Name: 共焦点肉眼検査を使用した生後小脳顆粒細胞の移動のex vivoイメージング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: 学ぶ 生後小脳の顆粒細胞移動を共焦点マクロイメージングで可視化する方法。P10ラットの急性脳切片を用いて、神経細胞の動態と内因性因子の影響を詳細に観察できます。

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- この作品は、生物医学における研究とイノベーション研究所（IRIB）、ノルマンディー（PRIMACEN）、INSERM、IBiSA、ルーアン大学、欧州地域開発基金（PeReNE、INTERREG 4A ERDF）の細胞イメージングプラットフォームでサポートされていましたLARC-神経科学ネットワークと地域オートノルマンディー。

動物（雄または雌Wistarラット）は、実験動物の管理と使用のためのフランスのガイドによると、認定動物施設（承認B.76-451-04）で生まれ、飼育しました。実験は、欧州共同体理事会指令（2010年9月22日の63分の2010 / UE）と農業のフランスの省に応じて、許可された研究者（MB、DVとLG）の監督の下で行われました。 メディアとツールの作製<ol><li>生物学的安全キャビネットでは、MgCl 2をせずに塩化カルシウム（1.85グラム/リットル）/ 硫酸マグネシウム（0.9767グラム/リットル）を含む10×ストック溶液から滅菌水で1×ハンクスBSS（HBSS）を準備します。 HBSSの1×溶液に、 炭酸水素ナトリウム（350 / mlの）を追加します。 </li><li>生物学的安全キャビネットでは、（100×ストック溶液から）N2サプリメントを追加し、ペニシリン（100単位/ ml）（0.1 mg / mlの）ダルベッコ改変イーグル培地を解決（DMEM）栄養ミックス-streptomycinチャーF-12（1：1）。 </li><li>無菌状態では、DMSO中の細胞トラッカーグリーン（1 mgのための1.075ミリリットル）と呼ばれる細胞質の蛍光色素のアリコート（25μL、2 mm）を用意します。 15ミリリットルコニカルチューブに5mlのDMEM中の1つのアリコートを希釈します。 </li><li> 4℃でのメディアを維持するために充填された氷のバケツを準備します。 </li><li> 70％エタノールで実験室のベンチトップとツールを除染。 </li></ol> P10ラットから小脳の2解剖<ol><li>急速に脊髄の開始を取得するために、耳の後ろに湾曲操作ハサミで仔ラット（P10）を首を切ります。 </li><li>断頭頭の後ろ側では、微細なアイリスハサミで鼻に首から皮膚の正中切開を行い、微細なアイリスはさみとデュモン＃3鉗子を用いて頭蓋から皮膚を分離します。 </li><li>微妙頭蓋骨の吻側領域にベースから2横切開を作るために細かいアイリスはさみを使用してください。 2＃3鉗子で切開し、頭蓋骨を削除します。ブラジャーを外し同じ鉗子を使用して頭蓋骨を持つ任意の密着性からです。 </li><li>氷冷HBSS培地2mlを含むペトリ皿（Ø35ミリメートル）にへらのスプーン端に脳を転送します。 </li><li>実体顕微鏡のステージへの氷と転送のフル大きなペトリ皿（Ø100ミリメートル）で、脳を​​含むペトリ皿を置きます。 </li><li>実体顕微鏡下では、2＃3鉗子を使用して引き裂くことによって、脳から小脳を分離します。同様に、残留脊髄および軟膜 - 膜を除去します。 </li><li>へらのスプーン端に新しいHBSSで満たされたペトリ皿（Ø35ミリメートル、2ml）に小脳を移し、氷上に保持します。 </li></ol>急性小脳切片の調製<ol><li>二つのヘッドによって示されるように実体顕微鏡下では、虫部と右半球間の小脳をカット標準のメスハンドル＃3固体と＃15の外科用ブレードを用いて、図2Aに矢印。 </li><li>シアンの一滴を入れビブラトーム試料ディスク上oacrylate接着剤や毒性溶媒蒸気を除去するために15〜25秒待ってください。 </li><li>へらのスプーンの端がカット小脳を収集し、清潔なペーパータオルで余分なHBSSを除去します。 </li><li>試料ディスクに近い小脳を持参してください。検体ディスクにカットエッジを修正し、10秒待ってください。 </li><li>マニピュレータでバッファトレイに試料ディスクを挿入し、小脳の横軸は、ナイフホルダーに垂直であるので、それを回転させます。アレンキーで試料ディスクを修正し、小脳がカバーされるまでHBSS培地で穏やかにバッファートレイを埋めます。 </li><li>負荷は、冷却槽に氷を砕い。 </li><li>任意の油を除去するために70％エタノールでブレード3回清掃してください。 </li><li>ナイフホルダーにブレードを挿入し、ネジを締め付けで固定します。 </li><li>標本の（ユーザーのビューから）後縁の後ろに刃先を右に置き、出発点として定義します。前方を使用し、Tを定義するコマンド彼は、試料の前縁の後にポイントを終了します。 </li><li> 2.5でセクショニング速度を選択し、180ミクロンの厚さでトリミング8. [頻度を切片。組織切片を開始します。 </li><li> HBSS含有ペトリ皿（Ø35ミリメートル）に広口径ガラス切断されたパスツールピペット、転送を使用して、各セクションをピックアップし、氷上に維持。 </li><li>ブレードと干渉するときに、2つの＃5鉗子を使用して、小脳から慎重髄膜を除去します。小脳あたり5スライス（ 図2B、C）の最大値を収集します。 </li><li>実体顕微鏡下で2＃5ピンセットで慎重に小脳スライスから髄膜を除去し、より優れたプローブ負荷穏やかに小葉を分離します。 </li></ol>リビング介在4.蛍光染色<ol><li> 6ウェルプレート（ウェルあたり最大3スライス/）に広口径ガラス切り捨てパスツールピペットで小脳スライスを転送します。 HBSS培地を吸引除去します。 </li><li> L 5ml中のスライス（3 MAX）をインキュベート蛍光染料のoading溶液（10μM）。 </li><li>光から保護するために、アルミホイルでマイクロプレートをカバーしています。細胞標識を容易にするために、室温で10分間、35 rpmでジャイロ移動テーブルの上に置きます。 </li><li>広口径ガラス切り捨てパスツールピペットで、トランスウェルの膜に転写スライスが（ 図2D3.0μmの細孔サイズ）を挿入します。ピペットでロード媒体を吸引。 </li><li>インサートを取り外し、DMEMの1.9ミリリットルとよくを埋めます。インサートを交換し、組織をカバーするために、スライスの上のDMEM 100μlを添加します。 </li><li> MLでのGCを観察するのに十分である2時間インキュベーター室（37℃、5％CO 2）で培養インサートを含むプレートを置きます。インサート膜（ 図2E）で添付ファイルを許可するようにフラットな組織をうそ。スライスが乾燥していないことを確認してください。 </li></ol>共焦点肉眼検査を通じて5. エクスビボイメージング<ol><li>なしプレートを転送しますインキュベーターにプラスチック製のふたは、共焦点マクロスコープのスタンドに取り付けられています。マクロスコープのプレートインサート上にガラスカバーを置きます。 37.0℃のチャンバーの温度を維持するには、0.5℃、±、および一定のガス流（95％O 2、5％CO 2）プレートインサートを介してpHを一定に維持するためにスライスを提供します。タイムラプス実験の前に、さらに2時間待ちます。 </li><li>組織切片でGC移動を可視化X2乾燥対物レンズ（作動距離を備えた共焦点レーザー走査マクロスコープを介してレーザダイオードを用いて488nmの波長光で準備を照明するために39ミリメートル、直径58ミリメートル、NA = 0.234）、500から530 nmの蛍光発光を検出します。 <ol><li>微のGCの動きを解決するには、1.5から2.0の追加の光学ズーム倍率で画像を取得します。最大12時間30分ごとに単一の焦点面内のGNの画像を収集またはz軸に沿って最大10個の異なる焦点面。 </li></ol></lI&gt; <li>必要な場合には、ガラスのカバーを取り外して、GCの移行に及ぼす影響を研究するために10μlのピペットを含むDMEM中の生物学的活性剤または阻害剤の小容量（1〜10μl）を追加します。 </li></ol> 6.細胞追跡<ol><li>映画のたびに、ImageJの中ecart型スルーモードzスタック投影を行います。コントラストを調節し、連続した画像の輝度レベルは、識別および標識のGCの追跡を容易にすること。手動（t = 0で）を基準スナップショット上の各位置の地図。 <ol><li> Analyseを粒子メニューの「手動トラッキング」プラグインを使用し、時間の経過中に各細胞体の重心点をクリックして決定します。スプレッドシート内の生の追跡データをエクスポートします。 </li></ol></li><li>各セルと関連した位置を特定する（PHPコードで書かれhttp://primacen.fr、）スマートホームメイドのプログラムをImageJのからエクスポートされた生の追跡データを再編成してください。プログラムを使用して、calculat総走行距離と各セルの移動の平均速度を電子。分類し、同じプログラムを使用して、適切なフィルタの下で制御し、治療条件で細胞移動の特性を比較します。 </li></ol>

