡する際の、アッセイの準備状況、再現性、および定量的なアウトプットについて記述します。
- 分析：異なる条件下での移動速度と距離を比較する際に役立つ、測定値、リードアウト、または統計的なアウトプットに焦点を当てます。
- トランスレーショナルリサーチ：ソースに基づいた場合にのみ、本手法を前臨床段階の連続性やバイオマーカーの一致へと結びつけます。
- 企業の再利用：本手法を単発のテクニックではなく、再利用可能な能力として位置づけます。
運用および企業への影響
- 科学的価値： 予測精度の向上、ターゲットの妥当性確認、神経細胞遊走経路におけるメカニズム的な不透明性の低減。
- 運用的価値： タイムラプスイメージングおよびトラッキングプロトコルの標準化、再現性、および拡張性の確保。
- 戦略的価値： 神経活性化合物のスクリーニングにおける、より適切なgo/no-go判断、資本効率の向上、および後期段階における生物学的リスクの低減。
- ポートフォリオへの影響： 遊走表現型データに基づいた、リスク調整後の優先順位付けおよび推進決定。
実施上の考慮事項
- 神経解剖学、蛍光標識、および共焦点顕微鏡法に関する専門的な科学知識が必要です。
- 環境チャンバー、共焦点マクロスコープ、およびトラッキングプラグインを導入したImage Jを含む、装置および分析インフラストラクチャが必要です。
- 切片調製、標識の整合性、および遊走の定量化に関するチーム間の標準化が求められます。
- 生後日数の違いや種などのモデルシステム間の適応に関する検討事項があります。
- 切片の生存可能時間や長時間イメージング中の光毒性リスクなど、ソース資料に基づいた実用上の制限があります。
