共焦点肉眼検査を使用した生後小脳顆粒細胞の移動のex vivoイメージング

この手順の全体的な目標は、生きている脳スライス内の移動するニューロンを視覚化することです。これは、最初にP 10ラットから小脳を解剖することによって達成されます。次のステップは、急性小脳切片を調製し、蛍光プローブでニューロンを標識することです。

次に、タイムラプス実験をマクロ共焦点イメージングまたは共焦点顕微鏡法で行います。最後のステップは、結果の映画のニューロンを追跡することです。最終的に、ex vivo顕微鏡法は、ニューロンの移動を調節する内因性因子または有毒物質の役割を示すために使用されます。

共焦点顕微鏡法のような既存の方法のこの技術の主な利点は、マクロ共焦点イメージングが、鼠径部インサートに直接配置された脳の芸術スライスを残すときの視界の感触を向上させることです。私は最初に、私は共焦点顕微鏡実験のための脳の芸術スライスを転送し、安定させるのが困難だったときに、この方法のアイデアを持っていた細かい虹彩はさみを使用して、頭蓋骨の基部から吻側領域に2つの横方向の切開を繊細に行う、斬首されたP 10ラットの子犬の頭蓋骨にアクセスすることから始めます。次に、解剖された頭蓋骨を2つの3番鉗子で取り除き、脳と頭蓋骨の間の接着を切断します。

次に、ヘラのスプーンの端で脳をすくい取り、氷の上に2ミリリットルの冷たいHBSSを入れた35ミリメートルのシャーレに入れます。次に、実体顕微鏡下で、2つの3番鉗子を使用してD裂傷によって脳から小脳を分離します。小脳を氷冷バッファー付きの新しい皿にスプーンで入れます。

次に、同じツールを使用して、残っている脊髄と剥離膜を取り外して廃棄します。15番の外科用刃が付いた3番の頑丈なメスの柄を用意します。実体顕微鏡下でブレードを使用して、真と右半球の間の小脳を切断します。

次にビブラートで、シアノクリレート接着剤を試料ディスクに一滴垂らし、溶媒蒸気が消えるのを15〜25秒待ってから、小脳をディスクに移します。次に、小脳の縁を検体椎間板に固定し、10秒待ちます。次に、マニピュレーターを使用して、小脳の横軸がナイフホルダーに対して垂直になるように、標本ディスクをバッファートレイに挿入します。

必ずアルミレンチを使用してディスクを固定してください。次に、小脳をHBSSで慎重に覆い、砕いた氷を冷却浴に入れます。試料をスライスするには、洗浄したブレードを配置し、その端が試料の後端のすぐ後ろになるようにします。

これをアイシングの開始点として定義します。次に、forwardコマンドを使用して、端点を試験片の前端を過ぎたところに定義します。次に、スライスの厚さを180ミクロンに設定します。

次に、切片化速度を2.5に、周波数を8に設定し、試験片の切片化を開始します。小脳ごとに最大5つのスライスを収集します。切り捨てられた幅広のイノシシガラスピペットを使用して各セクションをピックアップします。

切片を氷の上に冷たいHBSSが入った皿に移します。実体顕微鏡でスライスを採取した後、2つのNo.5鉗子を使用して髄膜を慎重に取り除きます。また、プローブのローディングを改善するために、LOEを静かに分離します。

試料をスライスした後、切り捨てられた幅広のイノシシピペットを使用して、HBSSを各ウェルに最大3スライスの6ウェルプレートロードに移します。次に、各ロード中の培地を空にした後、サンプルを光から保護するために蛍光色素の10マイクロモルを含むローディング溶液を5ミリリットルよく加え、プレートをホイルで覆います。次に、プレートを35RPMに設定されたミューテーターに置きます。

プレートを室温で10分間インキュベートし、色素が細胞ウェルを標識します。次に、前と同様にスライスを3ミクロンの細孔を持つトランズウェルインサートのメンブレンに移します。次に、ローディングメディアを吸引し、スライスだけを残します。

次に、インサートとスライスを取り外して、ウェルに1.9ミリリットルのDMEMを充填します。次に、インサートを元に戻し、さらに100マイクロリットルのDMEMを追加して組織を覆います。この調製物を2時間インキュベートすると、顆粒細胞が見えるようになります。

蓋をせずにプレートを、共焦点顕微鏡上のガスが一定の流れを持つ環境チャンバーに移します。次に、タイムラプス実験用の共焦点顕微鏡のプレートインサートにガラスカバーを置きます。細胞をチャンバー内でさらに2時間インキュベートしてから進めます。

組織スライス内を移動する顆粒細胞を可視化するには、488ナノメートルの光で調製物を照らし、2 x ドライ対物レンズを使用します。タイムラプス動画の各画像について、標準偏差モードを使用してザック投影を実行し、各画像のコントラストと明るさのレベルを調整して、標識された顆粒細胞が見やすくなるようにします。次に、粒子分析メニューから手動追跡プラグインを選択します。

プラグインを使用して、タイムラプス画像シーケンス全体でラベル付けされた各セル本体の中心点をクリックします。次に、未加工のトラッキングデータをスプレッドシートにエクスポートして、さらに分析します。Image Jからエクスポートされた生のトラッキングデータを、プログラムを使用して各セルと関連する位置を識別するスマートな自家製ツールで再編成します。

各セルの合計移動距離と平均移動速度を計算します。出生後初期の小脳では、顆粒細胞は異なる皮質層を通過するときに、移動のモードと速度に大きな変化を示します。PMラット小脳組織切片中のCTG標識顆粒細胞を調べた。

説明したように、顆粒細胞は分子層内を平均18ミクロン/時間で放射状に移動しました。次に、別の製剤を使用して、移動速度を変えると予想される薬物の効果をテストしました。ペイキャップ38を培地に適用した結果、分子層の顆粒細胞の速度が79%低下し、1時間あたり2.5ミクロンに低下しました。

内因性TPA阻害剤であるPI oneを投与すると、顆粒細胞の移動速度は制御速度から1時間あたり4.2ミクロンに78%低下しました。このビデオを見れば、開発中の理論バルーンで細胞を追跡する方法について十分に理解できるはずです。この手順を試みている間、細胞の移動に不可欠な適切で一定の環境パラメータを提供することを覚えておくことが重要です その開発後。

この技術は、神経科学の分野の研究者が脳内の事実プロセスを探求する道を開きました。