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</ol>

著者らは、開示することは何もありません。

このプロトコルは、トランスウェルシステムと共焦点肉眼を通して生後発達中に細胞遊走を研究するための緑色蛍光色素を持つGCの蛍光標識の急性P10ラット小脳スライスの文化を説明します。このプロトコルは、12時間と実験中アゴニストまたは神経ペプチドのアンタゴニスト、酵素阻害剤、細胞シグナル伝達調節物質または有毒物質を含む移動の要因を調節可能な役割の試験までの期間の細胞遊走の観察を可能にします。ピペットの先端を有する膜インサートの小さな穴は、インキュベーション培地中の化合物の投与を容易にすることが必要です。自家製の湾曲した先端は、ピペット溶液の送達を促進するために使用することができます。 生体組織切片における細胞移動の研究の1つの問題は、組織自体の動きが細胞追跡を困難にすることができることです。以前のアプローチは、穏やかにSLIを安定化させるために提案したのに対しナイロンメッシュまたはラット尾コラーゲン7,17の薄層でCES、この技術の主な利点は、対物レンズの下にCO 2インキュベーターから膜インサート上小脳スライスを含む6ウェル培養プレートの簡単かつ直接的な移動であります共焦点マクロスコープの。統合された温度とCO 2のコントローラはまた、細胞遊走9に必須の適切かつ一定の環境パラメータを提供します。従って、培養条件は、スライスがよく、膜インサートに取り付けられているので、最小限に抑えられる観察及び組織の動きの間に保持されます。組織の安定化は、取得時に参照を修正する必要があり、スライスエッジやプルキンエ細胞の位置を追跡することによって検証されます。また、プレートの6ウェルに分散小脳スライス（12〜18）は、迅速に電動ステージと、光学ズームして詳細に観察することができます。による乾燥対物レンズ、エピの大きな作動距離（X2、39ミリメートル）に-observationは、培養培地中の化合物の浸漬および投与の自由であるはるかに簡単です。したがって、CO 2インキュベーター、共焦点の環境パラメータと培養支持体の類似性は、生物学的サンプルの最大保全につながる肉眼。 プロトコルの別の利点は、広い視野とを同時に観察することができる細胞の結果として多数あります。例えば、我々は以前にMLで放射状の移行と蛍光のGCの密度は1124±138細胞/ mm 2で18であったと判断しました。共焦点肉眼（X2、NA = 0.234）は、共焦点顕微鏡（40X、NA = 1.25）に比べて低い横方向の解像度を持っていますが、GCのの細胞体は、容易に追跡することができ、移動の平均速度は、二つの技術的アプローチ7,18間で同等であり、 。 画像収集、組織切片と番目の品質のための技術的な改善に加えて標識のE品質が成功した実験のための重要なポイントです。常に解剖プロセスの間、氷上でメディアや組織を維持し、ビブラトーム刃に油を除去し、接着剤と接触して組織の切片を利用しません。矢状及び横断面は、それぞれ半径方向および接線方向の移行に適合されます。小脳の異なる皮質層に適切な検出のためのインキュベーションの異なる長さを使用してください。 （8時間まで）長いインキュベーション時間は、PCLおよびIGLに多数のGCの移行を検出するために必要です。 GCの移行は、特定の時空間的な窓の間の生理学的プロセスであるため、正の対照は、細胞が正常に移行しなければならないことです。特に、MLには多くのスピンドルGCは矢状小脳切片のための主要な健康指標の一つです。実験を開始するため、MLでのGCの動きの観察が示唆されています。実際には、縦長のセル本体とGCの形状は、交流を開始するための基準点として考慮されるべきです連続的な制御（2時間）と治療（2時間）を容易MLで実行することができる期間でquisition。 遺伝子構築物を介して発現する細胞トラッカーファミリーまたは蛍光タンパク質などの蛍光色素は、細胞遊走の研究のためのトレーサーとして使用することができます。 4レーザーは（405、488、532および633 nm）をビームのでによるGCの移行の遅い速度（1スタックごとに30分）に、多色実験も順次モードで実行することができるシステムで利用できます。求心性と遠心半径方向の移動を考慮すると、他の介在の追跡も18を実現することができます。具体的には、以下の多数の細胞型は、より容易に大きな視野に局在化することができます。最後に、このプロトコルは、小脳発達の他の段階だけでなく、他の脳領域に細胞遊走を研究するために使用することができます。

開発小脳では、ニューロンの8つの異なるタイプがげっ歯類1における第二胚週と第二出生後の週の間に順次生成されます。最初に一次胚ゾーンから発信、未成熟顆粒細胞（GC）は、外顆粒層（EGL）、二次胚ゾーン2から生成される最後のニューロンです。第3生後数週間の間に、小脳皮質は、EGL、分子層（ML）を含む4つのレイヤーで構成葉状構造であり、プルキンエ細胞層（PCL）と内部顆粒層（IGL）（ 図1）。求心移行、未熟のGC、グルタミン酸介在を通じ、約2日以内にIGLに達します。第生後一週間では、EGLが消え、IGLは、大人の小脳における顆粒層（GL）と呼ばれるものを構成しています。 GLは、GCは苔状繊維及び単極性ブラシ細胞からの興奮性シナプス入力を受け取る、およびゴルジ細胞軸索からの抑制性シナプス入力。 MLでは、GCの軸索は、プルキンエ細胞、バスケット細胞、星状細胞、およびゴルジ細胞2を含むGABA作動性ニューロンと興奮性シナプスを作ります。 生後初期のげっ歯類から得られる急性小脳切片における細胞運動のリアルタイム観察がGCのは、小脳皮質3での経路の間の移動の様相と速度の変化に付随してその形状を変更することを示しています。最初の2週間の間に出生後、GCの前駆体は、積極的にEGLの上部に増殖します。 EGLの中央部では、有糸分裂後のGCは、それらのより大きなプロセスの方向に接線方向に移動します。 EGL-MLの境界に、GCのは、彼らの動きを遅く、細胞はMLに短い垂直下降プロセスを入力し始めます。 MLでは、GCは縦長の細胞体、薄い後のプロセス、より多量の主要なプロセスがあり、バーグマングリア繊維に沿って半径方向に移動します。でPCLは、GCはその動きを止めるが、長期の固定相（2時間）の後、彼らはPCL-IGLの国境を越えます。 IGLでは、GCはグリア繊維支持の非存在下での層の底部に向かって移動します。主要なプロセスの先端たらIGL-白質（WM）ボーダー、GCの遅い近づくとその移動を停止。矢状スライスはML、PCLおよびIGLでマイグレーションを放射状に専用されている間、小脳の横断面は、EGLで接線移行研究のために好ましいです。神経ペプチド（ 例えば 、ソマトスタチン、PACAP）を含むGCの動きのいくつかの調節因子は、これまでに同定されているが、各皮層におけるGCの移行の時空間制御に関与する完全なメカニズムはまだほとんど不明1,4,5,6-です。 GCの移行は、ACUのため、単離された培養細胞または蛍光検出のための透過光照明のいずれかを使用して、ビデオ、共焦点顕微鏡を介して過去20年の間に研究されてきましたTE小脳スライス。最初に、親油性のDiI、最近で「セルトラッカー」染料および細胞発現蛍光タンパク質を共焦点または二光子顕微鏡7,8に使用しました。成功した実験では、プロトコルはシンプルだが容易ではない作る具体的な手順の数によって異なります。具体的には、急性スライスは自家製ナイロンメッシュネットワーク9と、一般の観察中に安定化されなければなりません。光照射の強度は、多点走査型共焦点顕微鏡法によって提案されているように光毒性および光退色を避けるためにできるだけ低くなければなりません。さらに、温度およびCO 2は、ニューロンの遊走に影響を与える可能性が不安定ので重要な環境パラメータです。実験手順を容易に絞り込むために、我々は、スライスの動きを制限し、共焦点肉眼プロトコルを開発した、一定の環境パラメータを保証する、（milimeters程度）の視野を増加させる、光退色を軽減し、consequ画像解析によって追跡することができる細胞（数十）の数をまったく別。従って、180ミクロンの厚さのスライスを膜インサート上で培養し、6ウェルプレートに直接2X電動大インキュベーションチャンバーを備えた商用共焦点マクロスコープの目的、温度およびCO 2のコントローラと振動制御システムの下で転送されます。時間経過およびZスタックその後数時間的および薬理学的ツールまたは生物活性分子を介して行われるが、インキュベーション培地に添加し、または送達することができます。この方法は、異なる発達段階における小脳または大脳ニューロンの他のタイプの遊走を研​​究するために適合させることができます。

<table><tbody><tr><td>ダルベッコS modified eagle medium (DMEM) nutrient mixture F-12</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8437</td><td></td></tr><tr><td>Hank's balanced salt solution 10x</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1641</td><td></td></tr><tr><td>PACAP38</td><td>INRS, Canada</td><td></td><td>Bourgault et al., 200919</td></tr><tr><td>PAI-1</td><td>Calbiochem</td><td>528208</td><td></td></tr><tr><td>N-2 supplement</td><td>フィッシャーサイエンティフィック/ギブコ/invitrogen</td><td>O973</td><td></td></tr><tr><td>シアノアクリレート接着剤</td><td>Loctite</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell Tracker Green CMFDA</td><td>Invitrogen</td><td>C2925</td><td></td></tr><tr><td>Polyester Transwell-Clear インサート</td><td>Corning</td><td>3452</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0781</td><td></td></tr><tr><td>6-well cell culture cluster</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP231-100</td><td></td></tr><tr><td>組織培養ディッシュ 直径 35 mm</td><td>BD ファルコン</td><td>353004</td><td></td></tr><tr><td>ティッシュカルチャーディッシュ 直径 100 mm</td><td>サーモ サイエンティフィック</td><td>130182</td><td></td></tr><tr><td>ポリプロピレン チューブ (15 ml)</td><td>BD ファルコン</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>エタノール 70%</td><td>フィッシャー ケミカル</td><td>E/0800DF/21</td><td></td></tr><tr><td>生物学的安全キャビネットドラフトチャンバー</td><td>Thermo Scientific</td><td>MSC9 Class II A2</td><td></td></tr><tr><td>Adjustable volume pipette (0.5-10 &micro;L)</td><td>Eppendorf</td><td>4910 000.018</td><td></td></tr><tr><td>ジャイロロッカー、SSL3</td><td>Stuart</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO2インキュベーター、Hera Cell 150</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>振動ブレードミクロトーム、VT1000S</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>共焦点マクロスコープ、TCS LSI</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>温度コントローラー</td><td>PeCon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO2</td><td>コントローラーPeCon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>実体顕微鏡、M205 C</td><td>ライカマイクロシステム</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ズ 操作用ハサミ、湾曲、鈍い/鈍い</td><td>Medicon</td><td>03.03.17</td><td></td></tr><tr><td>硬化細かい虹彩はさみ、まっすぐでシャープ/シャープ</td><td>FST</td><td>149090-11</td><td></td></tr><tr><td>デュモン #3 および #5 鉗子</td><td>FST</td><td>11293-00および11252-20</td><td></td></tr>ビ<tr><td>ブラートムインジェクターブレード/シングルエッジ</td><td>ライカマイクロシステム</td><td>ズ39053250</td><td></td></tr><tr><td>標準メスハンドル#3ソリッド</td><td>FST10003-12</td><td></td><td></td></tr><tr><td>外科用ブレード#15</td><td>スワンモートン</td><td>205</td><td></td></tr></tbody></table>

共焦点肉眼検査を使用した生後小脳顆粒細胞の移動のex vivoイメージング

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

生後発達の間に、未成熟顆粒細胞（興奮介在）外顆粒層中の接線方向の移行を示し、その後、分子層とプルキンエ細胞層内の半径方向の移動は、小脳皮質の内部顆粒層に到達します。渡り鳥のプロセスでのデフォルトは、多様な小脳の機能の欠損につながる、ニューロンの細胞死や紛失のいずれかを誘導します。求心顆粒細胞の遊走は、その最終位置に向かって細胞を誘導するために、走化性および細胞外マトリックスの分解のようないくつかのメカニズムを含むが、それぞれの皮層における細胞遊走を調節する因子は、部分的にしか知られています。我々の方法では、急性小脳スライスはP10ラットから調製される、顆粒細胞は、蛍光細胞質マーカーで標識され、組織を37℃で共焦点肉眼によって細胞移動のリアルタイム監視を開始する前に、4から10時間に膜インサート上で培養されますでCO 2の存在。小脳の異なる皮質層での移行時には、顆粒細胞は、神経細胞の遊走の調節におけるそれらの可能な役割を調査するために、神経ペプチドのアゴニストまたはアンタゴニスト、プロテアーゼ阻害剤、細胞内エフェクターやアルコールやメチル水銀のようであっても有害物質のブロッカーに露出させることができます。

彼らは異なる皮質層1（ 図1）を横切るように出生後早期の小脳では、GCはそのモードと移動の速度の大幅な変化を示します。このセクションでは、それらの天然の細胞環境にGC遊走を研究することによって得られる結果の例を示します。緑色蛍光色素で標識されたP10のラット小脳組織切片は、共焦点マクロスコープ（ 図3A）で検査していると我々は、GCのは、18ミクロン/ hrの平均速度（ 図3B、C）とMLに放射状に移動することを示しています。現在までに、調節因子と各皮質層に細胞遊走の制御に関与する分子機構を含む神経細胞とグリア細胞間の相互作用/通信の役割は不明な点が多いです。したがって、主な問題は、これらの皮質の層特異において役割を果たし得る神経ペプチド、神経伝達物質、神経栄養因子および細胞外マトリックス成分を同定することですその移行プロセス時の速度のFIC変化。下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド（PACAP）は、げっ歯類7,10,11の最初の2週間の間、主に生後PCLではなく、MLおよびIGLに検出されます。培地へPACAP38（10 -6 M）の適用は、MLにおけるGCの79％の速度減少をもたらしました。たとえば、MLでのGCの移動速度は、PACAP38（ 図4A）の投与後2.5ミクロン/時の制御条件で11.9ミクロン/時から低下しました。組織型プラスミノーゲン活性化因子（tPA）、細胞外マトリックス（EM）は、細胞接着分子またはラミニン12,13などの構成部品の劣化につながるタンパク質分解カスケードのメンバーです。 tPAおよびプラスミノーゲン、tPAの基板は、出生後の小脳14,15,16の開発中に皮質層で検出されます。 PAI-1（10 -7 M）、内因性tPAの阻害剤の投与は、78％GCによって減少しますMLでの移行。例えば、GCはPAI-1（ 図4B）の添加後に4.2ミクロン/時間に制御条件で19.2ミクロン/時からMLに移動速度を減少させました。これらの結果は、PACAPは、GCの動きに直接的な阻害効果を発揮し、セリンプロテアーゼのtPAは、現像ラット小脳のMLでのGCの移動を容易にすることことを示しています。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52810/52810fig1.jpg" /> 図1：生後小脳皮質でのGCの移行の3D表現。 IGL 1-4、EGLでGCプロセスおよび接線方向の移行の拡張。5、バーグマングリア繊維に沿ってMLで放射状の移行。6、PCLで一時固定相。7、グリアに依存しないラジアル移行。8、完成。赤でIGL GCでGCの移行、顆粒細胞、の、EGL、外顆粒層、濃い紫色でB、バーグマングリア、; G、ゴルジ細胞、黄色で、CF、登山繊維、青、G、postmigratory顆粒細胞、ライトグリーンで、IGL、内部顆粒層、MFT、苔状線維端末、暗緑色で、PCL、プルキンエ細胞層、薄紫でP、プルキンエ細胞、; ML、分子層。この図は、5から変更されています。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/52810/52810fig2.jpg" /> 図2：P10小脳スライスのex vivo培養物（A）P10ラットから切開小脳。スケールバー= 6ミリメートル。 （B）実体顕微鏡を介して180ミクロン厚の小脳スライスの生活の顕微鏡写真。スケールバー= 3ミリメートル。 （ネコ小脳の高倍率、4皮質層（EGL、ML、PCL、IGL）が既に識別可能です。スケールバー= 1ミリメートル。 （D）蛍光標識した後、組織切片を、6ウェルプレートに培養インサート（直径24mm）上に配置されています。 （E）組織培養処理ポリエステル膜で培養インサートの概略図。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52810/52810fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/52810/52810fig3.jpg" /> 図3：ラットP10小脳の皮質層でのGCの動的移行 GCのグリーン細胞質蛍光色素で標識されたP10ラット小脳スライスの（A）Macroconfocalビュー（XYZ、2D投影）。 =75μmのスケールバー。 GCを示す（B）タイムラプスイメージング対照条件で4時間共焦点肉眼によるMLの動き。アスタリスク（*）記号は、GCのソーマをマーク。 （分単位）経過時間は、各顕微鏡写真の下部に表示されます。 =10μmのスケールバー。 （C）GCのソーマが移動した距離で順次変化。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/52810/52810fig4.jpg" /> 図4：GCの移行の神経ペプチドおよびプロテアーゼ阻害剤の効果（A）GCは、下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド（PACAP）の存在下で2時間後、制御条件で2時間共焦点肉眼によってMLで追跡してました。 （B）GCは対照条件で2時間共焦点肉眼によってMLで追跡した後、プラスミノーゲン活性化因子インヒビター1（PAI-1）の存在下で2時間。

出生後の小脳の発達中に、胚帯に由来する未熟な顆粒細胞は、最終目的地に到達し、ニューロンネットワークを確立するための明確な移動の様相を示します。このプロトコルでは、小脳スライスの準備と、ニューロンの移動を調節する要因を調査するために使用される共焦点巨視的アプローチについて説明します。

During postnatal development, immature granule cells (excitatory interneurons) exhibit tangential migration in the external granular layer, and then ...

この手順の全体的な目的は、生きた脳スライスにおいて移動するニューロンを可視化することです。まず、P 10ラットから小脳を摘出し、次に急性小脳スライスを作成して、蛍光プローブでニューロンを標識することでこれを達成します。その後、マクロ共焦点イメージングまたは共焦点顕微鏡を用いてタイムラプス実験を行います。最終ステップとして、得られた動画内のニューロンをトラッキングします。最終的に、ex vivo顕微鏡観察を用いて、ニューロンの遊走を制御する内因性因子や毒性物質の役割を明らかにします。共焦点顕微鏡法などの既存の手法に対するこの技術の主な利点は、マクロ共焦点イメージングにより、グリシンインサートに直接配置した脳切片の視野を広げられることです。私がこの手法を考案したのは、共焦点顕微鏡を用いた実験において、脳切片の移送と固定に困難が生じたことがきっかけでした。まず、斬首したP 10ラット仔の頭部から頭蓋骨を露出させ、精密虹彩剪刀を用いて、頭蓋骨の基部から吻側領域にかけて2本の側方切開を慎重に行います。次に、3番ピンセットを用いて切り出した頭蓋骨を取り除き、脳と頭蓋骨の間の癒着を剥離します。次に、スパチュラのスプーン端を用いて脳をすくい出し、氷上の冷えたHBSS 2 mLを入れた35 mmペトリ皿に移します。続いて、実体顕微鏡下で、3番鉗子2本を用いて脳から小脳を剥離させます。小氷上の氷冷バッファーが入った新しい皿に、小脳をすくい出します。次に、同じ器具を用いて、残った脊髄と剥離膜を取り除いて廃棄します。3番のソリッドメスハンドルに15番の外科用メス刃を装着して準備します。実体顕微鏡下でメスを用い、小脳虫部と右半球の間を切断します。次に、ビブラトームにて、試料ディスクにシアノアクリレート接着剤を1滴滴下し、溶剤の蒸気が消散するまで15〜25秒間待ちます。その後、小脳をディスクに移します。次に、小脳の端を試料ディスクに固定し、10秒間待ちます。マニピュレーターを使用して、小脳の横軸がナイフホルダーに対して垂直になるように、試料ディスクをバッファー・トレイに挿入します。アレンレンチを使用してディスクを確実に固定してください。次に、小脳をHBSSで慎重に覆い、冷却バスに砕いた氷を入れます。検体をスライスするには、ブレードを洗浄し、その刃先が検体の後端の直後に来るように配置します。ここをアイシングの開始点として定義します。次に、フォワードコマンドを使用して、試料の前端のすぐ先を終了点として定義します。ここで、スライス厚を 180 microns に設定します。次に、セクショニング速度を2.5に、周波数を8に設定し、試料のセクショニングを開始します。小脳1つにつき最大5枚のスライスを回収します。切り出された各切片は、先端をカットした幅広のボアガラスピペットを用いて回収してください。切片を氷上の冷えたHBSSを入れたディッシュに移します。実体顕微鏡下でスライスを回収した後、5番ピンセット2本を用いて髄膜を慎重に除去します。また、プローブの導入効率を高めるため、内耳（LOE）をそっと分離させます。切片を作成した後、幅広の先端カットピペットを使用して、少量のHBSSとともに6ウェルプレートに転送します。各ウェルに最大3枚までの切片を入れます。次に、各ウェルの中身を空にした後、10 µMの蛍光染料を含むローディング溶液を5 mL加えます。サンプルを遮光するため、プレートをアルミホイルで覆います。その後、プレートを35 RPMに設定した振盪機に設置します。プレートを室温で10分間インキュベートし、染料で細胞を標識させます。次に、前述の手順に従い、3 µmのポアを持つトランスウェルインサートのメンブレンにスライスを移します。その後、ローディング培地を吸引し、スライスのみを残します。次に、インサートとスライスを取り出し、ウェルに1.9 millilitersのDMEMを満たします。その後、インサートを戻し、組織を覆うようにさらに100 microlitersのDMEMを加えます。この調製物を2時間インキュベートすると、顆粒球が観察されます。蓋を外したプレートを、共焦点顕微鏡上のガス流が一定に保たれた環境チャンバーに移動させます。次に、タイムラプス実験のために、共焦点顕微鏡のプレートインサートにガラスカバーを設置します。次へ進む前に、細胞をチャンバー内でさらに2時間インキュベートします。組織切片内を移動する顆粒細胞を可視化するために、試料に488 nanometerの光を照射し、2倍のドライ対物レンズを使用します。ImageJを用いて、500から530 nanometersの蛍光放出を検出します。タイムラプス動画の各画像に対して、標準偏差モードでZ投影を行い、ラベル付けされた顆粒細胞が見やすくなるように各画像のコントラストと明るさを調整します。次に、パーティクル解析メニューからマニュアルトラッキングプラグインを選択します。プラグインを使用して、タイムラプス画像シーケンス全体にわたって、ラベル付けされた各細胞体の中心点をクリックします。次に、生のトラッキングデータをスプレッドシートにエクスポートして、さらに解析を行います。Image Jからエクスポートされた生のトラッキングデータを、プログラムを用いて各細胞と関連する位置を特定する自作のスマートツールで再編成します。各細胞の総移動距離と平均移動速度を算出します。生後早期の小脳において、顆粒細胞は異なる皮質層を通過する際に、移動様式および速度に顕著な変化を示します。PMラット小脳組織切片において、CTGで標識した顆粒細胞を解析しました。上述の通り、顆粒細胞は分子層内で平均時速18 micronsの速度で放射状に移動しました。次に、移動速度を変化させると予想される薬物の影響を試験するために、別の調製物を用いました。培養液にpay cap 38を添加したところ、分子層における顆粒細胞の速度が79%減少し、時速2.5 micronsまで低下しました。内因性TPAの阻害剤であるPI oneを投与したところ、顆粒細胞の移動速度が対照群から78%減少し、1時間あたり4.2 micronsとなりました。このビデオを視聴することで、発達中のtheory balloonにおける細胞トラッキングの方法を十分に理解できるはずです。この手順を行う際は、細胞の移動とそれに続く発達に不可欠な、適切かつ一定の環境パラメータを提供することを忘れないでください。この手法により、神経科学分野の研究者が脳内の要因プロセスを探索する道が開かれました。

ex-vivo-imaging-postnatal-cerebellar-granule-cell-migration-using

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

我々は、マウスの前脳におけるニューロン移動のリアルタイムvideoimagingためのプロトコルを記述します。ウイルス標識又はグラフト神経前駆細胞の遊走は、固定と移動相の持続時間と速度を含む細胞遊走のさまざまなフェーズを、勉強するのは比較的急速な取得間隔と広視野蛍光イメージングを用いた急性スライスのライブで録音された移行。...

成体マウスの前脳の急性スライスにおける神経芽細胞の移行のタイムラプスイメージング

Source: Chan, U., et al., In vivo出生後のエレクトロポレーションを利用して、小脳顆粒ニューロンの形態とシナプスの発達を研究しています。 J. Vis. Exp.

異なる発生段階における小脳顆粒ニューロンのシナプス形成の可視化

出典:Bénard, M., et al. Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy.J. Vis. Exp. (2015)このビデオは、出生後のラット脳の小脳切片中の顆粒細胞のex...

共焦点マクロスコピーを用いた出生後小脳顆粒細胞遊走の Ex vivo イメージング

神経芽細胞の遊走は、出生後の神経発生における基本的なイベントです。我々は、in vivoでの出生後のエレクトロポレーションおよび急性脳スライスのタイムラプスイメージングを使用して、移行のその後の視覚化によって神経芽細胞の効率的な標識のためのプロトコルを記述します。私たちは、ビデオトラッキングによる神経芽細胞の動態を定量的に分析するための説明が含まれています。...

生体産後エレクトロポレーションおよびマウスの急性脳スライスにおける神経芽細胞移動のタイムラプスイメージング中

神経細胞の形態形成および移行が適切な脳の発達の基礎となる重要なイベントです。ここでは、遺伝的に培養した小脳顆粒ニューロンおよび形態や神経細胞の遊走特性の評価のための開発小脳を操作する方法を説明します。...

小脳顆粒ニューロンの遺伝子操作<em&gt;体外</em&gt;と<em&gt;インビボ</em&gt;ニューロンの形態と移行を研究するために、

小脳外顆粒層は、脳の発達で最大のトランジット増幅のサイトです。ここでは、胚の14日目のニワトリ胚からex vivoでエレクトロポレーションおよび小脳スライスの文化を使用して、増殖のピーク時にこの層に遺伝子改変をターゲットにするプロトコルを提示します。...

チック小脳スライスと顆粒細胞前駆体の空間的にターゲットを絞ったエレクトロポレーションの ex vivo培養

このプロトコルは、放射状に移動する皮質ニューロンの直接観察のための指示を提供する。 子宮内でのエレクトロポレーションでは、器官型スライス培養および時間経過共焦点画像化を組み合わせて、移動するニューロンにおける関心対象遺伝子の過剰発現または下方制御の影響を直接かつ動的に研究し、発生時のそれらの分化を分析する。...

胚性マウス脳の器官型スライス培養における移行ニューロンの経時的共焦点イメージング<em&gt;ウテロの</em&gt;エレクトロポレーション

ここでは、共焦点顕微鏡とライブ イメージング技術に適したマウス胚から electroporated...

Ex 子宮エレクトロポレーションと gaba 作動性介在ニューロンの移行のライブ イメージング用マウス萌芽期の脳の脊髄スライス培養

このプロトコルは、神経-神経膠血管構造の縦画像化、相互作用、および健康および疾患条件の両方における機能に使用できる慢性頭蓋窓移植技術を記述する。これは、多くの場合、好ましいが、いくつかの重大な制限を有する経頭蓋イメージングアプローチに対する補完的な代替手段として機能する。...

マウスにおける神経免疫ダイナミクスの反復インビボイメージングを行う正確な脳マッピング

ここでは、マウス小脳の顆粒ニューロンがシナプス構造を精緻化し、シナプスを形成して脳回路全体に集積する、生後脳の発達過程におけるシナプス形成を可視化する方法について述べる。...

in vivo生後エレクトロポレーションによる小脳顆粒ニューロンの形態とシナプス発生の研究

現在の方法は、容易に入手可能な遺伝的にコードされたカルシウム指標を使用して、カエノラブディティスエレガンスのin...

in vivoでの神経細胞カルシウムハンドリングの細胞内イメージング

学ぶ 生後小脳の顆粒細胞移動を共焦点マクロイメージングで可視化する方法。P10ラットの急性脳切片を用いて、神経細胞の動態と内因性因子の影響を詳細に観察できます。

共焦点肉眼検査を使用した生後小脳顆粒細胞の移動のex vivoイメージング

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